KR102346895B1 - Pdrn추출방법 - Google Patents

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KR102346895B1
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손중호
강철민
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주식회사 노아바이오텍
강철민
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Abstract

송어의 정소에 사람 융모 성선 자극 호르몬을 첨가하는 것으로 기존의 PDRN의 추출방법에 비하여 많은 양의 PDRN은 효과적으로 추출할 수 있는 PDRN추출방법을 개시한다.
본 발명은 성숙된 송어 수컷 개체에서 정액을 채취하는 단계; 상기 채취된 정액을 세척한 다음, 버퍼용액과 혼합하고 원심분리하여 상층액을 제거하는 것으로, 펠렛화된 정자세포를 추출하는 단계; 상기 펠렛화된 정자세포에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합하여 단백질 및 RNA를 제거하는 것으로 PDRN전구체를 제조하는 단계; 및 상기 PDRN전구체를 필터에 여과하고 유리에 흡착시켜 PDRN을 수득하는 단계를 포함하는 PDRN추출방법을 제공한다.

Description

PDRN추출방법{Method for PDRN extraction}
본 발명은 PDRN제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 송어의 정소에 사람 융모 성선 자극 호르몬을 첨가하는 것으로 기존의 PDRN의 추출방법에 비하여 많은 양의 PDRN은 효과적으로 추출할 수 있는 PDRN추출방법에 관한 것이다.
피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다.
최근 현대인들은 과도한 스트레스와 불규칙한 생활습관뿐만 아니라 환경오염, 유해물질의 노출 등에 의해 각종 질병들에 시달리고 있다. 이러한 질병을 만들어내는 원인 중 하나로, 활성산소의 중요성이 대두되고 있다. 생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화과정 중에 상당량의 활성산소들이 생산되며, 이들 활성산소는 생체내 제거 기작에 의해 대부분 소멸되게 된다. 하지만 자외선이나 흡연, 음주, 스트레스 등에 노출될 경우 활성산소가 과량으로 혹은 만성적으로 발생된다. 활성산소는 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하려는 성질을 가지고 있다. 과량의 활성산소는 체내 세포분자들을 공격하게 되어 손상된 세포들로 인해 각종 질병들이 발생하게 된다.
한편, 콜라겐은 피부 진피층에 존재하는데, 피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%를 차지하는 엘라스틴과 함께 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포 활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소되고, 여러 유해 환경에서의 스트레스 증가나 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외부 요인에 의하여 생합성이 감소되거나, 분해가 촉진되고 있다. 노화된 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 붕괴는 주로 MMP 단백질과 같은 그 분해 효소의 증가된 발현에 의해 야기된다.
한편, 사람의 피부색은 주로 피부 세포 속에 함유되어 있는 멜라닌(melanin) 색소의 양에 따라 크게 좌우된다. 멜라닌 색소가 많은 사람은 갈색 또는 검은색 피부를 갖는 반면, 멜라닌 색소가 극히 적은 사람은 백반증의 원인이 된다. 멜라닌 색소는 피부의 기저막에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)라는 색소 세포에서 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 티로신(tyrosine)으로부터 생성된다. 멜라닌 색소는 과도한 자외선으로부터 피부를 보호함으로써 관선에 의한 피부손상, 피부암의 발생을 억제하는 중요한 역할을 한다. 그러나 일광, 호르몬변화, 염증, 약제 등에 의해 멜라닌이 과다하게 생성되는 경우 피부의 색소가 침착되며, 이로 인해 미용상 여러 가지 문제를 야기한다.
일반적으로 알려진 미백 성분으로서, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), L-아스코르브산(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 있다. 이들은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능하다. 그러나 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적인 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.
(0001) 대한민국 등록특허 제10-2034982호 (0002) 대한민국 등록특허 제10-1722181호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 송어의 정소에 사람 융모 성선자극 호르몬(hCG)를 첨가하여 높은 효율로 PDRN의 추출이 가능한 PDRN추출방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 분리된 PDRN성분과 난소에서 분리된 난포액을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피부미백, 항산화, 주름개선 및 피부 재생 효과를 가지는 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 성숙된 송어 수컷 개체에서 정액을 채취하는 단계; 상기 채취된 정액을 세척한 다음, 버퍼용액과 혼합하고 원심분리하여 상층액을 제거하는 것으로, 펠렛화된 정자세포를 추출하는 단계; 상기 펠렛화된 정자세포에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합하여 단백질 및 RNA를 제거하는 것으로 PDRN전구체를 제조하는 단계; 및 상기 PDRN전구체를 필터에 여과하고 유리에 흡착시켜 PDRN을 수득하는 단계를 포함하는 PDRN추출방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 버퍼용액은 pH가 7~9인 5~15mM Tris-HCl 및 0.1~2mM EDTA의 조성을 가지며, 상기 용해 버퍼는 pH가 7~8인 30~60 mM Tris-HCl, 20~30mM EDTA, 300~400mM NaCl의 용액에 소듐도데실설페이트(SDS)를 0.2~1중량%혼합한 용액이며, 상기 PDRN전구체를 제조하는 단계는 정자세포에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합한 다음, 50~60℃의 온도에서 5~10시간동안 보관하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 성숙된 송어 수컷 개체에서 정액을 채취하는 단계는, 송어의 정소에서 정액을 분리하는 단계; 상기 정액이 분리된 정소를 인공정장액하에서 마쇄 및 희석하여 정소 희석액을 준비하는 단계; 상기 정소 희석액에 사람 융모 성선자극 호르몬을 25~200IU/g의 비율로 첨가하고 10~30분간 동안 보관하여 정소내의 미성숙된 정자를 활성화시키는 단계; 및 상기 활성화된 정자를 분리하여 상기 송어에서 분리된 정액애 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 송어의 난소를 채취한 다음, 세척하는 단계; 상기 세척된 난소에서 난포를 분리하는 단계; 상기 분리된 난포에 파파인 효소를 혼합하는 단계; 상기 파파인효소와 혼합된 난포에 인산염 화합물을 혼합하여 탈검하는 단계; 상기 탈검이 완료된 이후 염기성물질을 혼합하여 탈산하는 단계; 상기 탈산이 완료된 이후 산성백토를 혼합하고 정제하여 난포액을 수득하는 단계; 및 상기 추출방법으로 제조되는 PDRN과 상기 난포액을 혼합하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 제조방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 송어의 난소를 채취한 다음, 세척하는 단계는, 11~12월에 성숙된 송어중 암컷 개체를 선별하는 단계; 상기 선별된 암컷 개체의 복부를 절개하여 난소를 채취하는 단계; 및 상기 난소의 표면을 0.5~2중량%의 식염수로 세척하는 단계를 포함하며, 상기 세척된 난소에서 난포를 분리하는 단계는, 상기 세척된 난소표면의 막을 절개하여 난포를 노출시키는 단계; 및 상기 노출된 난포를 막과 분리한 다음, 0.7~1중량%의 식염수로 세척하여 이물질을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 분리된 난포에 파파인 효소를 혼합하는 단계는 상기 분리된 난포 100중량부 대비 3~10중량부의 파파인효소 및 50~200중량부의 물을 혼합하는 단계; 상기 파파인효소와 혼합된 난포를 50~60℃의 온도에서 5~10시간동안 보관하여 단백질을 분해하는 단계; 상기 단백질이 분해된 난포를 90~100℃로 1~3시간동안 가열하여 파파인 효소를 불활성화시키는 단계; 및 40~50㎛의 기공크기를 가지는 필터로 여과하여 추출물을 획득하는 단계를 포함하며, 상기 탈검하는 단계는 상기 추출물 100중량부 대비 0.01~0.2중량부의 인산염을 혼합하는 단계이며, 상기 탈산하는 단계는 상기 탈검된 추출물 100중량부 대비 2~5중량%의 수산화나트륨 수용액 80~120중량부를 혼합하는 단계이며; 상기 난포액을 수득하는 단계는, 상기 수산화나트륨이 혼합된 추출물 100중량부 대비 3~10중량부의 산성백토를 혼합하는 단계; 상기 산성백토가 혼합된 추출물을 90~110℃의 온도로 5~20분간 가열하는 단계; 및 상기 가열이 완료된 이후 40~50㎛의 기공크기를 가지는 필터로 여과하여 난포액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 난포액은, 마이크로캡슐화되어 상기 화장료 조성물에 혼합되며, 상기 마이크로캡슐은, 상기 제조된 난포액에 온도의존성 오일을 혼합하여 유화처리하는 단계; 및 피막물질이 용해된 피막용제에 상기 유화처리된 용액을 투입하여 상기 천연물질-나노입자와 상기 온도의존성 오일이 상기 피막물질에 피막되어 미세입자로 캡슐화되도록 처리하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되며, 상기 온도 의존성 오일은 코코넛 오일, 트리글리세리드류, 지방산, 또는 그 혼합물 중 어느 하나이고, 상기 피막물질은 메타크릴산계 물질, 셀락(Shellac)류, CAP(Cellulose acetate phthalate)류, PVAP(Polyvinyl acetate phtahalate)류, HPMCAS(Hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate)류 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다
본 발명의 실시예에 따르면, 송어의 정소에 hCG처리를 하는 것으로 기존의 방법에 비하여 효율적으로 PDRN을 추출이 가능하며, 이에 따라 PDRN의 추출량을 효율적으로 증가시킬 수 있는 PDRN추출방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은, 송어의 난포액을 포함함에 따라 난포액에 포함되어 있는 다종의 지방산 및 유효성분을 가지는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 난포액 이외에도 PDRN을 더 포함함에 따라 미백, 항산화뿐만 아니라, 주름 개선, 탄력 증진, 세포 재생 효과를 가지고 있다. 이에 따라, 화장료 조성물과 의약외품 조성물, 피부 외용제 조성물, 피부 색소 침착질환을 개선할 수 있는 조성물등으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 발명 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 실험결과를 나타낸 것으로 좌측도는 젤 전기영동으로 정액과 고환에서 추출된 고도로 중합된 DNA(Highly Polymerized DNA)를 확인한 결과(레인 1: DNA ladder, 레인 2, 레인 3: 정액(SEMEN)에서 추출된 PDRN, 레인 4, 레인 5: Testis(고환)에서 추출된 PDRN)이며, 우측도는 DNA 사슬을 일정 크기로 분절화하여 만든 저분자화된 DNA 중합체를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 PDRN의 시험, 검사 성적서이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 송어 난포액의 세포 독성을 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 티로시나아제 저해 활성을 통해, 송어 난포액의 미백 효과를 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 DPPH assay (활성산소) 소거효능 측정실험을 이용하여 송어 난포액의 항산화 효과를 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 PDRN의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 난포액(EGF)의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 PDRN과 EGF의 콜라겐 분해효소의 활성 저해 평가 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 PDRN과 EGF의 엘라스틴 분해효소의 활성 저해 평가 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 활성산소종 처리에 의해 증가된 MMP-1와 MMP-3의 발현을 PDRN이 억제하는 것을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 활성산소종 처리에 의해 감소된 콜라겐 유전자 발현을 PDRN이 증가시키는 것을 나타낸 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 PDRN과 EGF의 피부 세포 재생 효능을 비교한 결과이다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 다양한 실시 예를 보다 상세하게 설명한다. 본 명세서에 기재된 실시 예는 다양하게 변형될 수 있다. 특정한 실시예가 도면에서 묘사되고 상세한 설명에서 자세하게 설명될 수 있다. 그러나 첨부된 도면에 개시된 특정한 실시 예는 다양한 실시 예를 쉽게 이해하도록 하기 위한 것일 뿐이다. 따라서 첨부된 도면에 개시된 특정 실시 예에 의해 기술적 사상이 제한되는 것은 아니며, 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 균등물 또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 이러한 구성요소들은 상술한 용어에 의해 한정되지는 않는다. 상술한 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 명세서에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
한편, 본 명세서에서 사용되는 구성요소에 대한 "모듈" 또는 "부"는 적어도 하나의 기능 또는 동작을 수행한다. 그리고 "모듈" 또는 "부"는 하드웨어, 소프트웨어 또는 하드웨어와 소프트웨어의 조합에 의해 기능 또는 동작을 수행할 수 있다. 또한, 특정 하드웨어에서 수행되어야 하거나 적어도 하나의 프로세서에서 수행되는 "모듈" 또는 "부"를 제외한 복수의 "모듈들" 또는 복수의 "부들"은 적어도 하나의 모듈로 통합될 수도 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
그 밖에도, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우, 그에 대한 상세한 설명은 축약하거나 생략한다.
