CN106265977B

CN106265977B - 牡丹籽提取物及制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂

Info

Publication number: CN106265977B
Application number: CN201510305135.3A
Authority: CN
Inventors: 郑春颖; 方兆华; 陈明华; 张佳伟; 沈忠海; 黄晓青
Original assignee: Jialan Group Co ltd
Current assignee: Shanghai Natural Hall Group Co ltd
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2035-06-04
Also published as: CN106265977A

Abstract

本发明公开了一种牡丹籽提取物及制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂。本发明公开的制备方法包括：方法1、将粉碎后的牡丹籽与60～80％的乙醇水溶液混合均匀，在10～30℃下提取0.5～2小时，固液分离后得滤液，除去溶剂得牡丹籽粗提物；方法2、将方法1的牡丹籽粗提物，上样到大孔树脂柱，依次用去离子水、10～25％的乙醇水溶液、30～45％的乙醇水溶液、50～65％的乙醇水溶液、70～85％的乙醇水溶液和95％以上的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，相应地得到各洗脱部位。本发明的牡丹籽提取物具有美白、抗氧化和抗老化的功效，有良好的市场应用前景。

Description

牡丹籽提取物及制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂

技术领域

本发明具体涉及一种牡丹籽提取物及制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂。

背景技术

1956 年Harman提出了自由基衰老学说[Harman, D. Aging: A theory based onfree radical and radiation chemistry. J. Gerontol. 1956, 11:289-300.]，认为过多的自由基是造成生物老化的重要原因。根据这一理论，体内过量的活性氧自由基与不饱和脂肪酸作用产生丙二醛等物质，丙二醛将与细胞膜上的蛋白质等作用生产褐色素，沉淀于皮肤便成为各种色斑。过量的自由基还能使皮肤内的胶原纤维、弹性纤维发生交联和变性、变脆、失去弹性，当皮肤水分不足时，容易使弹性纤维断裂，出现暗纹、细纹、皱纹等皮肤老化现象。此外，环境中的离子辐射以及诸如空气污染与化学物质等的环境污染物，也会使生物体内不断的产生自由基。例如环境中的紫外线会使皮肤真皮中的纤维母细胞及粒线体受到刺激，进而释放出超氧阴离子，而过量的超氧阴离子则会转换成其它破坏性更强的自由基。虽然人体内具有能够维持氧化与抗氧化之间平衡状态的抗氧化防御系统，用以减缓活性氧及自由基的产生，但若是长期过度的曝晒在阳光下，则人体内大量产生的自由基会导致皮肤的抗氧化防御能力降低，造成皮肤的伤害，例如光老化、表皮皱纹、皮肤免疫力失调等。抗氧剂是具有捕捉自由基能力的物质，可以清除皮肤中的活性自由基，减轻自由基引起的皮肤氧化应激损伤，从而改善由氧化应激等造成的皮肤老化。目前已知有维生素E、维生素C等生物体内的清除自由基型抗氧化剂，另外也报道了植物来源的抗氧化剂如莲花、梅果提取物等。

关于皮肤黑色素的形成，目前研究表明主要是由于黑素细胞内的生物化学反应引起，即酪氨酸在作为催化剂的酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，再通过酶的催化作用或非酶的氧化作用形成黑色素。关于抑制上述黑色素生成的美白活性物，通常以抑制酪氨酸酶活性为主要靶点。来源于植物提取物的酪氨酸酶抑制剂作为潜在的美白活性物，同时又具有安全性和对皮肤低刺激性的预期。

皮肤老化的原因可以分为光老化和内因引起的老化，UV暴露引起的光老化会引起皮肤弹性蛋白酶的活性增加。弹性蛋白酶（Elastase）分布于多种组织和细胞中，弹性蛋白酶活性增加可导致皮肤弹性纤维的水解，从而加速真皮内胶原蛋白和弹性蛋白的分解，使皮肤失去弹性，出现皱纹等皮肤老化现象。目前已知有植物来源的抗老化活性物具有弹性蛋白酶抑制作用，如蓼蓝、香豌豆等。

