CN111671764A - 灵芝肽多糖在制备皮肤组胺抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了灵芝肽多糖在制备皮肤组胺抑制中的应用，所述灵芝肽多糖的分子量为800Da～15KDa；同时，灵芝肽多糖能够用于制备皮肤组胺分泌抑制剂和透明质酸酶抑制剂，对其相关疾病尤其是过敏性皮肤病有良好的治疗效果。灵芝肽多糖及其主要成分对组胺分泌具有一定的抑制作用，同时能够抑制透明质酸酶从而进一步抑制组胺的分泌；本发明所述的灵芝肽多糖安全无刺激、无副作用，对皮肤组胺分泌相关疾病具有一定的防治作用，可广泛应用于制备皮肤外用组胺抑制剂及预防、治疗皮肤组胺分泌相关疾病的产品。

Description

灵芝肽多糖在制备皮肤组胺抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及灵芝肽多糖在制备皮肤组胺抑制剂中的应用。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)是一种多孔菌科真菌灵芝的子实体，广泛分布于中国浙江、广东、江西等地，主要生长在腐木或树木的根部主要有6种，即赤灵芝、青灵芝、黄灵芝、紫芝、白灵芝和黑灵芝等。其中赤灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst)又名丹芝、赤芝，呈木栓质，菌盖呈肾形或者半圆形，表面呈红褐色，有光泽，菌柄的颜色一般较深，在传统中医药中具有滋补强壮和消炎等作用。赤芝中含有三萜类成分如灵芝酸A、B、C1、C2、D1，赤芝酸A、B、C、D1，灵赤酸等；多糖类成分灵芝多糖等。还含有麦角甾醇、核苷类、氨基酸类、蛋白质等。现代研究发现，灵芝肽多糖是从灵芝多糖中分离得到的一种具有多种生理活性的肽多糖，可以增加还原型辅酶II、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的产生，保护巨噬细胞免受叔丁基氢过氧化物诱导导致的损伤，降低β-半乳糖苷酶活性，增厚表皮和真皮的厚度，改善皮肤组织结构，恢复皮肤屏障的作用。
组胺(histamine)是敏感性皮肤诱发皮肤炎症的主要致敏因子之一，其为一种自体活性物质，广泛存在于皮肤、肺和肠黏膜的肥大细胞和嗜碱粒细胞中，由组氨酸在氨酸脱羧酶 (histidine decarboxylase，HDC)的作用下产生。在各种外在因素的刺激下，肥大细胞和嗜碱粒细胞通过脱颗粒释放组胺，组胺与组胺受体结合，产生机体炎症反应。现代研究发现，组胺受体共有4种，分别为H1R、H2R、H3R和H4R受体。组胺作用于H1R受体，可引起毛细血管扩张，导致血管通透性增加，产生局部红肿、痒感；组胺作用于H2R受体，引起胃酸增加，而胃酸分泌过多与消化性溃疡的形成有密切关系；H3R受体主要分布于中枢组胺能神经元、自主神经系统,是突触前自身受体。组胺H3R受体兴奋可反馈性地抑制组胺的合成和释放，作用于副交感神经节和节后神经纤维，调节胆碱能神经传递；组胺H4R受体主要分布于外周组织，多表达于与炎症反应相关的组织和造血细胞中，因此被认为是一种参与炎症形成过程中重要的因子之一。减少组胺的分泌，抑制H1R和H4R受体的活化能够抑制皮肤瘙痒和炎症发生，达到治疗目的。
目前，国内外学者对灵芝肽多糖的研究主要集中在抗衰老、抗自由基、抗肿瘤、免疫调节等作用，但灵芝肽多糖作为组胺抑制剂和透明质酸酶抑制剂的研究还未见报道。因此，开发一种新的安全性高和有效性好的中药提取成分，用于治疗组胺相关皮肤疾病具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出灵芝肽多糖在制备皮肤组胺分泌抑制剂中的应用，能够抑制皮肤组胺分泌，且对皮肤安全无刺激、无副作用，可用于制备相关皮肤抗组胺产品。
本发明还提出灵芝肽多糖在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。
本发明还提出灵芝肽多糖在制备治疗和/或预防皮肤组胺分泌相关疾病的药物中的应用。
本发明还提出一种具有抗组胺功效的产品。