본 발명은 성숙된 송어 수컷 개체에서 정액을 채취하는 단계; 상기 채취된 정액을 세척한 다음, 버퍼용액과 혼합하고 원심분리하여 상층액을 제거하는 것으로, 펠렛화된 정자세포를 추출하는 단계; 상기 펠렛화된 정자세포에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합하여 단백질 및 RNA를 제거하는 것으로 PDRN전구체를 제조하는 단계; 및 상기 PDRN전구체를 필터에 여과하고 유리에 흡착시켜 PDRN을 수득하는 단계를 포함하는 PDRN추출방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "PDRN"은 폴리디옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide)를 지칭하는 것으로, 짧은 디옥시리보뉴클 레오타이드(short deoxyribonucleotide)의 혼합물(mixture)이다. 즉, DNA 사슬을 일정 크기로 분획화하여 만든 저분자량 DNA 중합체(Low molecular weight DNA complex)이다.
상기 PDRN은 인간의 태반, 송어 정자, 연어 정자 또는 기타 어류의 조직에서 추출될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 경우 송어의 정소에서 추출하는 것으로 후술할 난포액과 혼합되어 사용되는 경우에도 혼합에 의한 활성저하를 최소화할 수 있다.
상기 송어의 수컷은 상기 암컷에서 난소를 채취하는 과정과는 달리 배를 가르지 않고 채취하는 것이 가능하다. 이는 상기 송어의 정자와 난자의 크기에 따른 것으로 상기 난소내의 난포의 경우 직경이 3~5mm에 달하는 크기를 가짐에 따라 난소전체를 채취하는 것이 바람직하지만 상기 정자의 경우 현미경으로 관찰할 수 있는 크기를 가지게 되므로, 정소 전체를 채취하지 않더라도 손상없이 정자를 채취할 수 있다. 다만 상기 송어의 정소에는 성숙되어 배출되는 정자이외에 더 많은 양의 미성숙된 정원세포를 포함하고 있으므로 이를 사람 융모 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG)을 이용하여 재성숙시켜 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 hCG에 의한 자극으로 재성숙되는 정자의 경우 수정능력을 가지지 못할 수 있지만 성숙된 정자와 동일한 DNA를 포함하고 있으므로 상기 성숙된 정자와 혼합되어 PDRN의 제조에 용이하게 사용될 수 있다.
이를 위하여 상기 성숙된 송어 수컷 개체에서 정액을 채취하는 단계는, 송어의 정소에서 정액을 분리하는 단계; 상기 정액이 분리된 정소를 인공정장액하에서 마쇄 및 희석하여 정소 희석액을 준비하는 단계; 상기 정소 희석액에 사람 융모 성선자극 호르몬을 25~20IU/g의 비율로 첨가하고 10~30분간 동안 보관하여 정소내의 미성숙된 정자를 활성화시키는 단계; 및 상기 활성화된 정자를 분리하여 상기 송어에서 분리된 정액애 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 성숙된 송어 수컷 개체는 11~12월에 성숙어를 선별하여 체취하는 것이 바람직하다. 또한 상기 PDRN의 경우 생식세포의 핵에 존재하는 DNA를 가공한 것이므로 난포에서도 채취가 가능하지만, 난포의 경우 영양성분을 다량함유하고 있으므로, 상기 PDRN의 비율이 낮아 영양성분의 비율이 낮고 핵의 비율이 높은 정액에서 채취하는 것이 바람직하다.
상기 정액은 정소와 분리되어 사용될 수 있다. 이때 상기 정소의 내부에는 다량의 정액이 존재할 수 있지만, 미성숙된 정액 및 정원세포 역시 다량을 포함하게 된다. 이러한 미성숙된 정액 및 정원세포의 경우 정액에 포함되어 있는 정자와 동일한 DNA를 포함하고 있지만 아직 미성숙된 단계이므로 수정능력은 가지지 못한다. 하지만 본 발명의 PDRN의 경우 생식세포의 DNA를 이용하여 제조될 수 있으므로 이를 가공하여 사용하는 경우 상기 정액만을 이용하여 가공하는 경우에 비하여 높은 수율로 PDRN을 획득하는 것이 가능하다.
상기 정소희석액을 준비하는 단계는 상기 정액과 분리된 정소를 마쇄하고 하기의 정장(seminal plasma)을 사용하여 희석한다. 상기 마쇄의 과정은 정소를 가위로 잘게 자르면 정소의 정세포 등을 감싸고 있는 막을 벗겨 낼 수 있는데, 이 막을 벗겨낸 이후 세포의 손상을 방지하기 위하여 부드럽게 장갑을 낀 손으로 부드럽게 으깨는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
이때, 상기 정장(seminal　plasma)의 조성은 80mM NaCl, 40mM KCl, 1mM CaCl2, 20mM Tris-HCl로 이루어지며, 구체적으로 sodium (Na) 159.26±8.84mM, potassium (K) 33.72±2.01mM, chlorine (Cl) 133.04±5.96 mM, calcium (Ca) 1.68± 0.2 mM 및 magnesium (Mg) 0.988±0.13 mM을 포함할 수 있다(Hatef A, et. al., 2007. Aquaculture Research 38, 1175-1181 참조). 유기 성분은 총 단백질 0.75±0.14 mg/100mL, 콜레스테롤 2.86±0.58 mg/L 및 포도당 3.81±1.04 mM/L 일 수 있다.
상기 정자와 분리된 정소는 성숙정도가 다른 부분을 구분하여 분리함으로써 0.7% 이상의 정자 활성도를 나타내는 성숙도가 상대적으로 높은 부위인 것이 바람직하고, 상기 hCG 처리는 25-200IU/g을 첨가하는 것이 바람직하다. 이때 상기 hCG가 20IU/g미만으로 사용되는 경우 상기 미성숙된 정자의 활성화가 떨어져 PDRN을 추출량이 감소될 수 있으며, 200IU/g를 초과하는 비율로 첨가되는 경우 더 이상의 효과 증대는 없으면서 고가의 hCG를 사용함에 따라 비경제적이다.
본 발명에서 용어 hCG (human chorionic gonadotropin)는 사람 융모성 성선(性腺) 자극 호르몬으로, 임신부의 뇨에 섞여 나오는 호르몬이다.
상기와 같이 hCG처리를 통하여 미성숙된 정자를 활성화시킨 다음, 이를 분리하여 상기 채취된 정액에 혼합하여 사용할 수 있다. 이때 상기 활성화된 정자를 분리하는 방법은 원심분리법을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 정액은 이송을 위하여 액체질소를 이용한 급속 냉동을 수행할 수 있다. 상기 정액에 포함되어 있는 정자의 경우 상기 난자의 외피를 통과하기 위한 단백질 분해효소를 가지고 있으므로 장기간 실온에 보관하는 경우 쉽게 변질될 수 있다. 따라서 상기 채취된 정액은 가공시까지 냉동되어 보관되는 것이 바람직하며, 냉동에 의한 DNA손상을 방지하기 위하여 액체질소를 이용한 급속냉동을 수행하는 것이 바람직하다. 또흔 상기와 같이 급속 냉동된 정액은 -60℃이하 바람직하게는 -80℃에서 보관되는 것이 바람직하다.
상기와 같이 냉동된 정액은 생리식염수로 세척하여 혈액과 잔해물을 제거하는 것이 바람직하다. 상기 정액의 체취과정에서 상기 송어의 혈액이 혼입될 수 있으며, 어류의 구조상 정액을 제외한 분변이 혼입될 수 있으므로 이를 세척하여 제거하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 세척된 정액은 버퍼용액과 혼합될 수 있다. 상기 버퍼용액은 상기 버퍼용액은 pH가 7~9인 5~15mM Tris-HCl 및 0.1~2mM EDTA의 조성을 가지는 버퍼용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 상기 버퍼용액과 상기 정액의 혼합시 부피비는 2:1~4:1일 수 있으며, 바람직하게는 3:1의 부피비로 혼합될 수 있다. 이때 부피피다 2:1 미만인 경우 버퍼의 양이 충분하지 않아 정액에서 정자 펠렛을 분리하기 어려우며, 4:1을 초과하는 경우 많은 양의 버퍼용액을 사용하게되므로 비효율적이다.
상기와 같이 버퍼용액와 혼합된 정액은 원심분리를 통하여 상층액을 제거할 수 있다. 이때 상기 정자의 경우 상기 상층액과 분리되어 펠렛화되어 회수될 수 있으며 이에 따라 높은 비율로 PDRN의 추출이 가능하다. 이때 사용되는 원심분리기는 산업적으로 사용되는 원심분리기라면 제한없이 사용될 수 있다. 또한 상기 버퍼 용액 혼합과정 및 원심분리 과정은 2~5회 반복될 수 있다. 이 과정을 통하여 상기 정액에 포함되어 있는 정자를 제외한 다른성분들이 상기 버퍼용액과 혼합되어 제거될 수 있으며, 더욱 순수한 PDRN을 수득하는 것이 가능하다.