牡丹籽是毛茛科（Ranuculaceae）芍药属（Paeonia L.）植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）的种子。牡丹有“花中之王”的美誉，牡丹根皮部位是一味著名的中药——丹皮，具有清热凉血、活血散瘀的作用。牡丹籽在民间常用于治疗腰腿疼痛，具有抗氧化、消炎止痛作用，目前牡丹籽多用于育种，作为潜在的药用资源，有待深入开发利用。根据文献报道，牡丹籽中含有齐墩果酸、常春藤皂甙元、山奈酚、木犀草素、芹菜素、柯伊利素、反式葡根素、顺式葡根素、反式白藜芦醇、β-谷甾醇、豆甾醇和β-胡萝卜苷等化学成分（易军鹏等，牡丹籽的化学成分研究，天然产物研究与开发，2009，21：604-607.）。此外，牡丹籽是一种良好的油料资源，含油率在30%左右。从牡丹籽中提取的牡丹籽油中共有17种脂肪酸成分，主要为亚麻酸、油酸、亚油酸等，不饱和脂肪酸占83.05%，饱和脂肪酸占14.33%。而亚油酸和亚麻酸，这是两种对人体健康特别重要的必需脂肪酸，亚油酸有抑制胆固醇的合成，调节血压等功能，同时也是重要日用化工原料、亚麻酸具有降血脂、将胆固醇和促进代谢、肝细胞再生及增强免疫、抗过敏反应、延缓衰老等作用（《牡丹籽油化学成分GC-MS分析》戚军超、周海梅、马锦琦等，2005年第11期，第22~23页）。此外，牡丹籽提取物具有抑菌效果，对枯草杆菌、沙门氏菌、根霉菌、黑曲霉菌和巴氏杆菌有一定抑菌作用。到目前为止，还没有发现牡丹籽提取物用于化妆品中，并具有美白、抗老化等作用的报道。

来源于天然植物的具有抗氧化清除自由基、抑制酪氨酸酶和弹性蛋白酶活性作用的美白、抗老化物质具有安全性高，成本低廉等优点，正日渐得到护肤产业的重视。因此，本领域亟需一种天然来源的酪氨酸酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂和抗氧化剂，同时可用作美白、抗老化妆品的功效添加剂。

发明内容

本发明创新性的发现了牡丹籽具有美白、抗氧化和抗衰老的新用途，而提供了一种牡丹籽提取物及制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂。本发明的牡丹籽提取物对酪氨酸蛋白酶和弹性蛋白酶具有很好地抑制作用，能够显著地清除自由基并抑制黑色素的形成，具有较好地美白、抗氧化和抗老化的功效，并且天然、安全，可用作皮肤外用剂的美白、抗氧化和抗衰老的活性成分。本发明的皮肤外用剂安全性高，成本低廉，美白、抗氧化和抗衰老效果好，具有良好的市场应用前景。

本发明提供了一种牡丹籽提取物的制备方法，其包括下列方法和步骤：

方法1、将粉碎后的牡丹籽与60~80%的乙醇水溶液混合均匀，在10~30℃下提取0.5~2小时，固液分离后得滤液，除去溶剂即得牡丹籽粗提物；其中，所述的牡丹籽与所述的乙醇水溶液的体积质量比为5~20mL/g；所述的60~80%的乙醇水溶液中，所述的百分比（%）是指乙醇的体积与乙醇水溶液的体积的百分比；

方法2、将方法1得到的牡丹籽粗提物，上样到大孔树脂柱，依次用去离子水、10~25%的乙醇水溶液、30~45%的乙醇水溶液、50~65%的乙醇水溶液、70~85%的乙醇水溶液和90%以上的乙醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液并除去溶剂，相应地得到溶剂洗脱部位A、溶剂洗脱部位B、溶剂洗脱部位C、溶剂洗脱部位D、溶剂洗脱部位E和溶剂洗脱部位F。

方法1中，所述的牡丹籽为毛茛科（Ranuculaceae）芍药属（Paeonia L.）植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）的种子。所述的牡丹籽可按照本领域常规的方法进行粉碎，其粒度没有特殊要求。