在本发明的一个方面中，提供了灵芝肽多糖在制备皮肤组胺分泌抑制剂中的应用。
进一步地，所述皮肤组胺分泌抑制剂用于制备治疗和/或预防过敏性皮肤病的产品；所述产品包括药物或化妆品。
在本发明的另一个方面中，提供了灵芝肽多糖在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。
进一步地，所述透明质酸酶抑制剂用于制备治疗和/或预防过敏性皮肤病的产品；所述产品包括药物或化妆品。
在本发明中，透明质酸酶抑制剂是一种能够抑制透明质酸酶活性的物质；透明质酸酶 (HAase)是能特异性分解透明质酸(HA)的一种蛋白水解酶，HA是广泛分布于细胞外基质中，是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分，其被透明质酸酶水解后，细胞间变得非粘性，引起细胞脱颗粒，释放组胺，引起过敏反应的发生；因此，该灵芝肽多糖用于制备透明质酸酶抑制剂，能够通过抑制透明质酸酶进而抑制过敏反应的发生。在本发明的又一个方面中，提供了灵芝肽多糖在制备皮肤组胺分泌抑制剂中的应用。
在本发明的又一个方面中，提供了灵芝肽多糖在制备治疗和/或预防皮肤组胺分泌相关疾病的产品中的应用；所述产品包括药物或化妆品。
进一步地，所述皮肤组胺分泌相关疾病为过敏性皮肤病，所述过敏性皮肤病包含以下皮肤敏感症状中的至少一种：红斑、瘙痒、烧灼和刺痛。
进一步地，所述灵芝肽多糖的分子量为800Da～15KDa。在本发明中，分子量为800Da～ 15KDa的灵芝肽多糖对组胺分泌抑制效果最为显著，对磷酸组胺致痒阈值最高(49.64± 12.42)，且对透明质酸酶的抑制强度为40.19％，具有较强的抑制活性。
进一步地，所述灵芝肽多糖的肽糖比为20％～30％。
进一步地，所述灵芝肽多糖中的氨基酸含量为65～75mg/kg，灵芝多糖含量为252～ 265mg/kg。
进一步地，所述灵芝肽多糖的制备方法包括以下步骤：
S1、灵芝原料在水溶液中回流提取，过滤收集滤液；
S2、将所述步骤S1中得到的滤液进行有机膜超滤，依次经过分子量15KDa和800Da的有机膜超滤，收集得到分子量在800Da～15KDa之间的滤液即得。
优选地，所述制备方法具体包括以下步骤：
S01、赤芝原料加入10～20倍水，提取1h～3h，过滤收集滤液(提取两次)；
S02、对灵芝提取液进行有机膜超滤，第一次膜过滤30KDa有机超滤膜，取30KDa以下部分滤液，再进行第二次有机膜超滤15KDa，取15KDa以下部分滤液，小分子滤液继续进行800KDa有机膜过滤，得到800Da-15KDa滤液，弃去小分子的滤液，加水补足至原料重量的 10倍即得。
进一步地，所述灵芝肽多糖提取自赤芝。
在本发明的又一个方面中，一种具有抗组胺功效的产品，包含灵芝肽多糖作为活性成分。
进一步地，所述灵芝肽多糖的分子量为800Da～15KDa。
进一步地，所述药物的剂型为外用制剂；所述外用制剂包括溶液、粉剂、洗剂、酊剂、乳霜剂、油剂或硬膏等。
优选地，所述产品为乳霜剂。
进一步地，所述灵芝肽多糖的含量为2.5％～10％。
优选地，所述灵芝肽多糖的含量为4％～8％。
更优选地，所述灵芝肽多糖的含量为5％。
进一步地，所述灵芝肽多糖的肽糖比为20％～30％。
进一步地，所述灵芝肽多糖中的氨基酸含量为65～75mg/kg，灵芝多糖含量为252～ 265mg/kg。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的灵芝肽多糖在抑制皮肤组胺分泌具有良好的活性，用于治疗和/或预防皮肤组胺分泌相关疾病具有显著的效果。通过本发明实施例的研究显示：灵芝肽多糖及其主要成分对组胺分泌具有一定的抑制作用，从而抑制皮肤过敏反应；同时，灵芝肽多糖能够抑制透明质酸酶，进而抑制细胞脱颗粒、释放组胺和过敏反应的发生；因此，灵芝肽多糖能够用于制备皮肤组胺分泌抑制剂和透明质酸酶抑制剂，对其相关疾病尤其是过敏性皮肤病有良好的治疗效果。本发明所述的灵芝肽多糖安全无刺激、无副作用，对皮肤组胺分泌相关疾病具有一定的防治作用，可应用于制备皮肤外用组胺抑制剂和透明质酸酶抑制剂以及预防、治疗相关疾病的产品。