상기와 같이 펠렛화되어 회수된 정자세포는 분해과정을 거칠 수 있다. 이를 위하여 상기 펠렛화된 정자세포에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합하여 단백질 및 RNA를 제거하는 것으로 PDRN전구체를 제조할 수 있다. 상기 용해버퍼는 상기 정자 분해시 분해효소들이 용이하게 활동할 수 있도록 첨가되는 것으로 pH가 7~8인 30~60 mM Tris-HCl, 20~30mM EDTA, 300~400mM NaCl의 용액에 소듐도데실설페이트(SDS)를 0.2~1중량%혼합한 용액을 사용할 수 있다. 상기 범위내의 용해버퍼를 사용하는 경우 상기 정자의 분해과정이 용이하게 진행될 수 있지만, 상기 범위를 벗어나는 용해버퍼를 사용하는 경우 PDRN이 분해되어 효과가 떨어지거나 정자의 분해가 완료되지 못하여 PDRN의 함량이 떨어질 수 있다.
또한 상기 용해버퍼에는 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제를 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 프로테아제는 상기 정자의 단백질을 분해하는 것으로 상기 정자 내부에 위치하는 DNA를 용출시킬 수 있다. 이때 상기 프로테아제는 상기 버퍼용액에 3~10mg/ml의 비율로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 프로테아제가 3mg/ml미만의 비율로 포함되는 경우 상기 정자의 단백질 분해가 용이하지 않으며, 10mg/ml를 초과하는 비율로 포함되는 경우 고가의 프로테아제를 과량 사용함에 따라 비효율적이다.
상기 RNA분해효소는 정자의 핵속에 포함되어 있는 RNA를 분해하기 위하여 사용되는 것으로 RNA가 DNA와 혼합되어 분리되는 현상을 막는 역할을 수행할 수 있다. 이때 상기 RNA분해효소는 상기 버퍼용액에 3~10mg/ml의 비율로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 RNA분해효소가 3mg/ml미만의 비율로 포함되는 경우 상기 정자의 RNA 분해가 용이하지 않으며, 10mg/ml를 초과하는 비율로 포함되는 경우 고가의 RNA분해효소를 과량 사용함에 따라 비효율적이다.
상기와 같이 정자 펠렛에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합한 다음, 50~60℃의 온도에서 5~10시간동안 보관하여 각 효소의 반응을 수행할 수 있다. 이 과정에서 정자를 구성하고 있는 단백질이 분해되어 핵 내부의 물질이 외부로 용출될 수 있으며, RNA는 분해되어 뉴클레오티드상태로 존재할 수 있다. 이때 상기 온도 미만이거나 상기 시간 미만으로 보관하는 경우 정자의 분해가 불완전할 수 있으며, 상기 온도를 초과하는 온도에서는 상기 효소들의 활성이 떨어져 정자의 분해가 오히려 떨어질 수 있다. 도한 상기 시간을 초과하는 시간동안 보관하는 경우 고온으로 인하여 상기 PDRN전구체가 변질될 수 있다.
상기와 같이 제조된 PDRN전구체는 필터를 이용하여 여과될 수 있다. 이때 사용되는 필터는 상기 난포액 제조과정에서 사용된 필터와 동일한 필터를 사용할 수 있다.
상기와 같이 필터에 의한 여과가 완료된 이후 PDRN을 수집할 수 있다. 상기 PDRN의 수집은 상기 여과가 완료된 PDRN전구체를 원신분리하여 고형분을 수집하는 단계; 상기 고형분에 에탄올을 주입하여 세척하는 단계; 유리막대 또는 유리판의 표면에 PDRN을 흡착시켜 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 PDRN의 경우 DNA의 일종에 해당하므로 유리표면에 용이하게 흡착될 수 있다. 따라서 상기 PDRN전구체용액을 에탄올을 이용하여 세척한 다음, 상기 유리막대 또는 유리판을 침지하게되면 상기 유리막대 또는 유리판의 표면에 상기 PDRN이 응집되어 분리될 수 있다.
본 발명은 또한, 송어의 난소를 채취한 다음, 세척하는 단계; 상기 세척된 난소에서 난포를 분리하는 단계; 상기 분리된 난포에 파파인 효소를 혼합하는 단계; 상기 파파인효소와 혼합된 난포에 인산염 화합물을 혼합하여 탈검하는 단계; 상기 탈검이 완료된 이후 염기성물질을 혼합하여 탈산하는 단계; 상기 탈산이 완료된 이후 산성백토를 혼합하고 정제하여 난포액을 수득하는 단계; 및 상기 추출방법으로 제조되는 PDRN과 상기 난포액을 혼합하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 제조방법에 관한 것이다.
기존의 송어 관련 화장료의 경우 송어 정소에서 채취되는 PDRN을주재로 하여 제조되고 있다. 하하지만 이러한 PDRN을 주재로 하는 화장품의 경우 PDRN으로 인한 피부 재상효과는 뛰어날 수 있지만, 미백효과 또는 항산화 효과를 얻기는 어려워 각종 첨가물이 추가되어 사용되고 있다. 본 발명에서는 이러허한 미백효과 및 항산화효과를 가지는 성분을 송어의 난소에서 분리하여 사용하는 것으로 기존의 화장료에 비하여 각 성분간의 상성이 뛰어나며, 혼합에 의한 효능저하를 최소화할 수 있는 화장료 조성물 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 송어의 난소를 채취하는 단계는 성숙된 송어의 암컷에서 난소를 채취하여 이를 가공하는 단계이다.
이를 위하여 상기 송어의 난소를 채취한 다음, 세척하는 단계는, 11~12월에 성숙된 송어중 암컷 개체를 선별하는 단계; 상기 선별된 암컷 개체의 복부를 절개하여 난소를 채취하는 단계; 및 상기 난소의 표면을 0.5~2중량%의 식염수로 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로 송어는 11~12월에 난소 및 정소가 성숙하는 것으로 알려져 있으며, 이 시기에 산란을 수행할 수 있다. 따라서 11월 내지 12월에 성숙된 송어를 채집하는 경우 난소의 비율이 높으며 성숙도가 높은 난소의 채취가 가능할 것이다. 또한 상기 송어는 암컷과 수컷을 분리하는 것이 바람직하며, 상기 송어의 암컷의 경우 난소를 채취하여 난포액을 제조할 수 있으며, 수컷의 경우 정소를 채취하여 PDRN의 원료로 사용될 수 있다. 또한 송어의 경우 자연상태에서도 산란이 완료된 이후 폐사하게 되므로, 상기와 같이 난소 및 정소가 채취된 이후 식품용이나 사료용으로 가공되어 사용될 수 있다.
상기와 같이 채취된 난소 즉 송어의 알집은 채취시 표면에 체액이나 혈액이 남아 있을 수 있으므로, 이를 세척하는 것에 바람직하다. 이때 상기 세척에는 0.5~2중량%의 식염수를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 식염수의 경우 일반적인 생리식염수에 비하여 높은 비율의 소금을 포함하게 되는데 이러한 식염수를 사용하는 경우 삼투압작용에 의하여 상기 송어 난소 표면의 체액이 용이하게 제거될 수 있다. 또한 상기 송어 난소의 표면을 구성하는 알집이 탈수되어 단단해지므로 후술할 공정까지의 이송이 원활해질 수 있으며, 난소의 표면에 남아 있을 수 있는 미생물에 대한 살균효과도 기대할 수 있다. 이때 상기 식염수는 0.5~2중량%의 소금을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1.5중량%의 소금을 포함할 수 있다. 상기 식염수가 0.5중량% 미만의 소금을 포함하는 경우 상기 식염수에 의한 효과를 기대하기 어려우며, 2중량%를 초과하는 소금을 포함하는 경우 과도한 섬투압이 발생하여 유효성분까지 용출될 수 있다.
상기와 같이 세척이 완료된 난소는 표면의 알집이 제거되어 난포가 분리될 수 있다. 상기 난포는 상기 송어의 난자 즉 알을 의미하는 것으로 하나의 세포로 구성되어 있어 정자와 결합되어 수정되는 경우 송어 개체로 발생될 수 있는 부분이다. 상기 난포에는 난자를 구성하는 성분인 DNA를 비롯하여 단백질과 영양분으로 사용되는 다량의 지방산등이 포함될 수 있다. 본 발명의 경우 상기 단백질 및 지방산이 포함된 난포액을 사용하는 것으로 상기 화장료에 다량의 단백질 및 지방산을 유효성분으로서 포함시킬 수 있다.
상기 난소의 내부에는 상기 난포 이외에도 체액이나 혈액이 포함될 수 있으므로 상기 난포가 분리된 이후 이를 세척하여 사용하는 것이 바람직하다. 이때 상기 세척을 식염수를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 식염수는 0.7~1중량%의 소금을 포함할 수 있다. 상기 난포의 세척이 상기 난소의 세척과 같이 높은 염도를 가지는 식염수를 사용하는 경우 상기 난포 내부의 수분이 용출되면서 유효성분까지 용출될 수 있으므로 상기 난포의 세척에는 생리식염수와 유사한 농도의 식염수를 사용할 수 있다. 상기 식염수의 농도가 0.7중량% 미만인 경우 세척이 난포 내부로 수분이 유입되어 난포가 터져 내용물이 유출될 수 있으며, 1중량%를 초과하는 소금을 포함하는 경우 난포 내부의 수분이 용출되어 난포가 수축될 수 있다.
또한 상기 난포는 외피에 둘러싸여 있을 뿐만 아니라 구형을 유지하기 위하여 콜라겐과 같은 구조단백질을 포함하고 있으므로, 이러한 구조 단백질을 제거하는 것이 바람직하다. 또한 상기 난포에 포함되는 단백질의 경우 고분자를 구성하고 있으므로 이를 아미노산으로 분리하여 상기 난포액이 포함시키는 것이 바람직하다. 따라서 상기 난포에 단백질 분해효소를 혼합하는 것으로 상기 외피 및 구조단백질 등을 분해하는 것이 바람직하다. 이대 사용하는 단백질분해효소는 단백질분해효과가 뛰어나며, 인체에 해를 주지 않는 파파인을 사용하는 것이 바람직하다.
이를 위하여 상기 분리된 난포에 파파인 효소를 혼합하는 단계는 상기 분리된 난포 100중량부 대비 3~10중량부의 파파인효소 및 50~200중량부의 물을 혼합하는 단계; 상기 파파인효소와 혼합된 난포를 50~60℃의 온도에서 5~10시간동안 보관하여 단백질을 분해하는 단계; 상기 단백질이 분해된 난포를 90~100℃로 1~3시간동안 가열하여 파파인 효소를 불활성화시키는 단계; 및 40~50㎛의 기공크기를 가지는 필터로 여과하여 추출물을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 파파인은 단백질 분해효소의 일종으로, 파파야에 포함되어 있어 과일의 내부로 침입하는 해충을 막는 역할을 수행할 수 있다. 이를 이용하여 상기 파파야즙을 연육제로서 사용하는 것도 가능하며, 본 발명에서는 상기 파파야에서 분리된 파파인을 상기 난포의 단백질을 분해하는 단백질 분해효소로서 사용할 수 있다.