方法1中，所述的60~80%的乙醇水溶液较佳地为70%的乙醇水溶液。所述的提取的温度较佳地为25℃。所述的牡丹籽与所述的乙醇水溶液的体积质量比较佳地为10mL/g。

方法1中，所述的提取的方法可为本领域提取的常规方法，较佳地为超声提取、搅拌提取或逆流循环提取。所述的提取的次数较佳地为两次。当使用超声提取时，所述的超声提取的时间较佳地为0.5~2小时，更佳地为1小时；所述的超声提取的功率可为本领域超声提取常规的功率，较佳地为100W~250W。

方法1中，所述的固液分离的方法可为本领域常规的方法，较佳地为过滤。所述的除去溶剂的方法可为本领域常规的方法，较佳地为减压浓缩。所述的减压浓缩的操作条件为中该类操作的常规条件。所述的“除去溶剂”，可以为除去全部溶剂或者仅除去乙醇。当方法1中所述的“滤液脱除溶剂”为脱除全部溶剂时，方法2中需要将方法1得到的牡丹籽粗提物用去离子水溶解后，再上样到大孔树脂柱。

方法2中，将方法1得到的牡丹籽粗提物，上样到大孔树脂柱后，较佳地，依次用去离子水、20%的乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液、60%的乙醇水溶液、80%的乙醇水溶液和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱。

方法2中，所述的大孔树脂可为本领域常规的大孔树脂，一般为弱极性的或中等极性的吸附树脂，例如X-5、AB-8、D101、XDA-6、LX-21、NK-9、D3520或WLD树脂，更佳地为AB-8树脂。

方法2中，所述的去离子水、10~25%的乙醇水溶液、30~45%的乙醇水溶液、50~65%的乙醇水溶液70~85%的乙醇水溶液和95%以上的乙醇水溶液的用量可为本领域常规的用量，较佳地，其分别与所述的牡丹籽粗提物的体积质量比为0.5L/10g~2L/10g，更佳地为1L/10g。

方法2中，所述的除去溶剂的方法可为本领域常规的方法，较佳地为减压浓缩。所述的减压浓缩的操作条件为中该类操作的常规条件。

本发明还提供了一种由上述制备方法制得的牡丹籽提取物。所述的牡丹籽提取物包括方法1制得的牡丹籽粗提物、方法2制得的溶剂洗脱部位A、溶剂洗脱部位B、溶剂洗脱部位C、溶剂洗脱部位D、溶剂洗脱部位E和溶剂洗脱部位F中的一种或多种。所述的牡丹籽提取物较佳地为方法2制得的溶剂洗脱部位D和/或溶剂洗脱部位E。

本发明还提供了所述的牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分、抗氧化活性成分和抗老化活性成分中的一种或多种的应用。

本发明中，所述的牡丹籽提取物较佳地作为美白活性成分、抗氧化活性成分和抗老化活性成分中的一种或多种应用于所述皮肤外用剂中。

所述的皮肤外用剂包括本领域常规的具备疾病治疗用途的药物，或者不具备疾病治疗用途的化妆品。

本发明还提供了一种包括所述的牡丹籽提取物的皮肤外用剂。

在所述的皮肤外用剂中，所述的牡丹籽提取物的含量可为本领域常规的含量，较佳地为0.0001%~3%，更佳地为0.1%~1%，所述的百分比（%）是指所述的牡丹籽提取物的质量占所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

所述的皮肤外用剂较佳地为不具备疾病治疗用途的化妆品，所述的化妆品可为本领域常规的化妆品，较佳地为化妆水、精华液、乳液和乳霜中的一种或多种。所述的皮肤外用剂中，除本发明所述的牡丹籽提取物外，其余组分均为本领域常规的组分，例如去离子水以及功能活性物、保湿剂、油分、乳化剂、增稠剂、防腐剂、稳定剂、香料、色素和pH调节剂中的一种或多种。

在所述的皮肤外用剂中，所述的功能活性物可为本领域常规的功能活性物，较佳的为甘草酸二钾、尿囊素、烟酰胺、泛醇、透明质酸钠和生育酚乙酸酯中的一种或多种。所述的功能活性物的用量可为本领域常规的用量含量。