本发明不仅提供了一种灵芝肽多糖的新应用，也提供了一种新的安全有效的皮肤外用组胺抑制剂，同时为皮肤组胺分泌相关疾病的治疗提供了一种新的治疗药物和途径。
本发明所用术语“治疗”，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生：改善或预防潜在代谢综合征；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于给药有关的情况。
在具体实施例中，本发明所述的灵芝肽多糖可单独使用，还可与其他许多化学物质组合使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药中的一种或多种。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中灵芝肽多糖的制备工艺流程图；
图2为本发明实施例3中不同剂量灵芝肽多糖对透明质酸酶的抑制作用实验结果图；
图3为本发明实施例4中灵芝肽多糖对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管反应性影响示意图；
图4为本发明实施例5中3D皮肤皱纹测定(横向尺寸低于1.0mm)；其中，(A-4)为使用前的3D皮肤皱纹成像图，(B-4)为使用产品后的3D皮肤皱纹成像图，(C-4)为使用前和使用后的皱纹凹陷指数对比图；
图5为本发明实施例5中3D皮肤血红素测定；其中，(A-5)为使用前的3D皮肤血红素测定成像图，(B-5)为使用产品后的3D皮肤血红素测定成像图，(C-5)为使用前和使用后的血红素平均水平对比图，(D-5)为使用前和使用后的血红素差异对比图；
图6为本发明实施例5中3D皮肤纹理测定(横向尺寸低于1.0mm)；其中，(A-6)为使用前的3D皮肤纹理测定成像图，(B-6)为使用产品后的3D皮肤纹理测定成像图，(C-6)为使用前和使用后的纹理粗糙程度对比图；
图7为本发明实施例5中3D皮肤毛孔测定(横向尺寸低于0.5mm)；其中，(A-7)为使用前的3D皮肤毛孔测定成像图，(B-7)为使用产品后的3D皮肤毛孔测定成像图，(C-7)为使用前和使用后的毛孔体积对比图；
图8为本发明实施例5中3D皮肤凹凸测定(横向尺寸低于1.0mm)；其中，(A-8)为使用前的3D皮肤凹陷测定成像图，(B-8)为使用产品后的3D皮肤凹陷测定成像图，(C-8)为使用前和使用后的凹陷体积对比图，(D-8)为使用前3D皮肤突起测定成像图，(E-8)为使用后3D皮肤突起测定成像图，(F-8)为使用前和使用后的突起体积对比图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例1：灵芝肽多糖提取物的制备、其活性筛选及其含量测定
1.材料和仪器
材料：葡萄糖(Fluck)，赤芝(购自广州同仁堂)，去离子水(自制)，浓硫酸(国药集团化学试剂有限公司)，苯酚(国药集团化学试剂有限公司)，其它试剂均为分析纯。
仪器：有机膜过滤设备(山东博纳生物科技集团有限公司)，UV 2301-II紫外分光光度计 (上海天美科学仪器有限公司)；TGL-16型高速低温离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，Waters-Tag氨基酸自动分析仪(美国沃特世有限公司)。
试剂：5％苯酚溶液，取苯酚适量，砂浴蒸馏，收集180～182℃馏分，称取12.5g上述馏分，用水溶解，定容250.0mL，摇匀，配置成5％的苯酚溶液，避光，冷藏备用。葡萄糖标准溶液：称取110℃恒重葡萄糖20.2mg，用去离子水溶解，定容100ml，即202mg/L葡萄糖标准溶液。
动物：普通级豚鼠，9周龄，体重260-280g，40只，雄性，由广州市白云区龙归兴科动物养殖场提供[合格证号：SCXK(粤)2018-0002]。
2.实验步骤
(1)灵芝肽多糖的制备