상기 분리된 난포의 단백질 분해를 위하여 상기 파파인효소와 혼합될 수 있다. 이때 상기 100중량부 대비 3~10중량부의 파파인효소 및 50~200중량부의 물을 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 파파인효소가 3중량부 미만으로 혼합되는 경우 상기 난포의 단백질 분해가 어려울 수 있으며, 10중량부를 초과하여 포함하는 경우 과도한 단백질 분해로 인하여 유효성분이 분해되어 효과가 떨어질 수 있다. 또한 상기 물은 상기 난포와 산기 단백질 분해효소의 혼합을 이용하게 하기 위하여 첨가되는 것으로 50중량부 미만으로 혼합되는 경우 상기 파파인 효소가 고르게 분산되지 못할 수 있으며, 200중량부를 초과하는 경우 제조되는 난포액의 농도가 낮아져 효과가 떨어질 수 있다.
상기와 같이 파파인효소와 혼합된 난포는 50~60℃의 온도에서 5~10시간동안 보관하여 단백질을 분해할 수 있다. 이는 상기 파파인 효소의 활성을 높이기 위하여 수행되는 것으로 50℃미만의 온도 또는 5시간 미만동안 보관하는 경우 단백질 분해가 원활하지 않으며, 60℃를 초과하는 온도에서는 파파인효소의 활성이 떨어질 수 있다. 또한 10시간 이상 보관하는 경우 더 이상의 효과가 없어 비경제적이다.
상기와 같이 파파인에 의한 단백질 분해가 완료되면 상기 난포의 외피가 분해되어 난포 내부의 성분이 용출될 수 있다. 또한 이 과정에서 난포 내부의 구조단백질이 분해되어 상기 물과 용이하게 혼합되며, 난포 내부의 단백질 역시 아미노산으로 분해되어 물과 혼합될 수 있다. 즉 상기 단백질 분해과정을 거친 이후 난포의 단백질은 대부분 아미노산으로 분해되어 물과 혼합되며, 난포 내부의 영양성분인 지방산 역시 용출되어 물과 혼합될 수 있다.
상기와 같이 단백질 분해가 완료된 이후 상기 파파인을 불활성화 시키는 것이 바람직하다. 상기 파파인의 경우 단백질을 지속적으로 분해할 수 있으므로, 본 발명의 난포액에 포함되는 단백질 및 아미노산을 과도하게 분해하여 효과를 떨어트릴 수 있을 뿐만 아니라 이를 사용한 화장료에 포함되는 경우 피부의 단백질을 분해하여 피부에 자극을 줄 수 있다. 따라서 상기 파파인을 불활성화 하여 단백질 및 아미노산의 과도한 분해를 막음과 동시에 피부의 자극을 줄일 수 있다.
이를 위하여 상기 단백질이 분해된 난포를 90~100℃로 1~3시간동안 가열하여 파파인 효소를 불활성화시킬 수 있다. 상기 파파인 효소의 경우 고온에서 불활성화되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 상기 단백질이 분해된 난포를 가열하는 경우 상기 파파인 효소를 용이하게 불활성화시킬 수 있다. 이때 상기 온도가 90℃미만이거나 1시간 미만으로 가열하는 경우 상기 파파인 효소의 불활성화가 완전하지 않을 수 있으며, 100℃를 초과하는 온도 또는 3시간을 초과하는 시간동안 가열하는 경우 상기 난포액에서 추출된 아미노산과 지방산이 열변성될 수 있다.
상기와 같이 가열하여 파파인을 불활성화시킨 다음, 불순물을 제거하기 위하여 40~50㎛의 기공크기를 가지는 필터로 여과하여 추출물을 획득할 수 있다. 상기 파파인을 이용하여 단백질을 분해하였지만 미 분해된 난포의 외피 및 상기 난포의 구성성분의 일부는 상기 추출물에 부유물 형태로 존재할 수 있다. 또한 상기 파파인에 의하여 부해되지 못한 단백질의 경우 상기 파파인을 불활성화하는 과정에서 열에 의하여 경화되어 부유물이 될 수 있다. 따라서 상기 파파인을 불활성화한 다음 이 추출물을 여과하여 상기 부유물을 제거하는 것이 바람직하다. 이때 상기 필터는 40~50㎛의 기공크기를 가지는 것이 바람직하다. 상기 기공의 크기가 40㎛미만인 경우 필터의 여과속도가 느려져 비효율적이며, 50㎛를 초과하는 경우에는 상기 부유물이 여과되지 않아 불순물이 늘어날 수 있다.
상기와 같이 부유물을 분리한 추출물에 인산염화합물을 혼합하여 탈검할 수 있다. 상기 탈검은 상기 난포에 포함되어 있는 콜라겐과 같은 구조단백질을 제거하는 단계로 인산염화합물을 첨가하는 경우 상기 구조 단백질이 응집되어 겔(Gel) 또는 검(Gum)을 형성하게 되므로 이를 용이하게 분리할 수 있다. 이때 사용되는 인산염화합물은 인산을 포함하는 화합물이라면 제한없이 사용될 수 있지만, 단백질 결착제로 널리 사용되는 인산나트륨을 사용할 수 있다.
상기 인산염 화합물은 상기 추출물 100중량부 대비 0.01~0.2중량부가 포함될 수 있다. 상기 인산염화합물이 0.01중량부 미만으로 포함되는 경우 상기 인산염에 의한 응집효과가 나타나지 않을 수 있으며, 0.2중량부를 초과하여 포함되는 경우 아미노산이 응집되거나 분산성을 나타낼 수 있어 난포액의 분리가 어려울 수 있다.
상기와 같이 인산염화합물을 혼합하여 구조단백질을 갤화시킨 다음, 염기성 물질을 첨가하여 탈산과정을 수행할 수 있다. 상기 탈산과정에서 상기 인산염 화합물 및 지방산의 용출로 인한 산성을 중화할 수 있으며, 용출된 유효성분에 금속염 작용기를 첨가하여 물에 용이하게 용해될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 또한 이과정에서 유리지방산이 제거될 수 있다. 상기 수산화나트륨을 이용하여 유리지방산을 중화시키게 되면, 지방산 나트륨에 형성될 수 있으며, 이 지방산나트륨은 색소를 비롯한 불순물을 강하게 흡착할 수 있다. 이때 사용되는 염기성물질은 수산화나트륨을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 탈검된 추출물 100중량부 대비 2~5중량%의 수산화나트륨 수용액 80~120중량부를 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 수산화나트륨이 2중량%미만의 농도를 가지거나 80중량부 미만으로 사용되는 경우 탈산효과를 기대하기 어려우며, 5중량%를 초과하는 농도 또는 120중량부를 초과하는 비율로 첨가되는 경우 과도한 수산화나트륨으로 인하여 화장료의 사용시 피부에 자극을 줄 수 있다.
상기와 같이 탈산 처리가 완료된 이후 산성백토를 첨가하여 상기 난포액에서 불순물을 제거할 수 있다. 상기 산성백토는 유문암 또는 응회암이 변질되어 생기는 점토의 일종으로 일명 벤토나이트라고 불린다. 이러한 산성백토는 높은 활성과 흡착력을 가지고 있으므로 상기 난포액에 혼합하는 경우 산성백토의 흡착력으로 인하여 탈수, 탈색 및 탈취효과를 나타낼 수 있다.
상기와 같이 산성백토가 혼합되어 불순물을 분리한 다음, 상기 부유물의 제거할 때 사용한 필터와 동일한 필터를 시용하여 여과하는 것으로 산성백토 및 응집된 불순물을 제거할 수 있다.
상기와 같이 추출된 난포액은 그대로 화장료에 포함되거나 분말화되어 화장료에 포함될 수 있지만 본 발명의 경우 송어의 정소에서 채취한 PDRN과 혼합되어 사용될 수 있다. 다만 본 발명의 난포액은 잔류하는 파파인 성분에 의하여 상기 PDRN 또는 송어 정소 추출물이 분해되거나 변질될 수 있으며, 상기 난포액 자체도 외부에 노출되는 경우 변질될 수 있으므로, 상기 난포액을 마이크로 캡슐화하여 사용하는 것이 바람직하다.
이를 위하여 상기 마이크로캡슐은, 상기 제조된 난포액에 온도의존성 오일을 혼합하여 유화처리하는 단계; 및 피막물질이 용해된 피막용제에 상기 유화처리된 용액을 투입하여 상기 천연물질-나노입자와 상기 온도의존성 오일이 상기 피막물질에 피막되어 미세입자로 캡슐화되도록 처리하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 난포액에 온도의존성 오일을 혼합하여 유화처리할 수 있다. 이때 상기 온도 의존성 오일은 코코넛 오일, 트리글리세리드류, 지방산, 또는 그 혼합물 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 코코넛 오일일 수 있다.
온도 의존성 오일은 유화제로 적용된 것으로서 바람직하게는 체온부근 또는 유효성분을 방출하여야 하는 부위에서 액상으로 녹거나 인체의 움직임에따라 파괴되면서 효과적으로 약물 즉 천연추출물을 방출할 수 있는 온도 감응성 오일이 적용된다.
상기 코코넛 오일은 필리핀, 인도네시아, 말레이시아 등 널리 열대지방의 해안에 자생하는 야자나무 열매의 핵에서 채취되는 지 방으로 일명 코프라 오일(copra oil)이라고도 하며 녹는점은 23 내지 28℃이고, C10, C12, C14의 포화지방산으로 이루어져 있다. 또한, 상기 코코넛 오일은 다나산(dynasan), 위텝졸(witepsol) 또는 콤프리톨(compritol)과 같은 준중합 지질(semisynthetic lipid)과 비교하여 더 높은 생분해성과 낮은 생체 내 독성을 가지고 있다.
또 다르게는 상기 온도 의존성 오일은 상온에서는 고상이지만 체온 부근 또는 그 이상의 온도에서는 녹아서 액상이 되는 트리글 리세리드류, 지방산, 또는 그 혼합물이 적용될 수 있다. 여기서 트리글리세리드류로는 트리카프린(녹는점 31℃트리라우린(녹는점 46℃트리미리스틴(녹는점 57℃을 단독 또는 혼합한 것이 적용될 수 있다. 또한, 지방산류는 카프린산(녹는점 31 내지 33℃라우린산(녹는점 44℃내지 45℃미리스틴산(녹는점 54 내지 55℃을 단독 또는 혼합한 것이 적용될 수 있다.
다음은 이러한 난포액과 온도 의존성 오일이 혼합된 용액을 유화되도록 하기 위한 유화처리를 수행할 수 있다. 상기 유화처리는 진동, 교반, 초음파 처리 등에 의해 수행될 수 있다.
