CN107903331A - 一次性快速分离灵芝活性多糖肽与三萜酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种一次性快速分离灵芝多糖肽和灵芝三萜酸方法，该方法通过灵芝切片或粉碎用水提取，离心除去杂质及净化处理后，依据不同物质的分子量差异，选择10K、6KDa和1KDa三种不同的膜，从大到小的孔径来实现提取液中的不同成分的分级纯化，得到灵芝多糖肽和灵芝三萜酸，作为开发不同产品或对照品的目的。本发明在于直接截留灵芝不同化合物的分子量，可一次性快速分离灵芝活性成分多糖肽和灵芝三萜酸化合物等制备方法，与传统技术相比，其工艺简便、快速、产量高，又无污染，适合于工业化生产的方法。

Description

一次性快速分离灵芝活性多糖肽与三萜酸的方法
技术领域
本发明涉及一次性快速分离灵芝活性多糖肽和三萜类合的制备方法，尤其涉及膜分离分子量的技术在分离灵芝提取液中一次性得到主要活性成分的制备方法。
技术背景
灵芝是中医药学宝库中的珍品，根据《中华人民共和国药典（一部）》（2000，2005，2010年版）收载灵芝（赤芝、紫芝），作为中药材。灵芝隶属于担子菌纲，多孔菌科，灵芝属的真菌（赤芝、紫芝等的总称。在我国有两千多年的药用史，在东汉时期的《神农本草经》，明代著名的《本草纲目》均证明，灵芝有防病治病，延年益寿之功效。国内外的大量研究结果表明，灵芝具有广泛的药理活性，且毒性较低，灵芝的化学成分复杂，主要有多糖类，三萜类，生物碱，核苷类及微量元素。
国内外已有研究资料表明：灵芝主要活性成分多糖与三萜类化合物，并作为质量控制的指标。本文作者在国内外也发表有关灵芝活性研究论文和专著及专利：林志彬主编“灵芝的现代研究”第四版，北京：北京大学医学出版，2015:129～374.中国专利DL200410014681.3，灵芝多糖蛋白及其制备方法与用途。该专利发明从灵芝中获得一种高分子量GL-PP方法与用途。中国专利CN101704903A，称一种低分子灵芝多糖的制备方法，得到分子量4000～6000，它通过水提，浓缩，分级丙酮沉淀，离心干燥而成。活性天然产物的分离经典方法从早期迄今一直被采用的方法，传统的技术都是通过提取分离灵芝各类化合物，总是先醇提或水提浓缩或醇或丙酮沉淀，再通过透析法，以及经典的去离子或离子交换树脂柱后色谱法纯化等繁杂工序。
发明内容
本发明要解决灵芝复杂活性成分的提取成分的提取与分离的问题。提供一种根据化合物的分子量一次性高纯度的分离灵芝活性多糖肽与三萜酸化合物制备方法。
一种一次性快速分离灵芝活性多糖肽与灵芝三萜酸的方法，取灵芝制备液微滤后的透过液依次通过10KDa、6KDa、1KDa大小不同的孔径，从大到小截留不同分子量而得到不同分子量的透过液，实现灵芝活性多糖肽与灵芝三萜酸的分离。
秤取灵芝切片或破碎丝状物，加水12～20倍重量无离子水，在室温浸泡2～4小时，然后加热90～100℃提取1.5～2小时，过滤，滤渣用10～15倍水以同样温度提取1～1.5小时，过滤，合并二次的过滤液， 3000～4500r/min离心粗滤，取上述灵芝提取液置真空浓缩，温度65℃，真空度为-0.09～-0.097MPa，浓缩比重为1.10，获灵芝提取制备液；取灵芝提取制备液在加压条件下，通过10μm～0.2μm微孔滤膜的透过液为灵芝提取原液，提取得率为14.74%；然后将灵芝提取原液采用超滤膜进行超滤，超滤膜采用10KD，6KD和1KD，分别得到三种不同分子量的超滤液，然后将所得三种不同组的超滤液分别蒸发至干，用标准对照品经高效液相测定，确定三种分别为灵芝多糖肽，低分子灵芝多糖肽和三萜酸。
综上所述的，本发明相比现有技术如下优点：
本发明直接截留灵芝不同化合物的分子量，可一次性快速分离灵芝活性成分多糖肽和灵芝三萜酸化合物等制备方法，与传统技术相比，其工艺简便、快速、产量高，又无污染，适合于工业化生产的方法。
附图说明
图1分离灵芝各类化合物分子量工艺路线。
图2菌草灵芝提取原液中分子量GPC凝胶渗透色谱图。
图3 HPLC法测定菌草灵芝10KDa分子量GPC色谱图。
图4 HPLC法测定菌草灵芝1KDa分子量GPC色谱图。
图5 HPLC紫外检测器测定菌草灵芝三萜酸结果图。
图6灵芝三萜酸A，B ，C，D对照品标准图。
图7灵芝多糖肽含量测定标准曲线图。
图8灵芝口服液生产工艺流程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例1