赤芝破碎成80目，置于容器中，加入15倍水，100℃煮沸提取2h，过滤，获得滤液①，重复向容器中加入12倍水，100℃煮沸提取2h，过滤，获得滤液②，合并滤液①和②，对灵芝提取液进行有机膜超滤，第一次膜过滤30KDa有机超滤膜，得到两个部位滤液：即灵芝肽多糖30KDa，30KDa以下部分滤液，再进行第二次有机膜超滤15KDa，得到15KDa-30KDa 滤液，即灵芝肽多糖15KDa-30KDa，保留小分子滤液，小分子滤液继续进行800KDa有机膜过滤，得到800Da-15KDa滤液，即灵芝肽多糖800Da-15KDa，弃去小分子的滤液，灵芝肽多糖30KDa，灵芝肽多糖15KDa-30KDa，灵芝肽多糖800Da-15KDa分别加水补足至原料重量的10倍，即得到不同分子量的灵芝肽多糖提取液，即大于30KDa的灵芝肽多糖30KDa， 15KDa-30KDa的灵芝肽多糖15KDa-30KDa，800Da-15KDa的灵芝肽多糖800Da-15KDa。图 1为上述灵芝肽多糖提取步骤的流程图。
(2)灵芝肽多糖活性的筛选
实验步骤：取40只普通级豚鼠，雌雄各半，体重300g左右，按体重大小随机分为5组，每组8只，即模型组，空白基质组，灵芝肽多糖800Da-15KDa，灵芝肽多糖15KDa-30KDa组，灵芝肽多糖30KDa组。模型组不给药，空白基质组给予空白基质，给药组每只豚鼠每次均给药2.5ml，用脱毛膏将豚鼠右后足背部毛发脱去，形成一块1×1cm2无毛区，分别给药，连续7天，在末次给药前1h，将豚鼠右后足背擦伤，以渗血但不出血为宜，涂药1h后，在擦伤部位进行滴加0.01％磷酸组胺溶液，每次均为50μl，若豚鼠出现回头舔舐右后足动作，则停止滴加磷酸组胺，记录磷酸组胺滴加量，若豚鼠没有出现回头舔舐动作，则继续滴浓度递增的磷酸组胺，浓度依次为0.02％、0.03％、0.04％、0.05％…等，直至豚鼠回头舔舐右后足背，记录磷酸组胺量，即致痒阈。
实验结果：
表1不同分子量灵芝肽多糖对磷酸组胺所致豚鼠皮肤瘙痒模型的影响
Figure RE-GDA0002578228110000071
Figure RE-GDA0002578228110000072
实验结果显示，本发明所述灵芝肽多糖对磷酸组胺所致豚鼠瘙痒有一定的致痒阈值，具有一定的抑制磷酸组胺的作用，其中灵芝肽多糖800Da-15KDa能够很好的提高磷酸组胺所致瘙痒的致痒阈值。而皮肤的红肿和瘙痒，与组胺作用于H1R受体有关，灵芝肽多糖的抗组胺作用可能与阻断组胺作用于H1R受体，抑制了H1R受体活化相关通过阻断H1R和其它途径抑制血管内皮细胞、上皮细胞、白细胞粘附分子的表达而达到抗炎作用。
(3)灵芝肽多糖含量测定
实验步骤：取上述实验中效果最佳的灵芝肽多糖800Da-15KDa进行含量测定实验；精密量取葡萄糖标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ml分别置于10.0ml具塞试管中。
操作1：分别加水至1.0ml，再分别加入5％苯酚溶液1.6ml，左右摇动使均匀。加入浓硫酸7.0ml，边加边摇动，使之混合，放置10min，加水至刻度混匀。置25℃恒温水浴15min，取出放置室温，加水至刻度混匀。另取10.0ml具塞试管，加去离子水1.0ml，5％苯酚溶液1.6ml，浓硫酸7.0ml，按上述方法制作空白对照。于490nm处测定吸光度A，求得标准曲线的线性回归方程为：A＝0.006+0.0705C，相关系数r＝0.9999，n＝6。
样品总多糖含量的测定：移取灵芝肽多糖800Da-15KDa分别置于离心管中，按照操作1 步骤操作，平行测定六次平均值，计算灵芝肽多糖的总多糖含量。
计算公式如下：
灵芝多糖含量(mg/L，以葡萄糖计)＝C×V/W (1)
C：样品经处理后葡萄糖浓度(mg/L)
V：样品稀释总体积(mL)
W：取样量(mL或g)
灵芝肽多糖氨基酸含量的测定：Waters-Tag氨基酸自动分析仪，484nm紫外检测器，波长254nm，流动相A液B液缓冲液进行梯度洗脱，计算得到氨基酸总量。灵芝多糖中肽糖比 (F)测定：即灵芝多糖中肽含量与糖含量的比值，并测定肽含量占总糖肽比P，以氨基酸总量近似为肽含量(Ta)，葡萄糖单体含量近似为多糖含量(Tg)，按公式(2)、(3)可以计算出灵芝肽多糖中肽糖比F，肽含量占总糖肽比P。
肽糖比：F＝Ta/Tg×100％ (2)