상기 유화처리가 완료된 다음, 피막물질이 용해된 피막용제를 상기 유화처리된 용액에 투입하여 상기 난포액과 상기 온도의존성 오일이 상기 피막물질에 피막되어 미세입자로 캡슐화되도록 처리하여, 마이크로 캡슐을 제조할 수 있다. 상기 피막물질은 바람직하게는 보관조건에서는 고형상으로 존재하여 보관하는 동안 입자의 물리적인 안정성을 증가시키고, 입자내에 함유된 약물의 화학적인 안정성을 증대시키며, 체온부근 또는 약물을 방출하여야 하는 부위에서 액상으로 녹고나 인체의 움직임에 따라 파괴되어 효과적으로 약물을 방출할 수 있는 산도 감응성 물질이 적용될 수 있다.
상기 피막물질은 메타크릴산계 물질, 셀락(Shellac)류, CAP(Cellulose acetate phthalate)류, PVAP(Polyvinyl acetate phtahalate)류, HPMCAS(Hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate)류 중 적어도 어느 하나를 함유한 것이며 바람직하게는 메타크릴산계 물질인 유드라지트를 사용할 수 있다.
유드라지트는 독일의 디구사(Degusssa)에서 제조하여 판매되는 것으로 메타크릴산(Methacrylic Acid)과 에틸 아크릴산 (Ethyl Acrylate)이 상호 소정 비율로 공중합된 물질이다. 일 예로서, 유드라지트L100-55는 메타크릴산(Methacrylic Acid)과 에틸 아크릴산(Ethyl Acrylate)이 1:1로 공중합된 물질로서 산도 PH 5.5에서 녹는 특성을 갖고 있다. 그 밖에도 산도에 감응성을 나타내는 유드라지트계열로서 유드라지트E는 산도5에서 녹고, 유드라지트L은 산도 6에서 녹으며, 유드라지트S는 산도 7에서 녹는 특성을 갖고 있다.
상기 피막물질은 상기 피막용제의 용매에 대해 1.5wt% 내지 3.0wt%의 농도가 되도록 첨가될 수 있다. 상기 피막물질이 1.5wt%미만으로 포함되는 경우 마이크로 캡슐의 피막 생성이 어려울 수 있으며, 3.0wt%를 초과하는 농도로 포함되는 경우 마이크로 캡슐이 피막이 두꺼워져 사용자의 움직임에 따라 마이크로캡슐의 파괴가 수행되지 않을 수 있다.
아울러 상기 피막용제는 알코올 더욱 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.
이후 상기 피막물질이 상기 유화용액내에서 균일하게 분산될 수 있도록 분산처리할 수 있다. 상기 분산처리는 피막물질이 유화용액을 포획하여 마이크로입자 크기로 균일하게 캡슐화할 수 있도록 처리하는 것으로 초음파처리, 교반, 진동 등과 같은 방법에 의해 처리할 수 있다. 이를 통하여 상기 피막물질은 마이크로 캡슐을 형성하며, 상기 마이크로 캡슐의 내부에는 난포액이 포함될 수 있다.
상기 온도 의존성 오일 : 난포액 : 피막물질의 무게비는 9:1:4인 것이 바람직하다. 상기 비율에서는 적절한 마이크로 캡슐의 생성이 가능하지만 상기 비를 벗어나는 경우 마이크로 캡슐의 생성이 용이하지 않을 수 있다.
또한 상기 난포액은 송어 정소에서 채취환 PDRN 과 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 제조방법으로 제조되는 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 송어에서 분리된 난포액 및 정액에서 분리된 PDRN이외에도 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 또는 피부 세포 재생을 유도하거나 이러한 효과를 가질 수 있는 다양한 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 미백용 화장료 조성물은 유효성분인 송어에서 분리된 난포액 이외에, 피부 미백 효과를 상승 또는 보강시킬 수 있도록 피부 미백 효과가 있다고 알려진 화합물이나 천연 추출물을 포함할 수 있다. 여기서 미백 효과가 있다고 공지된 화합물이나 천연 추출물로서는 멀캅토숙신산, 멀캅토덱스트란, 테프레논, 디하이드록시-이소퀴놀린, 인도메타신, 3-하이드록시마뉼, 비타민 K, 티아졸리돈, 키누레닌, 레몬 추출물, 오이 추출물, 오디 추출물, 로즈마리 추출물, 아세로라 추출물, 체리 추출물, 은행 추출물, 제라늄(geranium) 추출물 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 미백용 화장료 조성물에 있어서, 그 유효성분은 피부 미백 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.99 중량 % 범위 내에서 포함될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 미백 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
또한 이 경우 상기 송어 난포액은 1 내지 15 중량%, PDRN은 0.05 내지 5 중량% 포함될 수 있다. 상기 범위 미만으로 포함되는 경우 상기 난포액 및 PDRN으로 인한 효과를 기대하기 어려우며, 상기 범위를 초고하여 포함되는 경우 상기 화장품 제형 내에서 응집되거나 일부 성분이 상분리되는 불량이 발생할 수 있다.
본 발명의 미백용 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 구체적으로, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 미백용 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 난포액 및 PDRN의 피부 흡수를 용이하게 하도록 스피큘을 포함할 수 있다.
상기 스피큘은 하이드롤라이즈드 해면으로 불리는 것으로 해면의 침골만을 분리 정제하여 제조되는 성분이다. 이러한 스피큘은 침상형 구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 표면에 많은 기공을 가지고 있으므로, 이 기공을 이용하여 유효성분의 캐리어로서 사용될 수 있다.
또한 상기 스피큘은 그 크기에 따라 메가스클레레스(Megascleres)와 마이크로스클레레스(Microscleres)로 두 가지로 구분되며, 메가스클레 레스(Megascleres)는 60-2,000㎛의 크기로 육안으로 구분 가능하며, 마이크로스클레레스(Microscleres)는 10- 60㎛의 크기로 현미경을 이용해서 관찰이 가능하다. 본 발명에서는 50~60㎛의 크기를 가지는 마이크로 클래스 스피큘을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 상기 스피큘의 크기가 50㎛미만인 경우 공극률이 떨어져 유효성분의 전달능력이 떨어질 수 있으며, 60㎛를 초과하는 경우 피부에 자극을 줄 수 있다.
특히 본 발명의 스피큘은 침상형의 구조를 가짐에 따라 피부에 도포할 때 도포하는 압력에 의하여 각질층뿐만 아니라 표피층도 자극할 수 있으며, 이러한 자극은 한방침과 같은 역할을 수행하여 피부의 혈행을 개선시킬 수 있다. 이러한 자극에 의한 혈행개선의 경우 피부의 재생을 촉지시키는 역할을 수행하는 것이 가능하다.
또한 기존의 스피큘은 염산과 같은 강산 및 강염기를 이용하여 침골을 제외한 유기물 부분을 분리하였지만 이 경우 높은 생산성을 가지는 반면 다공부에 잔류하는 강산 및 강염기로 인하여 피부에 자극을 줄 수 있다는 단점을 가지고 있다. 따라서 본 발명에서는 상기 강산과 강염기 대신 천연물질에서 얻을 수 있는 산과 염기를 이용하여 상기 스피큘을 분리하는 것이 바람직하다.
이를 위하여 상기 스피큘은, (i) 채취된 해면을 세척한 다음, 함수율이 10중량%미만이 되도록 건조하는 단계; (ii) 상기 건조된 해면을 90~100℃의 물에 10~40분간 침지하여 가열하는 단계; (iii) 상기 가열이 완료된 해면을 pH2~4의 산성 용액에 10~20일간 침지하는 단계; (iv) 상기 산성 용액과 상기 해면의 고형분을 분리한 다음, 상기 고형분을 물로 2~5회 반복하여 세척하는 단계; (v) 상기 세척이 완료된 고형분을 물에 침지한 다음 초음파를 이용하여 세척하는 단계; (vi) 상기 초음파 세척이 완료된 다음, 상기 해면을 pH8~10의 염기성 용액에 1~5일간 침지하는 단계; (vii) 상기 염기성 용액과 고형분을 분리한 다음, 상기 고형분을 물로 2~5회 반복하여 세척하는 단계; 및 (viii) 상기 세척이 완료된 고형분을 물에 침지한 다음 초음파를 이용하여 세척하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 (i)단계는 채취된 해면을 세척한 다음, 함수율이 10중량%미만이 되도록 건조하는 단계로 상기 해명의 표면에 존재하는 이물질을 세척한 다음, 이를 건조하는 단계이다. 이때 상기 해면의 경우 함수율이 10중량%미만, 바람직하게는 7중량%미만이 되도록 건조될 수 있다. 이러한 건조를 통하여 상시 해면의 표면에 존재하는 점액성분이 더욱 쉽게 제거될 수 있으며 또한 상기와 같은 건조과정에서 해면에 포함된 유기성분의 분해 및 조직의 파괴가 일어나 이후에 있을 과정이 더욱 용이하게 진행될 수 있다.
상기 (ii)단계는 상기 건조된 해면을 90~100℃의 물에 10~40분간 침지하여 가열하는 단계로 상기 건조된 해면을 가열하여 단백질 성분의 변성을 촉진하는 것으로 침골을 제외한 단백질 성분의 분리를 용이하게 하는 단계이다. 일반적으로 동물은 무기질의 골격을 제외하고 나머지 부분의 대부분은 단백질로 구성되어 있다. 이 단백질의 경우 상기 골격을 연결한느 역할을 수행하므로 매우 단단한 조직으로 구성되어 있지만 이를 가열하는 경우 단백질이 변성되어 상기 골격과 분리되기 쉽게 변할 수 있다. 이를 이용하여 본 발명의 경우 상기 건조된 해면을 90~100℃의 물, 즉 끓는 물에 침지하는 것으로 단백질의 변성을 유발하여 단백질의 분리가 용이하도록 할 수 있다. 이때 상기 침지시간이 10분 미만인 경우 상기 단백질의 분리가 어려울 수 있으며, 40분을 초과하여 침지하는 경우 분해된 단백질이 상기 침골의 공급부에 흡착될 수 있다.
상기 (iii)단계는 상기 가열이 완료된 해면을 pH2~4의 산성 용액에 10~20일간 침지하는 단계로, 상기 가열이 완료된 해면에 존재하는 유기물을 산을 이용하여 제거하는 단계이다. 일반적으로 유기물은 산과 접촉하는 경우 그 분해속도가 가속화되어 제거될 수 있다. 하지만 기존의 스피큘 제작방법에서는 주로 염산을 이용하여 이를 제거하였지만, 이는 스피큘의 다공부에 염산이 잔류하여 피부자극을 줄 수 있다는 문제점을 가질 수 있다. 따라서 본 발명에서는 레몬즙, 유자즙, 당유자즙, 오랜지즙 및 식초와 같은 천연 산성물질을 이용하여 상기 스피큘을 제조하는 것이 바람직하다. 즉 상기 가열이 완료된 해면은 상기 레몬즙, 유자즙, 당유자즙, 오랜지즙 및 식초에 침지될 수 있다. 이때 상기 침지 기간이 10일 미만인 경우 상기 유기물의 제거가 아려울 수 있으며 20일을 초과하는 경우 상기 침골이 산에 의하여 분해될 가능성이 있다. 또흔 상기와 같이 산을 이용하여 유기물을 제거하는 경우 상기 침골의 일부가 용해되어 상기 침골의 다공성이 더욱 높아질 수 있다. 또한 상기 산성 용액이 pH2 미만인 경우 강한상성으로 인하여 침골이 분해되거나 잔류된 산성용액으로 인하여 피부에 자극을 줄 수 있으며, pH4를 초과하는 경우 상기와 같은 유기물의 분해가 어려울 수 있다.
