CN114166961B

CN114166961B - 一种测定柑桔汁产品中酚类化合物及其前处理的方法

Info

Publication number: CN114166961B
Application number: CN202111364382.2A
Authority: CN
Inventors: 李贵节; 程玉娇; 韩冷; 翟雨淋
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2041-11-17
Also published as: CN114166961A

Abstract

本发明公开了一种测定柑桔汁产品中酚类及其前处理的方法，分析方法包括以下步骤：选出成熟的柑桔果实，处理得到果汁，所述果汁经过前处理后得到样品待测；采用高分辨率HPLC串联紫外和荧光检测器检测待测样品；对检测结果进行定量和定性分析；所述酚类为酚酸类、类黄酮苷类、甲氧基黄酮类、香豆素类以及呋喃香豆素类化合物。本发明通过对果汁分部提取，即离心处理后的上清液进行固相萃取富集、离心沉淀进行溶剂萃取，两者合并后进一步浓缩，再通过四元梯度高效液相色谱分离技术，结合紫外光电二极管阵列和荧光检测技术，可同时对柑桔汁产品中含有的多种酚类进行定性、定量分析，并鉴定柑桔类产品是否存在混合掺假的情况。

Description

一种测定柑桔汁产品中酚类化合物及其前处理的方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种测定柑桔汁产品中酚类及其前处理的方法。

背景技术

柑桔是世界第一大水果，也是我国主栽水果之一，2015年我国柑桔栽培面积达251.30万公顷，产量3660.08万吨。当前，我国柑桔的种植面积和产量均为世界第一，柑桔种植在我国南方的农村经济中占有十分重要的地位。柑桔以其较高的营养价值和独特的口感风味深受人们的喜爱。柑桔中含有酚类，酚类物质具有抗炎抗氧化、抗过敏、抗癌、抗突变、抑菌等多种作用，目前对果实中酚类物质测定的研究报道较多。

目前，用HPLC法测定柑橘果实中酚类物质含量的相关研究较多，但是酚类物质包含的范围很广泛，从简单的酚酸到常见的类黄酮苷类、再到非糖基化的含氧杂环类化合物等，物理、化学性质差距很大，含量水平也相差数百倍，因此常见分析方法不能把柑桔中含有的数十种复杂酚类成分同时进行检测，并进行准确的定性和定量分析。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种测定柑桔汁产品中酚类及其前处理的方法，以至少达到能同时检测柑桔产品中复杂的多种酚类，对其进行准确的定性、定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种测定柑桔汁产品中酚类的方法，包括以下步骤：

S1、制取样品

选出成熟的柑桔果实，处理得到果汁，所述果汁经过前处理后得到样品待测；

S2、采用高分辨率HPLC分离-紫外和荧光检测待测样品

色谱条件为：色谱柱为AgilentPoroshell120EC-C8column，4.6×150mm,2.7μm，保护柱为EC-C18guardcolumn，4.6×5mm,2.7μm，流动相A为0.05%的磷酸溶液、流动相B为甲醇，流动相C为乙腈，流动相D为体积比为水：乙腈：四氢呋喃=55:20:25的混合溶液，流速为1ml/min，柱温保持在30℃；分离梯度由以下线性步骤组成：0-7min：83%流动相A，3%流动相B，2%流动相C和12%流动相D；7-8分钟：83%流动相A、3-0%流动相B、2-5%流动相C和12%流动相D；8-16分钟：83%流动相A、5%流动相C和12%流动相D；16-17分钟：83-81%流动相A、5-9%流动相C和12-10%流动相D；17-19分钟：81%流动相A、9%流动相C和10%流动相D；19-23分钟：81-79%流动相A、9-13%流动相C和10-8%流动相D；23-32分钟：79%流动相A、13%流动相C和8%流动相D；32-38分钟：79-69%流动相A、13-23%流动相C和8%流动相D；38-43分钟：69%流动相A、23-31%流动相C和8-0%流动相D；43-58分钟：69-0%流动相A、0-3%流动相B、31-97%流动相C；58-65分钟：3%流动相B和97%流动相C；65-90分钟：重新建立初始条件；

检测器设置：紫外-可见光电二极管阵列检测器设置为扫描210-400nm，并在330nm处监测紫外线响应。激发-发射荧光检测器设置为在340nm处激发，并记录340和560nm之间的发射光谱，在400、450和500nm处同时监测三个FL发射信号；