肽含量占总糖肽比：P＝Ta/(Ta+Tg)×100％ (3)
Ta：肽总含量(mg/Kg)
Tg：总多糖含量(mg/Kg)
F：肽糖比
P：肽含量占总糖肽比
实验结果：灵芝肽多糖800Da-15KDa的氨基酸总含量为70.05mg/Kg；多糖含量为257 mg/Kg；肽糖比为27.25％。进一步的，对灵芝肽多糖800Da-15KDa进行相关活性研究试验。
以下实验所述灵芝肽多糖均为灵芝肽多糖800Da-15KDa分子段的肽多糖。
实施例2：灵芝肽多糖对磷酸组胺抑制作用实验
1.材料和仪器
试剂：灵芝肽多糖制备方法同实施例1。
动物：普通级豚鼠，9周龄，体重260-280g，48只，雄性，由广州市白云区龙归兴科动物养殖场提供[合格证号：SCXK(粤)2018-0002]。
2.实验步骤
不同剂量的灵芝肽多糖对磷酸组胺的抑制活性实验
取48只普通级豚鼠，雌雄各半，体重300g左右，按体重大小随机分为6组，每组8只，即模型组(Mol)，空白基质组(CON)，阳性组为肤轻松(FQS)，浓度为0.5％；灵芝肽多糖高剂量组(10％)，灵芝肽多糖中剂量组(5％)，灵芝肽多糖低剂量组(2.5％)。每天于豚鼠右后足脱毛区涂样品一次，模型组不给药，空白基质组给予等量的空白基质，100μl/次，连续 4d，末次涂样品前，采用无菌纱布将剃毛区域擦伤，再次涂药，末次涂药后1h，开始在创面处滴加0.01％磷酸组胺(50μl/只)，每隔3min依次滴加0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％……递增剂量，直到豚鼠舔舐右后足，以最后出现豚鼠回头舔舐右后足时，给予的磷酸组胺总量为致痒域。其中，如中剂量5％是指每100g的中剂量溶液中含有5g的采用实施例1方法制备得到的灵芝肽多糖800Da-15KDa提取液。
表2不同剂量灵芝肽多糖对磷酸组胺所致豚鼠皮肤瘙痒模型的影响
Figure RE-GDA0002578228110000091
Figure RE-GDA0002578228110000092
实验结果显示，灵芝肽多糖高剂量组对磷酸组胺所致豚鼠瘙痒具有较好的致痒阈值，表明灵芝肽多糖对组胺有较好的抑制活性，对皮肤组胺分泌相关疾病具有一定的防治作用，可应用于制备皮肤外用组胺抑制剂及预防、治疗皮肤组胺分泌相关疾病的药物。
实施例3：灵芝肽多糖对透明质酸酶抑制实验
进一步地，通过透明质酸酶的抑制作用，验证灵芝肽多糖的抗组胺作用。
1.材料和仪器
试剂：灵芝肽多糖(上述提取液)，透明质酸酶、透明质酸钠、甘草酸二钾均购置于麦克林试剂公司。无水乙醇、氢氧化钠、无水碳酸钠、浓盐酸、对-二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、冰乙酸、乙酸钠结晶、无水氯化钙等均为国产分析纯。
试液配制：①.醋酸缓冲溶液(pH＝5.6)：量取1.155mL冰乙酸稀释至100mL混匀后取其中4.8mL为A溶液；称取2.72g乙酸钠结晶加水溶解定容至100mL混匀后取其中45.2mL为B溶液；混合溶液A、B，以水定容至100mL混匀。精密测定其pH值，溶液A或B调至5.6即可。
②.透明质酸酶溶液：称取透明质酸酶5mg置于烧杯中加入2mL醋酸缓冲溶液，最终浓度为1250unit/mL。
③.透明质酸钠溶液：称取透明质酸钠10mg置于烧杯中加入20mL醋酸缓冲溶液，最终浓度为0.5mg/mL。
④.埃尔利希试剂(Ehrlich reagent)：称取0.8g对-二甲氨基苯甲醛溶于15mL浓盐酸和 15mL无水乙醇中。
⑤.乙酰丙酮溶液：取乙酰丙酮0.35mL溶于5mL浓度为1.0mol/L的碳酸钠溶液中，溶液在用前配制。
2.实验步骤
取0.1mL CaCl2溶液(0.25mmol/L)和0.5mL透明质酸酶液37℃保温培养20min；加入样品液0.5mL，继续37℃保温培养20min；加入0.5mL透明质酸钠液37℃保温30min，常温置5min；加入0.1mL NaOH溶液(0.4mol/L)和0.5mL乙酰丙酮溶液，于沸水浴中加热15min 后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0mL并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置20min显色，于513nm处测定其吸光度值。
