CN105806978B - 一种用spe‑hplc测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用SPE‑HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法。其具体步骤包括：取枳实或枳壳粉末，准确称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，超声提取，放冷，摇匀，滤过，精密量取滤液减压回收至干，用水溶解，流过预先以甲醇和水平衡过的固相萃取小柱，然后依次用甲醇淋洗，用纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部分定容，微孔滤膜滤过，即得测试液；酚性化合物的测定。与现有技术相比，本发明采用SPE对样品进行了前处理，减少了杂质成分对测定的影响，而固相萃取具有操作简便、富集率高、消耗溶剂少、成本低、集提取与分离于一体等优点。此外，本法建立的色谱条件对各待检酚性化合物均有较好的分离度，且分析条件适宜。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体来说，涉及到一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法。
背景技术
枳实，中药名；属芸香科植物酸橙及栽培变种或甜橙的干燥幼果。酸橙，芸香科、柑橘属小乔木，枝叶密茂，刺多，徒长枝的刺长达8厘米。叶色浓绿，质地颇厚主产于四川、江西、福建、江苏等地。5～6月间采摘或采集自落的果实，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，较小者直接晒干或低温干燥。用时洗净、闷透，切薄片，干燥。生用或麸炒用。《药品化义》：枳实专泄胃实，开导坚结，故主中脘以治血分，疗脐腹间实满，消痰癖，祛停水，逐宿食，破结胸，通便闭。枳壳是《中国药典》收录的草药，药用来源为芸香科植物酸橙Citrusaurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。枳壳性苦、辛、酸、温，具有理气宽中、行滞消胀的功效，主治胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，胃下垂，脱肛，子官脱垂等病症。枳壳在我国多地都有生产，以湖南和江西的产品为佳。
枳实和枳壳中均含有较多的酚性化合物，如橙皮苷、圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、川陈皮素、5-去甲川陈皮素、甜橙黄酮、橘皮素、芹菜苷、野漆树苷、山奈苷、芹菜素、香叶木素、7-羟基香豆素、佛手柑内酯、佛手柑素和橙皮油素。上述酚性化合物具有良好的抗炎、抗氧化、抗癌等作用，其含量成为衡量枳实和枳壳质量的重要参考成分。由于枳实和枳壳中化学成分复杂，而上述酚性化合物的含量偏低且结构较为相似，导致在含量测定时存在较大误差。目前，对枳实和枳壳中的酚性化合物进行测定的文献较少，主要还是停留在一般的高效液相测定上，而且所检测的指标成分也较少。施学骄等曾提出星点设计-效应面法优化枳实总酚酸提取工艺，并进行了含量测定，但该法主要是针对总的酚分进行测定，没有建立对具体成分的含量测定方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法。
本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述方法具体步骤包括：
A、酚性化合物的富集：取过60目筛的枳实或枳壳粉末0.4g，准确称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50mL，超声提取30min，放冷，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL减压回收至干，用10mL水溶解，以1mL/min的流速过预先以2mL甲醇和5mL水平衡过的固相萃取小柱，然后依次用2mL30％甲醇淋洗，用10mL纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部分定容至10mL，0.22μm微孔滤膜滤过，即得测试液；
B、酚性化合物的测定：
1)色谱条件：Agilent Poroshel 120SB-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；流动相A为甲醇，B为0.1％甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序：0～4min，30％A；4～23min，30％～33％A；23～28min，33％～44％A；28～40min，44％A；40～44min，44％～63％A；44～48min，63％～65％A；48～50min，65％～73％A；50～56min，73％～96％A；柱温为30℃，流速0.6mL·min-1，检测波长：283nm，318nm，338nm；