在所述的皮肤外用剂中，所述的保湿剂可为本领域常规的保湿剂，较佳地为甘油、丁二醇、1,3-丙二醇和聚乙二醇（例如聚乙二醇-32）中的一种或多种。所述的保湿剂的用量可为本领域常规的用量含量，较佳地所述的保湿剂的含量为1%~20%，所述的百分比为所述的保湿剂的质量与所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

在所述的皮肤外用剂中，所述的油分可为本领域常规的油分，较佳地为氢化聚异丁烯、异十六烷、聚二甲基硅氧烷、异硬脂酸异丙酯和矿油中的一种或多种。所述的油分的用量可为本领域常规的用量含量，较佳地所述的油分的含量为1%~20%，所述的百分比为所述的油分的质量与所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

在所述的皮肤外用剂中，所述的乳化剂可为本领域常规的乳化剂，较佳地为甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯（165）、PEG-40氢化蓖麻油、烷基酚聚氧乙烯醚和卵磷脂中的一种或多种。所述的乳化剂的用量可为本领域常规的用量含量，较佳地所述的乳化剂的含量为1%~20%，所述的百分比为所述的乳化剂的质量与所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

在所述的皮肤外用剂中，所述的增稠剂可为本领域常规的增稠剂，较佳地为羟乙基纤维素、丙烯酸(酯)类/C₁₀-₃₀烷醇丙烯酸酯交联聚合物（Pemulen TR-2）、聚丙烯酰胺/C_13-14异链烷烃/月桂醇聚醚-7（SEPIGEL 305）和卡波姆中的一种或多种。所述的增稠剂的用量可为本领域常规的用量，较佳地所述的增稠剂的含量为0.15%~2%，所述的百分比为所述的增稠剂的质量与所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

在所述的皮肤外用剂中，所述的防腐剂可为本领域常规的防腐剂，较佳地为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。所述的防腐剂的用量可为本领域常规的用量，较佳地所述的防腐剂的含量为0.1%~0.2%，所述的百分比为所述的防腐剂的质量与所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

在所述的皮肤外用剂中，所述的稳定剂可为本领域常规的稳定剂。所述的稳定剂的用量可为本领域常规的用量。

在所述的皮肤外用剂中，所述的pH调节剂可为本领域常规的pH调节剂，较佳地为氨甲基丙醇和/或三乙醇胺。所述的pH调节剂的用量不作具体限定，只要能够调节所述的皮肤外用剂的pH值在5.5~7.0之间即可。

所述的香料可为本领域常规的香料，一般为香精。所述的香料的用量可为本领域常规的用量，较佳地所述的香料的含量为0.02%~0.3%，所述的百分比为香料的质量与所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明中，所述的室温是指10~30℃。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的牡丹籽提取物对酪氨酸蛋白酶和弹性蛋白酶具有很好地抑制作用，能够显著地清除自由基并抑制黑色素的形成，具有较好地美白、抗氧化和抗老化的功效，并且天然、安全，可用作皮肤外用剂的美白、抗氧化和抗衰老的活性成分。本发明的皮肤外用剂安全性高，成本低廉，美白、抗氧化和抗衰老效果好，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为牡丹籽40%乙醇水溶液洗脱部位的HPLC图谱。

图2为牡丹籽60%乙醇水溶液洗脱部位的HPLC图谱。

图3为丹皮酚的HPLC图谱。

图4为牡丹籽40%乙醇水溶液洗脱部位对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图。

图5为牡丹籽60%乙醇水溶液洗脱部位对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图。

图6为丹皮酚对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图。

图7为空白对照组对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，乙醇水溶液涉及百分比（%）时，其均为体积百分比，即乙醇的体积与乙醇水溶液总体积的百分比。

所述的牡丹籽为常规市售可得。

实施例1 提取物的制备

1）牡丹籽提取物

方法1、牡丹籽粗提物的制备

将200g市售的牡丹籽粉碎，与2000mL70%的乙醇水溶液混合浸泡，超声提取，超声提取的温度为25℃；超声提取的功率为150W；提取两次，每次1小时，过滤，滤液经减压脱除溶剂后，得到牡丹籽粗提物34.8g。