样品对透明质酸酶抑制率的测定计算公式见以下公式：
透明质酸酶抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)*100
式中：A为对照溶液ABS值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；B为对照空白溶液ABS值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；C为试样溶液ABS值；D为试样空白溶液ABS 值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。
以去离子水作为参比，进行相关组ABS值测定。
实验分为6组，分别为空白对照组，0.5％甘草酸二钾组(0.5％GCSJ)，灵芝肽多糖高剂量组(GHDG)，灵芝肽多糖中剂量组(GMDG)，灵芝肽多糖低剂量组(GLDG)，以甘草酸二钾为阳性对照组。
3.实验结果
HAase是能特异性分解透明质酸(HA)的一种蛋白水解酶。HA是广泛分布于细胞外基质中，是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分，其被透明质酸酶水解后，细胞间变得非粘性，引起细胞脱颗粒，释放组胺，引起过敏反应的发生。
实验结果如图2所示，图2中CON为空白对照组，0.5％GCSJ为0.5％甘草酸二钾，GHDG 为灵芝肽多糖高剂量组，GMDG为灵芝肽多糖中剂量组，GLDG为灵芝肽多糖低剂量组)，表明灵芝肽多糖高剂量组和中剂量组对透明质酸酶有一定的抑制作用，灵芝肽多糖的高剂量组对透明质酸酶的抑制率为40.19％，说明灵芝肽多糖可通过抑制透明质酸酶活性的途径，减少透明质酸的分解，进而减少组胺和炎症因子的释放，从而起到一定的抗炎和抗过敏的作用。因此，灵芝肽多糖对皮肤组胺分泌相关疾病具有一定的防治作用，可应用于制备皮肤外用组胺抑制剂及预防、治疗皮肤组胺分泌相关疾病的药物。
实施例4：灵芝肽多糖对鸡胚绒毛膜尿囊膜的影响实验
绒毛膜尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)试验是眼刺激性试验替代方法中广泛使用的模型之一。鸡胚绒毛膜尿囊膜是鸡胚的一种体外循环系统，具有丰富血管的完整组织，利用CAM与结膜结构相似的特性，通过观察CAM暴露于化学物质后血管的变化(充血、出血、凝血)，检测化学物质对CAM的损伤，可以评价化学物可能的刺激性。
1.品系和来源
白莱杭鸡(White Leghorn chicken)受精鸡胚，应选用SPF鸡胚，供应商应具有农业部门认可的《兽药生产、检验用SPF鸡(蛋)定点生产企业》资格，鸡胚质量应符合国家标准的要求。
鸡胚应新鲜、干净、完好，重量50g～60g。孵化至9d龄时，应进行照蛋检查，未受精、无活性或者有缺失的鸡胚应弃去，严重畸形、破壳或者薄壳鸡胚也不能使用。
孵化条件：室温20℃～25℃，相对湿度45％～70％。孵化温度37.5℃±0.5℃，相对湿度 55％～70％，转盘频率3次/h～6次/h。9d龄的鸡胚孵化时不必旋转。
2.鸡胚尿囊膜(HET-CAM)试验
9d龄鸡胚进行照蛋检查，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊刀剥去蛋壳部分，完整暴露白色蛋膜，用吸管滴加1～2mL的0.9％NaCl溶液使蛋膜湿润，小心用弯镊去除内膜，暴露出绒毛尿囊膜(CAM)，避免血管膜受损，如有破损则不用于实验。
根据SNT 2329-2009商检标准，采用终点评价法检测灵芝肽多糖的眼刺激性，选用生理盐水(0.9％NaCl，NS)为阴性对照，1％脂肪醇醚硫酸钠盐混合物(Texapon ASV)溶液为阳性对照。取0.3mL受试样品直接作用于CAM，确保至少50％的CAM表面被受试样品覆盖，作用5min后用生理盐水轻轻冲洗CAM，冲洗后30s后观察CAM的出血、血管溶解和凝血反应，并分别按轻、中、重度记1分、2分和3分，每个鸡胚的最高积分为9分。每个受试样品均用6个鸡胚进行试验，计算6个鸡胚的刺激反应评分(endpoint score，ES)总和，按表3所示的分级标准，对受试样品的眼刺激性进行分级评价。