2)对照品制备：取各种对照品，精密称定，加甲醇分别制成含橙皮苷0.136mg·mL-1、圣草次苷0.177mg·mL-11、芸香柚皮苷0.508mg·mL-1、柚皮苷0.506mg·mL-1、新橙皮苷0.260mg·mL-1、柚皮素0.204mg·mL-1、橙皮素0.316mg·mL-1、川陈皮素0.154mg·mL-1、5-去甲川陈皮素0.150mg·mL-1、甜橙黄酮0.242mg·mL-1、橘皮素0.388mg·mL-1、芹菜苷0.246mg·mL-1、野漆树苷0.405mg·mL-1、山奈苷0.186mg·mL-1、芹菜素0.115mg·mL-1、香叶木素0.326mg·mL-1、7-羟基香豆素0.146mg·mL-1、佛手柑内酯0.169mg·mL-1、佛手柑素0.135mg·mL-1、橙皮油素0.148mg·mL-1的溶液，作为对照品储备液；
3)含量测定：取供试液按上述色谱条件进行测定，并依据对照品对各对应的峰进行归属及含量计算。
本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述固相萃取小柱为Supel-Select HLB小柱，Strata-X小柱，Strata-SDB-L小柱，Strata C18-E小柱中的一种。
本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述固相萃取小柱为Strata-X小柱。
本发明所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，所述Strata-X小柱在用前先用质量浓度为1％的羟甘草黄烷酮乙醇溶液冲洗3倍量体积。
与现有技术相比，本发明所述的用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法采用SPE对样品进行了前处理，减少了杂质成分对测定的影响，而固相萃取具有操作简便、富集率高、消耗溶剂少、成本低、集提取与分离于一体等优点。此外，本法建立的色谱条件对各待检测酚性化合物均有较好的分离度，且分析条件适宜。
附图说明
图1：不同萃取小柱的回收率图；图2：穿透体积效率图；图3：甲醇浓度与洗脱效果图；图4：甲醇用量与与洗脱效果图；图5：三种品种枳实和枳壳的PCA得分图；五角星-甜橙枳实，黄方块-香橙枳实，绿色倒三角-枳壳，浅蓝色圆圈-六月份采收的酸橙枳实，深蓝色圆圈-五月份采收的酸橙枳实。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述的用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
1仪器与试剂
Agilent HP 1100系列液相色谱仪(带自动进样器)，DAD紫外检测器，ChemStation色谱工作站，Supel-Select HLB柱(美国Waters公司)，Strata-X小柱(美国Phenomenex公司)，Strata-SDB-L小柱(美国Phenomenex公司)，Strata-C18E小柱(美国Phenomenex公司)，TCQ-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)，CP225D型电子天平(德国赛多利斯公司)。
7-OH香豆素对照品(批号：MUST-14120715)、佛手柑内酯对照品(批号：MUST-14102708)均购自成都曼斯特生物科技有限公司。橙皮苷对照品(批号：K02M3C1)、柚皮苷对照品(批号：K21M4C1)、山萘苷对照品(批号：20120824)、芹菜苷对照品(批号：PJ-0603RA13)、甜橙黄酮(批号：P22D3R1)均购自上海源叶生物科技有限公司。野漆树苷对照品(批号：111919-201102)均购自中国食品药品检定研究院；芹菜素对照品(批号：1246-081013)、购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。新橙皮苷对照品、橙皮素对照品、圣草次苷对照品、芸香柚皮苷对照品(批号：MUST-13041206)、橘皮素对照品、柚皮素对照品、芦丁对照品购自天津马克生物技术有限公司。川陈皮素对照品(批号：JZ14102611)、5-去甲川陈皮素(批号：JZ15041102)、佛手柑素对照品(批号：JZ14112901)、橙皮油素对照品(批号：JZ15041110)均购自南京景竹生物科技有限公司。香叶木素对照品(批号：111788-200801)购自中国药品生物制品检定所。甲醇(色谱纯，Fisher)，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件Agilent Poroshel 120SB-C18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；流动相A为甲醇，B为0.1％甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序：0～4min，30％A；4～23min，30％～33％A；23～28min，33％～44％A；28～40min，44％A；40～44min，44％～63％A；44～48min，63％～65％A；48～50min，65％～73％A；50～56min，73％～96％A。柱温为30℃，流速0.6mL·min-1，检测波长：283nm，318nm，338nm。