상기 (iii)단계가 완료된 이후 (iv) 상기 산성 용액과 상기 해면의 고형분을 분리한 다음, 상기 고형분을 물로 2~5회 반복하여 세척하는 단계를 거칠 수 있다. 상기 산성용액에 의하여 상기 침골과 유기성분은 분리될 수 있으며, 상기 유기성분의 대부분은 상기 상성용액에 용해된 상태로 변할 수 있다. 따라서 상기와 같기 고형분을 분리하는 경우 상기 고형분은 대부분 상기 침골로 구성될 수 있으며, 이를 수차례 세척하여 다음단계를 수행할 수 있다.
상기 (v)단계는 (v) 상기 세척이 완료된 고형분을 물에 침지한 다음 초음파를 이용하여 세척하는 단계로, 상기 침골에 부착되어 있는 유기물을 비롯한 이물질을 초음파를 이용하여 제거하는 단계이다.
이때 상기 초음파는 물속에서 더욱 잘 전달되므로, 상기 초음파의 원활한 전달을 위하여 상기 고형분은 물에 침지될 수 있다. 또한 상기 초음파는 20~130kHz의 진동수를 가질 수 있으며, 상기 진동수 범위에서만 상기와 같은 세척의 수행이 가능하다.
상기 (vi)단계는 상기 초음파 세척이 완료된 다음, 상기 해면을 pH8~10의 염기성 용액에 1~5일간 침지하는 단계로 초음파 세척이 완료된 고형분을 염기성 용액에 침지하여 세척하는 단계이다. 상기 산성용액 침지과정을 통하여 대부분의 유기물이 제거될 수 있지만, 최종적으로 유기물을 제거하기 위하여 염기성용액을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 염기성 용액의 경우 상기 해면의 단백질을 용이하게 분해하는 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라 상기 스피큘의 다공부에 존재하는 산성용액을 중화시킬 수도 있다.
이때 기존에 사용되는 염기성 용액의 경우 사용상의 편의를 위하여 강염기 즉 수산화나트륨 또는 수산화 칼륨을 사용하였지만, 이 경우 잔류된 염기성 용액으로 인하여 피부에 자극을 줄 수 있다. 따라서 본 발명의 경우 탄산칼슘을 이용한 염기성용액을 제조하여 이를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 본 발명의 스피큘의 경우 피부에 접촉하여 사용될 수 있으므로, 상기 탄산칼슘역시 공업적으로 합성된 제품이 아닌 조개패각을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있다.
이를 상세히 살펴보면 상기 염기성 용액은 조개 패각을 분리한 다음, 세척하는 단계; 상기 세척된 조개 패각을 800~1200℃의 온도에서 소성하는 단계; 상기 소성이 완료된 조개 패각을 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 조개 패각을 조개 패각 100중량부 대비 1000~5000중량부의 물과 혼합한 다음, 2~10일간 방치하는 단계; 및 상기 조개 패각의 고형분을 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 용액일 수 있다.
상기 조개의 패각은 다량의 탄산칼슘을 주성분으로 구성되어 있으며, 대부분은 폐기물로 처리되고 있다. 따라서 이러한 조개패각에서 탄산칼슘을 추출하여 사용하는 경우 원하는 효과를 발휘하면서도 자원 재활용 환경보호 등에 일조할 수 있다. 상기 조개패각은 세척되고 유기물이 제거된 다음, 800~1200℃의 온도에서 소성될 수 있다. 이를 통하여 상기 조개패각에 존재하는 유기물을 비록한 기타 불순물이 산화되어 제거될 수 있으며, 탄산칼슘만 남이 있을 수 있다. 이때 상기 소성온도가 800℃미만인 경우 원활한 소성이 이루어지지 않을 수 있으며, 1200℃를 초과하는 경우에는 에너지 사용량이 늘어날 뿐만 아니라 소성에 의하여 탄산칼슘이 분해되어 수율이 떨어질 수 있다.
상기와 같이 소성이 완료된 다음, 이를 분쇄할 수 있으며, 100중량부 대비 1000~5000중량부의 물과 혼합한 다음, 2~10일간 방치하여 탄산칼슘 수용액을 제조할 수 있다. 이때 물이 1000중량부 미만으로 사용되는 경우 제조되는 수용액의 양이 줄어들어 효율이 감소될 수 있으며, 5000중량부를 초과하는 물을 사용하는 경우 탄산칼슘의 농도가 낮아져 탄산칼슘에 의한 효과를 기대할 수 없다.
상기와 같이 제조된 염기성용액에 상기 초음파 세척이 완료된 고형분을 투입하여 1~5일간 침지할 수 있다. 이때 1일 미만으로 침지하는 경우 염기성 용액으로 인한 효과를 기대하기 어려우며, 5일을 초과하여 투입하는 경우 더 이상의 효과는 없으면서 제조효율이 감소하게 된다.
상기와 같이 염기성용액에 의한 세척이 완료되면 산기 산성용액에 의한 세척 이후 단계와 동일하게 초음파 세척 및 수세단계를 거쳐 스피큘의 제작이 가능하다.
상기와 같이 제조된 스피큘은 다른 원료와 혼합되기 이전 상기 세라마이드 특히 화학식 1 구조를 가지는 피토스핑고신과 혼합될 수 있다. 이를 통하여 상기 스피큘의 다공부에 세라마이드 성분이 흡착될 수 있으며, 이응 다른 성분보다 상기 세라마이드 성분을 우선적으로 두피의 각질층 아래쪽으로 전달할 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
상기 스피큘은 전체 화장료 조성물 100중량부 대비 0.2~1.5중량부가 포함될 수 있다. 상기 스피큘의 함량이 0.2중량부 미만인 경우 스피큘에 의한 효과를 기대하기 어려우며, 1.5중량부를 초과하는 경우 상기 스피큘에 의한 피부 자극이 강해져 피부에 염증이나 가려움증 같은 트러블이 발생할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 송어에서 분리된 난포액을 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 색소 침착 질환은 피부 색소 침착 질환으로, 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 또는 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 송어에서 분리된 난포액 및 PDRN을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구적, 비경구적으로 투여될 수 있지만, 통상적으로 외용제 제형으로 피부에 국소적으로 직접 투여될 수 있다.
또 본 발명의 약학적 조성물은 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS) 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 1일 투여량은 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어지는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 송어에서 분리된 난포액을 유효성분으로 포함하는 미백용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터 충진제로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 송어에서 분리된 난포액을 유효성분으로 포함하는 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "외용제"는 외용으로 제공되는 제제이고, 외용산제, 외용정제, 외용액제, 연고제, 경고제, 좌제 등이 있으며, 본 발명의 피부 외용제는 특히 피부 외용에 작용하는 제제는 제한 없이 포함한다.
본 발명에 따른 피부 외용제는 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 제제화된 비경구 투여제일 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패치, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 외용제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
각 제형에 의한 피부 외용제 조성물은 본 발명의 송어에서 분리된 난포액 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.
본 발명의 피부 외용제 조성물은 총 조성물의 중량 대비 유효성분을 0.0001 내지 30%(w/v)로 포함할 수 있다. 만약, 0.0001 %(w/v) 미만으로 포함되면, 피부의 미백 효과를 실질적으로 기대할 수 없다. 반면, 30 %(w/v)을 초과하며 포함할 경우에는 용제로의 용해성 등 조성물의 전체적인 가공성이 떨어져 제형 등 각종 용도로의 사용이 제한될 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
송어 난포액 추출
송어 알에 붙어 있는 혈액이나 이물질을 증류수로 2~3번 세척한 후, 알을 0.2cm 이하 크기로 세절하였다. 이후 세절된 알에 파파인 효소 5%(w/v)를 처리한 후 밤새 55℃에서 반응시켰다. 이 후 95℃에서 2시간 반응시켜 효소를 불활성화시켰다. 이후, 0.45μm 여과지로 여과하여 1차 추출물을 획득하였다.
이후, 1차 추출물에 0.1% 인산염(phosphate)를 처리하여 탈검한 후 70℃의 DW로 세척하였으며, 세척된 1차 추출물에 2.5% NaOH를 1:1(v/w)의 비율로 처리하여 탈산 과정을 거친 후 다시 70℃DW로 세척하였다.
상기 탈산 과정을 거친 후 세척된 추출물에 5%(w/v)의 산성 백토를 처리하여 탈수, 탈색, 탈취과정을 거친 후 100℃에서 교반 가열하여 2차 정제된 추출물을 획득하였다. 상기 2차 정제된 추출물에 0.45μm 여과지를 이용하거나 감압 여과를 실시하여 정제된 송어 난포액을 수득하였다.
상기 제조된 정제 송어 난포액의 지방산 조성은 표 1과 같다.
지방산 종류 평균함량(중량%) 표준편차
Myristic acid 1.55 0.34
Myristoleic acid 0.02 0.01
Pentadecanoic acid 0.22 0.03
Palmitic acid 7.38 0.88
Palmitoleic acid 2.06 0.25
Heptadecanoic acid 0.31 0.04
cis-10-heptadecanoic acid 0.16 0.03
Stearic acid 1.85 0.21
Elaidic acid 0.07 0.01
Oleic acid 4.34 0.98
Linoleic acid 1.25 0.23
Arachidic acid 0.08 0.01
c-linolenic acid 0.15 0.02
Eicosenoic acid 0.27 0.09
a-linolenic acid 1.33 0.29
cis-11,14-eicosadienoic acid 1.09 0.23
Behenic acid 0.03 0.01
Homo-c-linolenic acid 0.11 0.02
Erucic acid 0.06 0.02
Eicosatrienoic acid 0.16 0.03
Arachidonic acid 2.47 0.28
cis-13,16-docosadienoic acid 0.42 0.11
Eicosapentaenoic acid 2.81 0.34
Nervonic acid 0.18 0.02
Docosapentaenoic acid 0.64 0.07
Docosahexaenoic acid 5.59 0.70
omega-3 지방산 14.10 0.33
omega-6 지방산 5.32 0.18
포화지방산 15.51 0.19
단일 불포화 지방산 9.17 0.42
다중 불포화 지방산 21.30 0.28
총합 100 6.65
실시예 2 송어 정액에서 PDRN 추출
2.1. 정액(semen)에서 정자 세포 분리
정액은 번식계절인 11~12월에 성숙어를 선별하여 복부마사지를 통하여 채정하였다,
상기 채정이 완료된 이후 성숙어의 정소를 채취하고, 채취된 정소를 손을 이용하여 마쇄하였으며, 정장액을 이용하여 희석하였다.