表3终点评价法受试样品眼刺激性分级标准
Figure RE-GDA0002578228110000121
3.实验结果
0.9％NaCl溶液在接触CAM后5分钟内均未见出血、血管溶解或凝血反应，血液流通清晰可见，如图3(A)所示。1％Texpon ASV溶液接触CAM后出现出血，血管融解，反应积分在18分以上，如图3(B)所示。灵芝肽多糖各剂量组接触CAM后未出现任何血管刺激反应，其中，图3(C)为灵芝肽多糖低剂量组(10％)，图3(D)为灵芝肽多糖中剂量组(5％)，图3(E)为灵芝肽多糖高剂量组(2.5％)。如图3(C-E)刺激积分均为0分，眼刺激性分级结果见表3所示。灵芝肽多糖作用于鸡胚绒毛尿囊膜未见毒性效应，说明灵芝肽多糖对鸡胚尿囊膜无血管反应性，安全无刺激，可应用于皮肤外用抗炎修复产品中。
表4 HET-CAM试验的眼刺激性评价结果
Figure RE-GDA0002578228110000122
Figure RE-GDA0002578228110000131
实施例5：具有抗组胺功效产品的配制工艺流程及其功效评价：
①抗组胺功效产品的配制工艺
具有抗组胺分泌功效外用产品的组分配方如下表5所示，在表5的比例范围内进行配比能够得到质量良好的产品。
表5含有灵芝肽多糖具有抗组胺分泌功效外用产品配制
Figure RE-GDA0002578228110000132
本实施例在制备过程中使用的组分配方如下表6所示：
表6本实施例含有灵芝肽多糖具有抗组胺分泌功效外用产品配制
Figure RE-GDA0002578228110000133
Figure RE-GDA0002578228110000141
按表5所示的配方制备抗组胺功效产品，其中，C相中灵芝肽多糖液为本发明实施例1 中制备得到的分子量为800Da-15KDa的灵芝肽多糖，本实施例中抗组胺功效产品具体制备方法如下：
1、将A相(原料混合)加热到85℃，搅拌均匀至溶解完全，备用；
2、降温至45℃左右，依次加入预溶好的C、D、E相，均质溶解完全，保温20min；
3、加入B相搅拌均匀；
4、冷却至室温后，用200目过滤布过滤出料。
②产品功效测试
仪器：antera 3D成像仪(以下实验结果均通过仪器进行测定)；
材料：实施例5中抗组胺产品。
1、实验步骤：
将本实施例中制备得到的抗组胺产品施用于受试者皮肤表面，通过3D成像技术，对皮肤的毛孔、纹理、凹凸、血红素、角质层含水量进行测定。
2、实验结果：
图4～图8为单次使用抗敏产品使用前后对比图，图4为3D皮肤皱纹测定，图5为3D皮肤血红素测定，图6为3D皮肤纹理测定，图7为3D皮肤毛孔测定，图8为3D皮肤凹凸测定。由图中可知，敷完4h内皮肤的毛孔、纹理、凹凸、血红素、角质层含水量水平由有一定分改善，炎症现象改善比较明显。
图4为3D皮肤皱纹测定实验图，(A-4)为使用前的3D皮肤皱纹成像图，(B-4)为使用产品后的3D皮肤皱纹成像图，(C-4)为使用前和使用后的皱纹凹陷指数对比图；其中，使用前的凹陷指数为8.247，使用后为7.309，说明使用产品后皮肤皱纹得到改善。
图5为3D皮肤血红素测定实验图，血红素用于评估血红蛋白水平，可评估炎症性疾病疗效评估面部毛细血管扩张程度等。其中，(A-5)为使用前的3D皮肤血红素测定成像图，(B-5) 为使用产品后的3D皮肤血红素测定成像图，(C-5)为使用前和使用后的血红素平均水平对比图，(D-5)为使用前和使用后的血红素差异对比图；其中，使用前的血红素平均水平为0.902，血红素差异为0.125，使用后的血红素平均水平为0.842，血红素差异为0.0969，说明使用产品后皮肤血红素降低，过敏症状得到改善。
图6为3D皮肤纹理测定实验图，(A-6)为使用前的3D皮肤纹理测定成像图，(B-6)为使用产品后的3D皮肤纹理测定成像图，(C-6)为使用前和使用后的纹理粗糙程度对比图；其中，使用前的纹理粗糙程度为7.782，使用后的纹理粗糙程度为为6.711，说明使用产品后皮肤纹理粗糙程度降低，纹理粗糙得到改善。