2.2对照品溶液的制备分别取各种对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成含橙皮苷0.136mg·mL-1、圣草次苷0.177mg·mL-11、芸香柚皮苷0.508mg·mL-1、柚皮苷0.506mg·mL-1、新橙皮苷0.260mg·mL-1、柚皮素0.204mg·mL-1、橙皮素0.316mg·mL-1、川陈皮素0.154mg·mL-1、5-去甲川陈皮素0.150mg·mL-1、甜橙黄酮0.242mg·mL-1、橘皮素0.388mg·mL-1、芹菜苷0.246mg·mL-1、野漆树苷0.405mg·mL-1、山奈苷0.186mg·mL-1、芹菜素0.115mg·mL-1、香叶木素0.326mg·mL-1、7-羟基香豆素0.146mg·mL-1、佛手柑内酯0.169mg·mL-1、佛手柑素0.135mg·mL-1、橙皮油素0.148mg·mL-1的溶液，作为对照品储备液。其中圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素属于二氢黄酮类酚性化合物；芹菜苷、野漆树苷、山奈苷、芹菜素、香叶木素属于普通黄酮及黄酮醇类酚性化合物；甜橙黄酮、川陈皮素、5-去甲川陈皮素、橘皮素属于多甲氧基黄酮类酚性化合物；7-OH香豆素、佛手柑内酯、橙皮油素、佛手柑素属于香豆素类酚性化合物。
2.3供试品溶液的富集纯化方法
取各供试品粉末(过60目筛)约0.4g，准确称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50mL，超声提取30min，放冷，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL减压回收至干，用10mL水溶解，以1mL/min的流速过固相萃取小柱(预先以2mL甲醇和5mL水平衡)，依次用2mL30％甲醇淋洗，用10mL纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部分定容至10mL，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。
2.3.1不同填料固相萃取小柱的筛选
以Supel-Select HLB小柱，Strata-X小柱，Strata-SDB-L小柱，Strata C18-E小柱进行比较，用已知浓度的20种酚性化合物流经固相萃取柱，经HPLC分析，评价四种固相萃取小柱的萃取效果。评价时，由HPLC测定的峰面积计算回收率，以回收率作为评价固相萃取条件的指标。回收率的计算公式如下：
式中，AO为固相萃取前的试液在HPLC测定的峰面积，Ai为流经固相萃取柱后洗脱液在HPLC测定的峰面积。
四种不同填料固相萃取小柱所得的回收率结果见表1。
表1不同填料萃取小柱所得回收率
从图1看出，C18柱的回收率比较低，尤其是对于一些极性大的成分，从整体效果来看，Strata-X柱的萃取回收率最好，因此将Strata-X柱作为萃取用柱子。在前期实验中发现，Strata-X小柱在操作前先用质量浓度为1％的羟甘草黄烷酮乙醇溶液冲洗3倍量柱体积，与不处理相比，按此处理后不仅死体积减小19％，而且能使橙皮油素和佛手柑素的回收率分别提升为91％和93％，其它成分几乎不变，从而20个待分析成分的回收率整体差异性相对较小；但羟甘草黄烷酮的较难获得，建议有条件时使用。
2.3.2穿透体积考察
穿透体积是指上样后，在SPE出口流出的样品溶液中能开始检测到目标分析物的上样体积。一般意义上讲，穿透体积以内，样品中的目标分析物均被SPE吸附；穿透体积以上，则样品中的目标化合物部分被吸附，直至完全不被吸附。按照2.3.3步骤，以Strata-X柱上样，接取每1mL柱流出液，进行HPLC检测，实验结果如表2所示。
表2穿透体积每1mL柱流出液的峰面积(A)
由表2中数据可以看出，当上样量在23mL以下，没有检测到待测定成分，当上样量为24mL时，开始加测到柚皮苷和新橙皮苷，所以穿透体积为23mL。
2.3.3淋洗液及洗脱液的选择
为了最大程度的富集需要的成分，而除去极性大的杂质成分的干扰，按照实验步骤2.3.3，在淋洗阶段，取已知质量浓度的混合标准溶液进固相萃取小柱，配比不同浓度甲醇洗脱液，收集洗脱液进行HPLC测定，通过计算待测20种酚性成分的回收率来选择洗脱剂。从图2中可以看出30％的甲醇无法将所需物质洗脱，100％的甲醇基本上能完全洗脱。经色谱分析，40％的甲醇开始出现芸香柚皮苷，柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷。所以用30％的甲醇作为淋洗剂，100％的甲醇作为洗脱剂能除去杂质成分而且基本洗脱分离所需分析的物质。
2.3.4洗脱体积的选择
按照2.3的操作步骤，洗脱阶段中，分别用2，6，10，14，18，20mL甲醇洗脱，考察各种成分的洗脱率，见表3结果表明10mL 100％甲醇基本上能把所有成分均洗脱下来。
表3不同洗脱体积的洗脱回收率(％)
2.3.5固相萃取在橘属样品中的应用
取不同品种枳实样品及酸橙枳壳样品，按照优化好的固相萃取方法进行处理，并进行HPLC含量测定，得到富集后的酚性化合物，见表4，从结果可以知道，固相萃取前后酸橙总酚性化合物由52.23％上升到70.79％，上升了35.55％；香橙总酚性化合物由13.47％上升到21.00％，上升了55.87％；枳壳中酚性化合物由30.66％上升到51.66％，上升了68.48％。