（1）将灵芝切片（厚度2-3mm）或破碎丝状物，加水12～20倍重量无离子水，在室温浸泡2～4小时，然后加热90～100℃提取1.5～2小时，过滤，滤渣用10～15倍水同样温度提取1～1.5小时，过滤，合併二次的过滤液，离心粗滤（3000～4500r/min），取上述灵芝提取液置真空浓缩，温度65℃，真空间-0.09～-0.097MPa，浓缩比重为1.10，即获灵芝提取制备液。取灵芝提取制备液在圆盘过滤器为PALL型（ф150mm），蠕动泵（Masterflex L/S型）加压条件下，通过10μm～0.2μm微孔滤膜（混合纤维素脂），的透过液为灵芝提取微滤液，提取得率为14.74%。（其中灵芝提取液净化后，色谱测定灵芝提取液各组分的分子量，相对高分子量1.0×104～11×105Da，有7个级别多糖，低分子多糖为6.1×103～7.4×103Da，尚有406～978Da（见图2））。
（2）截留各化合物的分子量：灵芝提取微滤液采用切向流（TFF）直接截留分子量技术，超滤系统蠕动泵Masterflex L/S，膜夹具OSOOIT12，首先应用10DKa膜包，超滤膜为改性聚醚砜材质，工作压力0.1～0.4MPa，最大流量控制300ml/min，或选用中空纤维柱，规格：100～1400cm2；2.管道内径，规格：3.2～6.4mm；3.进口压力（Pf），规格：0.00～2000bar；4.进口流速，100～6000ml/min＠4bar；5.回流压力（Pr），0.01～10.00bar；6.输送流速，20～1000ml/min＠1bar；7.滤出流速，20～1000ml/min＠1bar；8.TMP，0.3～4.0bar。通过上述技术参数，分别收集截留相对分子质量为1.0×104以上的大分子部位其高效相图（见图3）。分子量范围3.9×104～9.2×105，提取得率3.56%。透过液加入三倍量乙醇沉淀，提取灵芝多糖肽（GL-PP）粗制品得率0.76%。其次采用6KDa膜包，分子量范围9.78×103～3.6×103，提取得率3.60%。最后用1KDa截留低分子量在500～516Da，Mn516，Mw771Da，占面积25%左右。
（3）对上述的透过液进行检测：
1. HPLC-RID测分子量
①色谱条件
色谱柱：TSKG4000PW柱（300 mm×7.86mm，10μm）；流动相：0.05%叠氮钠；流速：1 mL/min；柱温：35℃，进样体积：10μL。示差检测器检测条件：内外加热35℃；采样速率：1进样量：10μL；流速：1ml/mL；运行时间：15min；充满定量环。
②对照品的配制
精密称取不同分子量的右旋糖酐，用流动相溶解并定容配成5mg/mL。（分子量：180、4600、10000、21400、41100、84400、133800、27万、41万、67万、140万）
③待测样品溶液的制备
称取样品用流动相溶解后，过0.22 μm有机滤膜后，按色谱条件测定分子量。
2. 灵芝多糖肽含量检测方法：用HPLC-ELSD法检测，其色谱条件如下：
①仪器Warters 2515型，
②色谱柱TSK G4000PWXL柱；
流动相：甲醇∶水=20∶80
流速：1ml/min
柱温：35℃；进样量10ul；
③蒸发光检测器条件：采用Warters 2424型蒸发光检测器；漂移管温度55℃。喷雾为加热模式；气体压力为45psi；（色谱图1）
操作步骤：
1.标准曲线绘制
精密称取干燥的多糖肽对照品0.0500g（>95%，国家菌草工程技术中心）于10mL容量瓶中，用水溶解并定容，得浓度为5.00mg/mL的多糖肽标准储备液；临用前，分别取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、于5mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得浓度分别为100.0、200.0、300.0、400.0、500.0μg/mL标准工作液，以对照品浓度（μg /ml）的对数（X）为横坐标，峰面积对数（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品溶液的配制
称取灵芝产品0.2g，加水8mL后于60℃水浴提取30min，冷却，定容至10mL；过滤，取滤液1mL，加16mL无水乙醇，混匀。于10000rpm离心15min，沉淀用流动相2ml溶解，0.22μm有机滤膜过滤，得供试样品溶液备用。
3.分析结果表示:
4.色谱图（见图7）
（5）RP-HPLC 法测定灵芝酸 A、B、C2
① 色谱条件和系统适应性 色谱柱为 XB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美国 WelchMaterials公司），流动相为 0.05%磷酸-乙腈（65∶35），检测波长 254 nm，柱温 35 ℃，进样量 50 μL，体积流量 1 mL/min。理论塔板数以灵芝酸 A、B和C2 计均大于10000（色谱图见图 6）。