이때, 상기 정장액의 조성은 80mM NaCl, 40mM KCl, 1mM CaCl2, 20mM Tris-HCl로 이루어지며, 구체적으로 sodium (Na) 159.26±8.84mM, potassium (K) 33.72±2.01mM, chlorine (Cl) 133.04±5.96 mM, calcium (Ca) 1.68± 0.2 mM 및 magnesium (Mg) 0.988±0.13 mM을 포함할 수 있다(Hatef A, et. al., 2007. Aquaculture Research 38, 1175-1181 참조). 유기 성분은 총 단백질 0.75±0.14 mg/100mL, 콜레스테롤 2.86±0.58 mg/L 및 포도당 3.81±1.04 mM/L이다.
상기와 같이 정장액에 희석된 정소 마쇄물에 사람 융모성 성선 자극 호르몬 100IU/g를 첨가한 다음 30분동안 30℃의 온도에서 보관하여 미성숙된 정소의 세포를 인위적으로 정자로 성성숙시켰다.
상기 인위적으로 성숙된 정자를 원심분리기를 이용하여 분리한 다음, 상기 채취된 정액과 혼합하여 사용하였다.
상기 혼합된 정액을, 50ml Falcon 튜브에 분주한 후 즉시 액체질소로 급속 동결을(-196℃실시한 후 실험실로 가져와 -80℃초저온 냉동고에 보관하였다가 PDRN을 추출하는데 사용하였다. 냉동된 정액 덩어리는 생리식염수로 씻어 혈액과 잔해물(debris)을 제거한 후, 3X 볼륨 TE 버퍼 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH 8.0)를 추가하고 실온(약 21℃에서 1500g에서 15 분간 원심분리(centrifuge)한 후 상층액을 제거하였다. 다시 3X 볼륨 TE 버퍼를 추가하고 실온(약 21℃에서 1500g에서 15 분간 원심분리(centrifuge)하였다. 이후 상층액을 제거하고 남은 펠렛화 된 정자 세포를 취하였고, 이를 새로운 15 mL의 코니컬 튜브에 옮겨담았다.
2.2. 정자 세포 용해물 제조
상기 2.1에서 얻은 정자 펠렛(pellet)에 용해(lysis) 버퍼를 1:100(w/v)의 비율로 혼합하였다.
용해 버퍼 (pH 7.5)의 조성은 아래와 같다.
Tris-HCl (pH 8.0, 50mM)
EDTA (pH 8.0, 25mM)
NaCl (350mM)
SDS (0.5 %)
다음으로, 정자 펠렛(pellet)에 Protease K + RNase A (10mg/ml)을 추가하고, 세포 용해물을 밤새 55 ℃에서 반응시켜 핵산 이외에 단백질과 RNA를 제거하였다.
2.3. 정자 세포 용해물에서 DNA 분리
상기 2.2에서 배양한 세포 용해물을 23℃로 식혔다. 이후, 정자 세포 용해물을 필터(autoclaved cheese clothes)로 여과하여 DNA fibers를 수집하였다. 이 후, 10,000×g에서 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 버렸다. 이후 시료 대비 2~2.5배 볼륨의 차가운 에탄올(95%)을 넣고 1 시간 동안 냉장 보관하였다. 유리 막대를 사용하여 DNA를 수집하고 차가운 에탄올(70%)로 두 번 세척하였다. 에탄올을 증발시키고 장기 보존을 위해 DNA를 TE 버퍼를 이용하여 액상 저장하거나 또는 동결 건조하였다.
2.4. 품질 검사 (Gel 전기 영동 및 UV 흡수에 의한 결정)
추출된 DNA는 0.4 % agarose gel로 확인하였다. 순수한 이중 가닥 DNA는 OD260에서 1.0와 OD260/OD280에서 1.8을 가진다. 단백질로 오염되면 OD260/OD280 값이 1.8보다 훨씬 낮고, RNA로 오염되면 비율이 1.8보다 커진다.
본 발명에서 송어 정자에서 추출된 DNA의 특징을 확인해 본 결과 아래 표 1과 같다. 따라서, 송어 정자에서 비교적 순수한 DNA가 추출된 것을 알 수 있었다. 또한, 추출된 DNA의 전기영동 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1의 좌측도는 젤 전기영동으로 정액과 고환에서 추출된 고도로 중합된 DNA(Highly Polymerized DNA)를 확인한 결과이다. 레인 1: DNA ladder, 레인 2, 레인 3: 정액(SEMEN)에서 추출된 PDRN, 레인 4, 레인 5: Testis(고환)에서 추출된 PDRN을 나타낸다. 또한, 도 1의 우측도는 DNA 사슬을 일정 크기로 세절하여 만든 저분자화된 DNA 중합체를 나타낸다.
Controls Specifications Results
Appearance of Solution S (1.0% (w/v) in water) Clear Complies
Absorbance at 600nm of the S solution A600nm≤ 0.010 0.002
Absorbance ratio 260nm/280nm 1.6 to 2.0 1.78
Ribonucleic acid ≤3.0% 0.6%
Protein ≤1.0% 0.5%
Sodium 4.5~5.5% 2.1%
Calcium ≤ 500ppm 60 ppm
Magnesium ≤ 500ppm 5 ppm
Sulfate ≤ 0.3% 0.2%
Loss on Drying ≤ 13% 8.1%
Microbiological Quality: Bacteria ≤ 100CFU/g 0 CFU/g
제조예 1 PDRN과 난포액을 포함하는 크림 제조
실시예 1에서 제조된 송어 난포액과 PDRN을 포함하는 크림을 제조하였다.
먼저, 정제수에 Carbopol 940, Sodium Hyaluronate을 아지믹서를 이용하여 75-80℃에서 5분간 교반하였다. 이후 정제수와 Glycerin을 추가하고 호모믹서를 이용하여 75-80℃에서 5분간 교반하였다. 다음으로, Bees wax, Montanov L, GCC 300kc(INCI Name: Caprylic/Capric Triglyceride), CEH 100kc(INCI Name: Cetyl Ethylhexanoate)을 추가하고 호모믹서를 이용하여 75-80℃에서 5분간 교반하였다. 이후, 정제수, L-Arginine을 추가하고 호모믹서를 이용하여 75-80℃에서 교반한 후, 냉각장치를 이용하여 냉각하였다. 다음으로 1,2-헥산다이올, 송어 난포액, PDRN을 추가하고 호모믹서를 이용하여 50℃에서 5분간 교반하였다. 이후 냉각장치를 이용하여 냉각하여, 크림 제형을 완성하였다.
성분 함량(중량%)
정제수 38.67
Glycerin 8.00
정제수 30.00
Carbopol 940 0.40
Sodium Hyaluronate 0.03
Bees wax 1.00
Montanov L 2.50
GCC 300kc 3.00
CEH 100kc 3.00
정제수 3.00
L-Arginine 0.40
1,2-헥산다이올 2.00
송어알(정제 난포액) 7.00
PDRN 1.00
총합 100.00
실험예 1 송어 난포액의 세포독성 분석
상기 실시예 1에서 분리된 송어 난포액이 섬유아세포(fibroblast)에 독성이 있는지를 확인하였다. 섬유아세포로 NIH3T3 세포를 사용하였다. 상기 NIH3T3 세포를 10,000개/ml가 되도록 분주한 후, 송어 난포액을 1μL, 5μL, 10μL 처리하고, 섬유아 세포의 성장을 억제하는 지를 확인하였다.
도 3은 송어 난포액의 세포 독성을 평가한 결과이다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 송어 난포액을 1μL, 5μL 처리시 섬유아 세포의 성장을 촉진하였다. 그러나 10μL 처리시 세포의 증식을 억제하거나 사멸을 유발하여 고농도에서는 독성이 있는 것을 확인하였다.
실험예 2
송어 난포액의 미백 활성 확인 분석
상기 실시예 1에서 분리된 송어 난포액의 미백 효과를 티로시나아제 효소 활성 저해 시험을 이용하여 평가하였다. NIH3T3 세포를 10,000개/ml가 되도록 분주한 후, 송어 난포액을 1μL~50μL 처리하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 용해 버퍼(lysis buffer)를 이용해 세포를 용해시킨 후, 원심분리하여 단백질 상등액을 분리하였다. 공시료액은 0.1M 인산염 완충액(phosphate buffer, pH 6.5)을 사용하였다.
96 웰 플레이트에 0.1M 인산염 완충액(phosphate buffer, pH 6.5) 220㎕, 단백질 상등액 20㎕, 1,500U/㎖ 티로시나아제 20㎕, 1.5mM L-tyrosine 40㎕을 혼합하였고 37℃에서 10분간 반응시킨 후 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 활성저해률은 아래 수식으로 환산하였다.
티로시나아제 활성저해율(%)=100-(b-b'/a-a')*100
a : 공시료액의 반응 후의 흡광도
b : 시료액의 반응 후의 흡광도
a', b' : 티로시나제 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도
도 4는 티로시나아제 저해 활성을 통해, 송어 난포액의 미백 효과를 평가한 결과이다. 송어 난포액의 농도를 1μL에서 50μL로 농도가 증가할수록 OD 값이 증가하였다. 측정된 OD값을 이용하여 티로시나아제 활성저해율(%)을 위 식을 이용하여 계산하였다. 그 결과, 송어 난포액의 농도가 증가할수록 티로시나아제 저해 활성율(%)이 증가하여 미백활성이 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 3
송어 난포액의 항산화 활성
상기 실시예 1에서 분리된 송어 난포액의 항산화 효과를 DPPH assay (활성산소) 소거효능 측정실험을 이용하여 평가하였다. DPPH radical 저해 효과는 상기 송어 난포액 시료 0.5 mL을 DMSO에 녹여 준비하였고, DPPH 용액은 95% 에탄올에 녹여 120μM이 되게 하였다. 난포액 추출물 10μL와 DPPH용액 195μL를 혼합하여 vortex한 후 15분 동안 빛이 통하지 않게 하여 실온에 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5는 DPPH assay (활성산소) 소거효능 측정실험을 이용하여 송어 난포액의 항산화 효과를 평가한 결과이다. 그 결과, 송어 난포액의 농도가 5μL (S1), 10μL (S2), 50μL (S3)로 증가할수록 항산화 활성이 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 4
PDRN에 대한 화장품 조성으로 적합성 시험 검사
상기 실시예 2에서 분리된 PDRN이 화장품 조성으로 사용하기에 적합한 지를 판별하기 위하여, 수은, 납, 비소, 안티몬, 카드뮴, 니켈 등 중금속을 비롯한 유독성 원소를 포함하는 지를 확인하였다. 검사는 객관성과 공정성을 위하여, 순천향대학교에 의뢰하였다. 도 2는 PDRN의 시험검사 성적서이다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 수은, 납, 비소, 안티몬, 카드륨, 니켈 등의 중금속을 포함하지 않아, 화장품 조성으로 사용하기 적합한 것을 알 수 있었다.