方法2、牡丹籽洗脱部位的制备

按照方法1制得的牡丹籽粗提物10g，用去离子水溶解后，用AB-8树脂柱层析，依次用去1L离子水、1L 20%乙醇水溶液、1L 40%乙醇水溶液、1L 60%乙醇水溶液、1L 80%乙醇水溶液和1L 95%乙醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，减压脱除溶剂，称重，分别得到水洗脱部位（溶剂洗脱部分A）、20%乙醇水溶液部位（溶剂洗脱部位B）、40%乙醇水溶液部位（溶剂洗脱部位C）、60%乙醇水溶液部位（溶剂洗脱部位D）、80%乙醇水溶液部位（溶剂洗脱部位E）和95%乙醇水溶液部位（溶剂洗脱部位F）的牡丹籽提取物。

实施例2 牡丹籽提取物中丹皮酚含量测定

按照文献方法和HPLC条件（李智慧等. HPLC测定不同厂家桂枝茯苓丸中丹皮酚及芍药苷[J]，中国实验方剂学杂志，2015，19(9):121-123.）测定了上述40%乙醇水溶液洗脱部位和60%乙醇洗脱部位的HPLC图谱，具体见图1和图2，其中图1为40%乙醇水溶液洗脱部位的HPLC图谱，图2为60%乙醇水溶液洗脱部位的HPLC图谱；并在同样条件下测定了丹皮酚的HPLC图谱（丹皮酚的保留时间为24.304min），结果如图3所示，由图1~3可知，上述40%乙醇水溶液洗脱部位和60%乙醇洗脱部位的HPLC图谱中没有丹皮酚的峰出现，即未检测到丹皮酚。

实施例3 酪氨酸酶抑制活性的检测

按照实施例1制备的牡丹籽提取物和丹皮酚标准品（丹皮酚含量≥98%，购于国药集团化学试剂有限公司），完全溶于去离子水，配制成0.1mg/mL水溶液，用于测定酪氨酸酶抑制活性，以熊果苷为参照物。测定步骤为：磷酸盐缓冲溶液（pH6.8，30mM）70μL、1.66mM酪氨酸溶液80μL、样品溶液80μL混合均匀，在37℃恒温水槽中温育5分钟以上，加入酪氨酸酶溶液（125U/mL）10μL，在37℃恒温10min后，用酶标仪测定475nm波长的吸光度A₄₇₅。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表1。

酪氨酸酶活性抑制率计算公式为：抑制率（%）=（A₀-（A₄₇₅-B））/A₀×100%，其中A₀是参比溶液的吸光度，A₄₇₅是样品溶液的吸光度，B是样品空白溶液的吸光度。

表1 酪氨酸酶抑制活性的测定结果

由表1可见，牡丹籽提取后获得的粗提物具有对酪氨酸酶活性的抑制作用，经吸附树脂分离后，所得的乙醇洗脱部位均能实现对酪氨酸酶活性的抑制，60%乙醇水溶液洗脱部位（溶剂洗脱部位D）对酪氨酸酶活性的抑制作用最强，且比粗提物的抑制作用大大增强。

实施例4 抗氧化活性的检测

按照实施例1制备的牡丹籽提取物，用DPPH法测定其清除自由基抗氧化活性。测定步骤为：将提取物分别用去离子水配制成0.1mg/mL水溶液，移取2mL于10 mL具塞试管中，加人2mL DPPH乙醇溶液(2×10^-4mol/L)，充分混匀，室温静置30min后用分光光度计测定517nm波长的吸光度A₅₁₇；同时测定2mL提取物溶液与2mL乙醇混合后的吸光度A₀，2mL水与2mLDPPH乙醇溶液混合后的吸光度C以及2mL水与2mL乙醇溶液混合后的吸光度C₀。平行测定三次，取平均值，根据以下公式计算自由基清除率，清除率越大，说明提取物的抗氧化能力越强。