② 混合对照品储备液的制备 精确称取灵芝酸A对照品1.10mg、灵芝酸B对照品1.13mg和灵芝酸C21.14mg，置同一2mL量瓶中，用甲醇定容，即得灵芝酸A 0.55mg/mL、
【规格与含量】每粒重50mg内容物。每日三次，每次一粒。
B、低分子滴丸剂
【配方】灵芝低分子浸膏为脂溶性基质配方：单硬脂酸甘油脂蜂蜡，氢化油及植物油等，用水、乙醇单独或混合等，添加适量的辅料混合均匀，充分分散。
【工艺】灵芝低分子提取浸膏，直接（按配方）加入熔融的基质中，通过滴丸机，成形，固化。
【性状】本品为棕褐色的滴丸，味苦。
【功效成分】灵芝酸。
【规格】每粒40～50mg
C、图谱鉴定：取样品适量，用氯仿提取，挥干，再入适量甲醇溶解，通过过滤（0.45μm），滤液用高效液相鉴定。
图1 分离灵芝各类化合物分子量工艺路线。
图2 菌草灵芝提取原液中分子量GPC（凝胶渗透色谱图）的色谱条件：仪器高效液相色谱图仪Waters 1515；2414示差检测器，色谱柱：TSK G4000PW柱（300 mm×7.86mm，10μm）；流动相：0.05%叠氮钠；流速：1 mL/min；柱温：35℃，进样体积：10μL。示差检测器检测条件：内外加热35℃；采样速率：1；进样量：10μL；流速：1ml/mL。
GPC图示分子量1万单位以上有7个峰，占面积44.37%，1万单位以下分子量6142～7487两个峰，占面积11.37%，低分子量406～978两个峰，面积42.45%。
图3 HPLC法测定菌草灵芝10KDa分子量GPC色谱图。
GPC图示分子量1万以上有6个峰，占面积61.48%；一万单位以下6264，7831两个峰占面积10.18%，480下2个峰占面积28.35%
图4 HPLC法测定菌草灵芝1KDa分子量GPC色谱图
图5 HPLC紫外检测器测定菌草灵芝三萜酸结果图。低分子提取得率7.58%，提取固形物的灵芝酸总量6.70mg/g，其中6KDa， 2.83mg/g，10KDa，1.62mg/g。
图6 灵芝三萜酸A，B ，C，D对照品标准图。
低分子透过液蒸干后，加入甲醇溶解，过0.45μm滤膜，prep高压制备条件：Waters制备色谱柱；C18 OBDTM 5μm 19*150mm）：以乙腈-0.05%醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱，重结晶，提纯后，经高效液相色谱鉴定A、B、C对照品标准图。
图7 灵芝多糖肽含量测定标准曲线图
图8 灵芝口服液生产工艺流程。

Claims (5)

1.一种一次性快速分离灵芝活性多糖肽与三萜酸的方法，其特征在于：取灵芝制备液微滤后的透过液依次通过10KDa、6KDa、1KDa大小不同的孔径，从大到小截留不同分子量而得到不同分子量的透过液，实现灵芝活性多糖肽与灵芝三萜酸的分离。
2.根据权利要求1所述的一次性快速分离灵芝活性多糖肽与三萜酸的方法，其特征在于：秤取灵芝切片或破碎丝状物，加水12～20倍重量无离子水，在室温浸泡2~4小时，然后加热90～100℃提取1.5～2小时，过滤，滤渣用10～15倍水以同样温度提取1～1.5小时，过滤，合并二次的过滤液， 3000～4500r/min离心粗滤，取上述灵芝提取液置真空浓缩，温度65℃，真空度为-0.09～-0.097MPa，浓缩比重为1.10，获灵芝提取制备液；取灵芝提取制备液在加压条件下，通过10μm～0.2μm微孔滤膜的透过液为灵芝提取原液，提取得率为14.74%；然后将灵芝提取原液采用超滤膜进行超滤，超滤膜采用10KD，6KD和1KD，分别得到三种不同分子量的超滤液，然后将所得三种不同组的超滤液分别蒸发至干，用标准对照品经高效液相测定，确定三种分别为灵芝多糖肽，低分子灵芝多糖肽和三萜酸。
3.根据权利要求2所述的一次性快速分离灵芝活性多糖肽与三萜酸的方法，其特征在于：透过10KDa孔径膜，分子量范围为6.1×104～1.0×104，以灵芝多糖肽GL-PPSQ计44.01%，提取得率为3.56%，灵芝三萜酸总量1.62mg/g。
4.根据权利要求2所述的一次性快速分离灵芝活性多糖肽与三萜酸的方法，其特征在于：透过6KD孔径膜，分子量范围为9.78×103～3.6×103，面积为43.18%，以低分子多糖肽GL-LPP计为0.86%，另有低分子量范围8.65～183，占40.02%面积，提取得率为3.60%，灵芝三萜酸总量2.83mg/g。
5.根据权利要求2所述的一次性快速分离灵芝活性多糖肽与三萜酸的方法，其特征在于：透过1KDa孔径膜，其孔径控制在截留分子量900-400Da，其透过液得率7.58%，水提取物中的灵芝酸（灵芝酸A+灵芝酸B+灵芝酸C）总量为6.759mg/g。
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