실험예 5
PDRN의 세포독성 평가
인간피부각질형성 세포인 HaCaT 세포와 인간진피섬유아 세포인 HDF-1 세포는 피부 주름 연구에 널리 사용되는 세포들이다. 상기 두 종류의 세포를 이용하여, PDRN과 EGF를 농도별로 처리하고 세포독성을 평가하였다.
도 6은 PDRN의 세포독성을 평가한 결과이다. 도 7은 EGF의 세포독성을 평가한 결과이다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, PDRN을 0.01~100㎍/ml 처리해도 HaCaT 세포와 HDF-1 세포에 독성이 없는 것을 확인하였다. 마찬가지로, EGF를 0.01~100㎍/ml 처리해도 이들 피부 세포에 독성이 없는 것을 확인하였다.
실험예 6
PDRN의 콜라겐 분해효소 활성 저해 평가
PDRN 및 EGF가 피부 진피내에 존재하며 피부 노화를 촉진하는 콜라겐 분해효소(collagenase)의 활성을 억제하는 지를 평가하고자 하였다. 이를 위해, 50~200㎍/ml의 PDRN과 50~200㎍/ml의 EGF를 처리하여 콜라겐 분해효소의 활성을 평가하였다.
도 8은 PDRN과 EGF의 콜라겐 분해효소의 활성 저해 평가 결과이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 양성대조군으로 사용된 EGCG(Epigallocatechin gallate)는 약 33%의 콜라겐 분해효소 저해능을 나타낸 반면, PDRN과 EGF는 모든 농도에서 콜라겐 분해효소 억제능이 없는 것을 확인하였다.
실험예 7
PDRN의 엘라스틴 분해효소 활성 저해 평가
다음으로, PDRN 및 EGF가 피부 진피 내에 존재하며 피부 노화를 촉진하는 것으로 알려진 엘라스틴 분해효소(elastase)의 활성을 억제하는지를 평가하고자 하였다. 이를 위해, 50~200㎍/ml의 PDRN과 50~200㎍/ml의 EGF를 처리하여 엘라스틴 분해효소의 활성을 평가하였다.
도 9는 PDRN과 EGF의 엘라스틴 분해효소의 활성 저해 평가 결과이다. 도 9에 나타난 바와 같이, PDRN을 200μg/ml 처리하였을 때 엘라스틴 분해효소의 활성이 대조군에 비해 12% 억제되는 것을 확인하였다. 그러나, EGF 처리군에서는 모든 농도에서 엘라스틴 분해효소 저해능이 나타나지 않았다.
반면 양성대조군으로 사용된 EGCG(Epigallocatechin gallate) 처리시, 엘라스틴 분해효소의 활성이 약 34% 억제되는 것을 확인하였다.
실험예 8
PDRN의 피부 노화 관련 유전자 발현 평가
외인성 노화인 광노화는 자외선에 의해 발생되며, 피부로 흡수된 자외선은 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS) 유발을 통해 MMPs(Matrix metalloproteinases)의 활성을 증가시키고 콜라겐 합성을 감소시켜 노화를 가속화시키는 것으로 알려져 있다. PDRN이 콜라겐 구조를 절단하거나 분해시켜 주름을 형성하는 것으로 알려진 MMP-1 및 MMP-3의 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
도 10은 활성산소종 처리에 의해 증가된 MMP-1와 MMP-3의 발현을 PDRN이 억제하는 것을 나타낸 것이다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, PDRN이 H2O2에 의해 증가된 MMP-1과 MMP-3의 발현을 억제하는 것을 RT-PCR을 통해 확인하였으며, 양성대조군으로 사용된 EGCG(Epigallocatechin gallate) 역시 MMP-1과 MMP-3의 발현을 억제하는 것을 확인하였다.
또한, PDRN이 피부 탄력을 유지시키는 콜라겐 유전자(COL-1A1 및 COL3A1)의 발현 변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 도 11은 활성산소종 처리에 의해 감소된 콜라겐 유전자 발현을 PDRN이 증가시키는 것을 나타낸 결과이다. 그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, PDRN이 EGCG 및 EGF와 마찬가지로, H2O2에 감소된 콜라겐 유전자들의 발현을 증가시키는 것을 RT-PCR을 통해 확인하였다.
결론적으로, PDRN은 활성산소종으로 유도된 MMPs 발현을 억제함으로써, MMPs가 콜라겐을 분해하는 과정을 억제하여 피부 주름을 억제하고 피부 탄력을 개선하는 등 피부 노화방지 효능을 가진다는 것을 알 수 있었다.
실험예 9
PDRN의 세포 재생 효능 평가
PDRN이 피부 재생에 효능이 있는지 확인하기 위하여 인간피부각질형성 세포인 HaCaT cells을 이용하여 세포 재생 효능 평가(wound heling assay)를 수행하였다.
도 12는 PDRN과 EGF의 피부 세포 재생 효능을 비교한 결과이다. 그 결과, PDRN 및 EGF 두 가지 물질 모두 시간이 경과할수록 피부 세포의 증식과 이동을 촉진시키는 것을 확인하였다. 이에 따라, 시간이 경과할수록 wound의 폭은 감소하였다. PDRN 및 EGF의 세포 재생능력을 비교 평가한 결과, PDRN은 8시간 이전에 EGF보다 세포의 증식과 이동을 더 많이 촉진시킨 반면 EGF는 8시간 이후에 세포의 증식과 이동을 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안 될 것이다.

Claims (7)

  1. 송어의 난소를 채취한 다음, 세척하는 단계;
    상기 세척된 난소에서 난포를 분리하는 단계;
    상기 분리된 난포에 파파인 효소를 혼합하는 단계;
    상기 파파인효소와 혼합된 난포에 인산염 화합물을 혼합하여 탈검하는 단계;
    상기 탈검이 완료된 이후 염기성물질을 혼합하여 탈산하는 단계;
    상기 탈산이 완료된 이후 산성백토를 혼합하고 정제하여 난포액을 수득하는 단계; 및
    PDRN과 상기 난포액을 혼합하는 단계;
    를 포함하는 화장료 조성물 제조방법에 있어서,
    상기 PDRN은,
    성숙된 송어 수컷 개체에서 정액을 채취하는 단계;
    상기 채취된 정액을 세척한 다음, 버퍼용액과 혼합하고 원심분리하여 상층액을 제거하는 것으로, 펠렛화된 정자세포를 추출하는 단계;
    상기 펠렛화된 정자세포에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합하여 단백질 및 RNA를 제거하는 것으로 PDRN전구체를 제조하는 단계; 및
    상기 PDRN전구체를 필터에 여과하고 유리에 흡착시켜 PDRN을 수득하는 단계;
    를 포함하는 화장료 조성물 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 버퍼용액은 pH가 7~9인 5~15mM Tris-HCl 및 0.1~2mM EDTA의 조성을 가지며
    상기 용해 버퍼는 pH가 7~8인 30~60 mM Tris-HCl, 20~30mM EDTA, 300~400mM NaCl의 용액에 소듐도데실설페이트(SDS)를 0.2~1중량%혼합한 용액이며,
    상기 PDRN전구체를 제조하는 단계는 정자세포에 용해 버퍼, 프로테아제 및 RNA분해효소(RNase)를 혼합한 다음, 50~60℃의 온도에서 5~10시간동안 보관하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 성숙된 송어 수컷 개체에서 정액을 채취하는 단계는,
    송어의 정소에서 정액을 분리하는 단계;
    상기 정액이 분리된 정소를 인공정장액하에서 마쇄 및 희석하여 정소 희석액을 준비하는 단계;
    상기 정소 희석액에 사람 융모 성선자극 호르몬을 25~200IU/g의 비율로 첨가하고 10~30분간 동안 보관하여 정소내의 미성숙된 정자를 활성화시키는 단계; 및
    상기 활성화된 정자를 분리하여 상기 송어에서 분리된 정액에 혼합하는 단계;
    를 포함하는 화장료 조성물 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 송어의 난소를 채취한 다음, 세척하는 단계는,
    11~12월에 성숙된 송어중 암컷 개체를 선별하는 단계;
    상기 선별된 암컷 개체의 복부를 절개하여 난소를 채취하는 단계; 및
    상기 난소의 표면을 0.5~2중량%의 식염수로 세척하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 세척된 난소에서 난포를 분리하는 단계는,
    상기 세척된 난소표면의 막을 절개하여 난포를 노출시키는 단계; 및
    상기 노출된 난포를 막과 분리한 다음, 0.7~1중량%의 식염수로 세척하여 이물질을 제거하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 난포에 파파인 효소를 혼합하는 단계는
    상기 분리된 난포 100중량부 대비 3~10중량부의 파파인효소 및 50~200중량부의 물을 혼합하는 단계;
    상기 파파인효소와 혼합된 난포를 50~60℃의 온도에서 5~10시간동안 보관하여 단백질을 분해하는 단계;
    상기 단백질이 분해된 난포를 90~100℃로 1~3시간동안 가열하여 파파인 효소를 불활성화시키는 단계; 및
    40~50㎛의 기공크기를 가지는 필터로 여과하여 추출물을 획득하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 탈검하는 단계는 상기 추출물 100중량부 대비 0.01~0.2중량부의 인산염을 혼합하는 단계이며,
    상기 탈산하는 단계는 상기 탈검된 추출물 100중량부 대비 2~5중량%의 수산화나트륨 수용액 80~120중량부를 혼합하는 단계이며;
    상기 난포액을 수득하는 단계는,
    상기 수산화나트륨이 혼합된 추출물 100중량부 대비 3~10중량부의 산성백토를 혼합하는 단계;
    상기 산성백토가 혼합된 추출물을 90~110℃의 온도로 5~20분간 가열하는 단계; 및
    상기 가열이 완료된 이후 40~50㎛의 기공크기를 가지는 필터로 여과하여 난포액을 수득하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 난포액은,
    마이크로캡슐화되어 상기 화장료 조성물에 혼합되며,
    상기 마이크로캡슐은,
    상기 제조된 난포액에 온도의존성 오일을 혼합하여 유화처리하는 단계; 및
    피막물질이 용해된 피막용제에 상기 유화처리된 용액을 투입하여 상기 난포액과 상기 온도의존성 오일이 상기 피막물질에 피막되어 미세입자로 캡슐화되도록 처리하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되며,
    상기 온도 의존성 오일은 코코넛 오일, 트리글리세리드류, 지방산, 또는 그 혼합물 중 어느 하나이고, 상기 피막물질은 메타크릴산계 물질, 셀락(Shellac)류, CAP(Cellulose acetate phthalate)류, PVAP(Polyvinyl acetate phtahalate)류, HPMCAS(Hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate)류 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물 제조방법.
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