自由基清除率（%）=[1- (A₅₁₇- A₀)/(C -C₀)]×100%

表2 DPPH法清除自由基活性的检测结果

由表2可见，牡丹籽经提取后获得的粗提物，能实现对DPPH自由基的清除作用，经吸附树脂分离后，所得乙醇洗脱部位均能实现对DPPH自由基的清除，60%乙醇水溶液洗脱部位（溶剂洗脱部位D）对自由基的清除作用最强，且与牡丹籽粗提物的清除作用相比较有很大的提高。

实施例5弹性蛋白酶抑制活性的检测

按照实施例1制备的牡丹籽提取物，溶于去离子水，配制成0.1mg/mL水溶液，用于测定弹性蛋白酶抑制活性。测定方法按照文献（Am. J. Pharmacol. Toxicol., 2009, 4,127-129公开的测定弹性蛋白酶抑制活性的方法进行，测定步骤为：在96孔板中加入10μL样品溶液和130μL含有1.015mM反应底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-Cl缓冲溶液（PH8.0），在25℃下温育5分钟，加入15μL弹性蛋白酶溶液（0.5U/mL），继续在25℃下温育30min，然后用酶标仪测定410nm波长的吸光度A₄₁₀。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表3。

弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为：抑制率（%）=（A₀-（A₄₁₀-B））/A₀×100%，其中A₀是参比溶液的吸光度，A₄₁₀是样品溶液的吸光度，B是样品空白溶液的吸光度。

表3 弹性蛋白酶活性抑制的测定结果

由表3可知，在本发明中使用的60%乙醇水溶液部位（溶剂洗脱部位D）和80%乙醇水溶液部位（溶剂洗脱部位E）抑制弹性蛋白酶作用最强，可以将牡丹籽提取物配合在外用剂中，作为防止肌肤老化、维持年轻健康的肌肤状态的抗老化剂使用。

实施例6 牡丹籽提取物抑制斑马鱼胚胎黑色素产生实验

将实施例1制备的牡丹籽提取物，分别溶于去离子水，配制成水溶液，用于测定对斑马鱼胚胎黑色素生成的抑制作用。测定步骤如下：斑马鱼的饲养与胚胎的收集，成年斑马鱼饲养于实验室循环水养殖系统中，28.5℃，光/暗周期为14/10小时，饲养用水经循环系统过滤并充分曝气，pH值保持8.0左右，每天喂食丰年虫三次，每周喂食6天。选择形态正常，个体较大和健康的性成熟斑马鱼，在孵化系统按雌雄比1：2进行配对饲养于15L 10-15条玻璃水族箱中。在产卵前一天晚上22：00熄灯，次日早上8：00系统自动开灯，在光照刺激下开始产卵，收集胚胎。将收集的胚胎充分的清洗去除脏物后，在显微镜下挑选出健康发育正常的胚胎，以96孔板作为试验容器，每孔中分别加入牡丹籽提取物水溶液，按1个胚胎/孔随机分配到96孔板中。每天更换待测牡丹籽提取物水溶液并搅拌，以确保活性成分分布均匀。基于表型的色素沉着评估，观察斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果，检测到的结果如表4所示，斑马鱼胚胎显微镜图谱如图4~7所示，其中，图4为40%乙醇水溶液洗脱部位（溶剂洗脱部位C）对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图；图5为60%乙醇水溶液洗脱部位（溶剂洗脱部位D）对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图；图6为丹皮酚对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图；图7为空白对照组对斑马鱼胚胎的黑色素抑制效果图。

表4 斑马鱼胚胎黑色素抑制效果

由表4及图4和图5可知，40%乙醇水溶液洗脱部位和60%乙醇水溶液洗脱部位具有对斑马鱼胚胎黑色素生成的抑制作用，且抑制效果强于等浓度的丹皮酚。可以将牡丹籽提取物配合在外用剂中，作为防止肌肤色素沉着的美白活性物使用。

实施例7 含有牡丹籽提取物的皮肤外用剂

取实施例1中所制备的牡丹籽提取物，用于皮肤外用剂的制备。所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物，例如化妆水、精华液、乳霜等。所述牡丹籽提取物在皮肤外用剂中的重量百分比是0.0001%~3%，优选0.5%~3%。以下是牡丹籽提取物在皮肤外用剂中的具体应用的实施例。以下各表中“-”表示无添加。