表4橘属样品各成分柱前与柱后的纯度结果(％)
备注：萃取前表示没有经过固相萃取各成分占提取物的百分比，萃取后表示经过固相萃取后各成分所占提取物的百分比。
2.3.6精密度、重复性、稳定性试验
方法的精密度通过日内精密度和日间精密度测试来验证。日内精密度采用同一供试品溶液(酸橙枳壳-9)，在一日之内连续进样六次，日间精密度采用同一供试品溶液在连续三天每天进样三次。重复性采用同一样品(酸橙枳壳-9)6份，按2.3项下的方法制备供试品溶液，分别进样测定，计算含量。稳定性试验取同一供试品溶液(酸橙枳壳-9)，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定。
2.3.7加样回收率试验
取已知含量的样品(酸橙枳壳-9)9份，每份约0.2g，精密称定，分为3组，每组3份，至具塞锥形瓶中，每组分别精密加入相当于0.8,1.0,1.2倍含量的20种酚性化合物，按2.3项下的方法制备供试品溶液，分别进样测定，计算低，中，高3种浓度下的回收率。加样回收率的计算公式为：回收率(％)＝(加入标品后含量-样品含量)/加入标品量*100％。
2.4各种待测酚性化合物成分的测定
取不同批次的酸橙枳实、甜橙枳实、香橙枳实和酸橙枳壳样品，按照2.3.3供试品溶液的制备方法制备，进行HPLC测定其含量，并用SIMCA-P软件进行主成分分析。各酚性成分的含量及PCA得分图见表5和图5。该测定方法的线性关系，精密度，重复性，稳定性及回收率见表6。
表5 50种枳实及枳壳样品中20种酚性化合物的含量(mg·g-1)
‘/’:未检测到
表6分析方法的线性，精密度，重复性，稳定性，加样回收率试验
Claims (4)
1.一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括：
A、酚性化合物的富集：取过60目筛的枳实或枳壳粉末0.4 g，准确称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，超声提取30 min，放冷，摇匀，滤过，精密量取滤液25 mL减压回收至干，用10 mL 水溶解，以1 mL/min的流速过预先以2 mL甲醇和5 mL水平衡过的固相萃取小柱，然后依次用2 mL 30%甲醇淋洗，用10 mL纯甲醇洗脱，收集纯甲醇洗脱部分定容至10 mL，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试液；
B、酚性化合物的测定：
1）色谱条件：Agilent Poroshel 120 SB-C18色谱柱，4.6 mm×100 mm，2.7 μm；流动相A为甲醇，B为0. 1%甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序：0~4 min，30%A；4~23min，30%~33%A； 23~28 min，33%~44%A；28~40 min，44%A；40~44 min，44%~63%A；44~48 min，63%~65%A；48~50min，65%~73%A；50~56 min，73%~96%A；柱温为30 ℃，流速0.6 mL·min-1，检测波长：283 nm，318 nm，338 nm；
2）对照品制备：取各种对照品，精密称定，加甲醇分别制成含橙皮苷0.136 mg·mL-1、圣草次苷0.177 mg·mL-11、芸香柚皮苷0.508 mg·mL-1、柚皮苷0.506 mg·mL-1、新橙皮苷0.260 mg·mL-1、柚皮素0.204 mg·mL-1、橙皮素0.316 mg·mL-1、川陈皮素0.154 mg·mL-1、5-去甲川陈皮素0.150 mg·mL-1、甜橙黄酮0.242 mg·mL-1、橘皮素0.388 mg·mL-1、芹菜苷0.246 mg·mL-1、野漆树苷0.405 mg·mL-1、山奈苷0.186 mg·mL-1、芹菜素0.115 mg·mL-1、香叶木素0.326 mg·mL-1、7-羟基香豆素 0.146 mg·mL-1、佛手柑内酯0.169 mg·mL-1、佛手柑素0.135 mg·mL-1、橙皮油素0.148 mg·mL-1的溶液，作为对照品储备液；
3）含量测定：取供试液按上述色谱条件进行测定，并依据对照品对各对应的峰进行归属及含量计算。
2.根据权利要求1所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，其特征在于，所述固相萃取小柱为Supel-Select HLB 小柱，Strata-X小柱，Strata-SDB-L小柱或Strata C18-E小柱中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，其特征在于，所述固相萃取小柱为Strata-X小柱。
4.根据权利要求3所述的一种用SPE-HPLC测定枳实或枳壳中酚性化合物的方法，其特征在于，所述Strata-X小柱在用前先用质量浓度为1%的羟甘草黄烷酮乙醇溶液冲洗3倍量体积。
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