图7为3D皮肤毛孔测定实验图，(A-7)为使用前的3D皮肤毛孔测定成像图，(B-7)为使用产品后的3D皮肤毛孔测定成像图，(C-7)为使用前和使用后的毛孔体积对比图，其中，使用前的毛孔体积为0.35mm3，使用后的毛孔体积为0.113mm3，说明使用产品后皮肤毛孔缩小，毛孔粗大症状得到改善。
图8为3D皮肤凹凸测定实验图，(A-8)为使用前的3D皮肤凹陷测定成像图，(B-8)为使用产品后的3D皮肤凹陷测定成像图，(C-8)为使用前和使用后的凹陷体积对比图，(D-8)为使用前3D皮肤突起测定成像图，(E-8)为使用后3D皮肤突起测定成像图，(F-8)为使用前和使用后的突起体积对比图；其中，使用前的凹陷体积为0.991mm3，突起体积为1.300mm3使用后的凹陷体积为0.603mm3，突起体积为0.914mm3，说明使用产品后皮肤凹凸体积降低，皮肤更加趋于平滑。
使用Antera 3D成像仪，对皮肤的皱纹、毛孔、纹理、凹凸、血红素测定结果显示：使用产品后皮肤皱纹凹陷指数降低，纹理粗糙程度降低，毛孔缩小，凹凸体积降低，表明使用产品后各项指数均有所下降，皮肤更趋于平滑健康，同时使用产品后皮肤血红素降低，过敏症状得到改善。综上，含有灵芝肽多糖具有抗组胺分泌功效外用产品具有一定的改善皮肤的功效，灵芝肽多糖可用于相关的抗组胺分泌的功效外用产品的开发。
制备得到的产品为液状，质地均匀，涂抹于皮肤上无刺激，产品有效成分均为天然植物提取物，毒性小、刺激性小、安全性高，灵芝肽多糖在该浓度下具有很好的皮肤抗过敏功效，对过敏皮肤的保护和修复具有良好的效果。
综上所述，本发明提供了灵芝肽多糖在抑制皮肤组胺分泌作用及其相关疾病方面的应用，通过本发明实施例的研究显示，灵芝肽多糖及其主要成分对组胺分泌具有一定的抑制作用，其中800Da～15KDa水提取得到的灵芝肽多糖对组胺分泌抑制效果最为显著，对磷酸组胺致痒阈值最高(49.64±12.42μg)，且对透明质酸酶的抑制强度为40.19％，具有较强的抑制活性。同时，本发明所述的灵芝肽多糖安全无刺激、无副作用，对皮肤组胺分泌相关疾病具有一定的防治作用，可应用于制备皮肤外用组胺抑制剂及预防、治疗皮肤组胺分泌相关疾病的药物。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.灵芝肽多糖在制备皮肤组胺分泌抑制剂中的应用。
2.灵芝肽多糖在制备透明质酸酶抑制剂中的应用。
3.灵芝肽多糖在制备治疗和/或预防皮肤组胺分泌相关疾病的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述皮肤组胺分泌相关疾病为过敏性皮肤病，所述过敏性皮肤病包含以下皮肤敏感症状中的至少一种：红斑、瘙痒、烧灼和刺痛。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述灵芝肽多糖的分子量为800Da～15KDa。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述灵芝肽多糖的制备方法包括以下步骤：
S1、灵芝原料在水溶液中回流提取，过滤收集滤液；
S2、将所述步骤S1中得到的滤液进行有机膜超滤，依次经过分子量15KDa和800Da的有机膜超滤，收集得到分子量在800Da～15KDa之间的滤液即得。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述灵芝肽多糖提取自赤芝。
8.一种具有抗组胺功效的产品，其特征在于：包含灵芝肽多糖作为活性成分。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述灵芝肽多糖的分子量为800Da～15Kda。
10.根据权利要求8或9所述的产品，其特征在于：所述产品中包含以质量百分数计的2.5％～10.0％灵芝肽多糖。
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