实施例8 含有牡丹籽提取物的化妆水

取实施例1中所制备的牡丹籽提取物用于制备具有抗衰老、美白作用的化妆水，所述化妆水含有的组分如表5所示：

表5

实施例9 含有牡丹籽提取物的精华液

取60%乙醇水溶液洗脱部位（溶剂洗脱部位D）用于制备具有抗衰老、美白作用的精华液，所述精华液含有的组分如表6所示：

表6

实施例10 含有牡丹籽提取物的乳液/霜

取60%乙醇水溶液洗脱部位（溶剂洗脱部位D）分别用于制备具有抗衰老、美白作用的乳液/霜，所述乳液/霜含有的组分如表7所示：

表7

Claims

1.一种牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分和/或抗老化活性成分的应用，其特征在于，所述牡丹籽提取物的制备方法，包括下列方法和步骤：

方法1、将粉碎后的牡丹籽与60~80%的乙醇水溶液混合均匀，在10~30℃下提取0.5~2小时，固液分离后得滤液，除去溶剂即得牡丹籽粗提物；其中，所述的牡丹籽与所述的乙醇水溶液的体积质量比为5~20mL/g；所述的60~80%的乙醇水溶液中，所述的百分比是指乙醇的体积与乙醇水溶液的体积的百分比；

方法2、将方法1得到的牡丹籽粗提物用去离子水溶解后，上样到大孔树脂柱，依次用去离子水、20%的乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液、60%的乙醇水溶液、80%的乙醇水溶液和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液并除去溶剂，相应地得到溶剂洗脱部位A、溶剂洗脱部位B、溶剂洗脱部位C、溶剂洗脱部位D、溶剂洗脱部位E和溶剂洗脱部位F；

所述的牡丹籽提取物为溶剂洗脱部位D和/或溶剂洗脱部位E；

所述的大孔树脂为X-5、AB-8、D101、XDA-6、LX-21、NK-9、D3520或WLD树脂。

2.如权利要求1所述的牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分和/或抗老化活性成分中的应用，其特征在于，方法1中，所述的牡丹籽为毛茛科（Ranuculaceae）芍药属（Paeonia L.）植物牡丹（Paeoniasuffruticosa Andrews）的种子；和/或，方法1中，所述的60~80%的乙醇水溶液为70%的乙醇水溶液；和/或，方法1中，所述的提取的温度为25℃；和/或，方法1中，所述的牡丹籽与所述的乙醇水溶液的体积质量比为10mL/g；和/或，方法1中，所述的提取的方法为超声提取、搅拌提取或逆流循环提取；和/或，方法1中，所述的提取的次数为两次；和/或，方法1中，所述的固液分离的方法为过滤。

3.如权利要求2所述的牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分和/或抗老化活性成分的应用，其特征在于，方法1中，当使用超声提取时，所述的超声提取的时间为0.5~2小时；所述的超声提取的功率为100W~250W。

4.如权利要求1所述的牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分和/或抗老化活性成分的应用，其特征在于，方法2中，所述的去离子水、20%的乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液、60%的乙醇水溶液、80%的乙醇水溶液和95%的乙醇水溶液分别与所述的牡丹籽粗提物的体积质量比为0.5L/10g~2L/10g。

5.如权利要求1所述的牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分和/或抗老化活性成分的应用，其特征在于，所述的皮肤外用制剂包括具备疾病治疗用途的药物，或者不具备疾病治疗用途的化妆品。

6.如权利要求1所述的牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分和/或抗老化活性成分的应用，其特征在于，在所述的皮肤外用制剂中，所述的牡丹籽提取物的含量为0.0001%~3%，所述的百分比是指所述的牡丹籽提取物的质量占所述的皮肤外用剂总质量的百分比。

7.如权利要求6所述的牡丹籽提取物在制备皮肤外用制剂时作为美白活性成分和/或抗老化活性成分的应用，其特征在于，在所述的皮肤外用制剂中，所述的牡丹籽提取物的含量为0.1%~1%。