所述酚类化合物为酚酸、类黄酮苷类、甲氧基黄酮类、香豆素类和呋喃香豆素类化合物。

进一步的，所述固相萃取柱在使用前使用5毫升甲醇过柱活化，甲醇的流速为2mL/min，并用10毫升水冲洗；所述果汁采用手工或机器压榨，将选取的成熟的柑桔果实切成两半，使用布莱恩柑桔提取机进行提取得到待处理的果汁；将选取的柑桔果实去皮、去籽、去包裹果肉的后，通过厨房搅拌机进行处理，随后通过阿贝折射仪测定搅拌机处理后的果汁的白利糖度，确认柑桔果实是否成熟。本发明通过对四元梯度高效液相色谱分离技术重新设计，能一次性同时对柑桔汁中68种具有生物活性的酚类进行定性和定量分析。

一种柑桔汁产品中酚类的前处理的方法，检测样品需要进行前处理，所述前处理包括以下步骤：

S11、选取成熟柑桔果实，通过柑橘提取机提取果汁，其后将得到的果汁过80目筛网，将过筛后的果汁分配至多个15ml的离心管中，每个离心管中分装9ml的果汁，其后将离心管放入100℃的水中浸泡60s，其后将离心管快速冷冻并存储于-20℃下备用；

S12、取冻存的果汁在13362g、4℃下离心10min；

S13、其后取上清液通过Sep-Pak C-8 SPE柱，在氮气加压条件下，用4.5 mL磷酸/乙腈溶液缓慢冲洗SPE柱，随后通过氮气吹扫收集柱内残留的液体，得到含有上清液中的类黄酮苷、酚酸和其他极性分子的洗脱液，命名为F1；

S14、其后通过乙酸乙酯洗脱柱内保留的酚类物质；同时向离心后的果肉中加入乙腈，在20℃下超声5min，重复超声处理3次；其后将乙酸乙酯提取液和全部乙腈提取液合并，命名为F2；

S15、其后将F1和F2合并，置于40℃水浴中，并用氮气吹干溶剂，得到干燥提取物。其后加入少量甲醇，在超声条件为300W、20℃的超声条件下超声5分钟，使得干燥后的提取物溶解在甲醇中，并最终用甲醇定容至1.8 mL。其后通过0.20µm的过滤器过滤形成待测样品，并置于-20℃下冻存。

进一步的，所述磷酸/乙腈溶液中磷酸和乙腈的体积比为73:27，pH为5.5，洗脱速率为2mL/min。

进一步的，所述乙酸乙酯的洗脱速率为1mL/min。

本发明分别对离心后的上清液和沉淀进行单独处理，分步分别提取所述上清液和沉淀中的酚类，后将提取液混合，再进行干燥、溶解等操作形成酚类的含量浓度提升至原果汁中5倍的浓缩待测样品。其次，本发明开发了一种HPLC流动相浓度梯度，以三种有机溶剂形成四元溶剂系统，开发出一种精密高效的浓度梯度，以保证完全解析目标酚类，在65 min内使用表面多孔核壳C18柱以优异的分辨率分离目标酚类。

本发明的有益效果是：对榨取的果汁进行离心后，分别对上清液和沉淀进行提取及浓缩，得到酚类浓度提升5倍的溶液进行检测分析，在检测分析的过程中，选择了含水甲醇、乙腈以及乙腈和四氢呋喃混合溶液作为流动相，开创了一种新的、精密的反相HPLC浓度梯度，使得C18柱能够以优异的分辨率在短时间内同时对多达68种酚类物质进行分离；能够更全面的分析、更综合完整的获得柑桔汁中具有生物活性的酚类物质的信息；利用分析结果建立判别模型，通过全面的酚类物质大数据有效识别柑桔汁混合掺假情况。

附图说明

图1为68种酚类标准物质和柠檬果汁所含酚类物质高效分离的液相色谱图；

图2为68种酚类物质中柑桔汁所特有的37种重要酚类物质在六大类柑桔品种中的分布热图；

图3为利用酚类物质建立橙汁和桔汁混合掺假的判别模型。

具体实施方式

下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1

六大类柑桔果汁中酚类物质的提取、分离、鉴定和含量分析

1试剂与仪器

1.1试剂：烷基芳基烷酮：苯乙酮、苯丙酮、苯丁酮、苯戊酮、苯己酮、苯庚酮和苯辛酮购自SigmaAldrich（美国圣路易斯）。所有溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯等均为购自霍尼韦尔（美国莫里斯平原）、西格玛·奥尔德里奇（美国圣路易斯）、光复精细化工（中国天津）和科隆化学（中国成都），都为HPLC级纯度。超纯水采用Milli-QplusAdvantageA10系统生产（法国莫尔谢姆）。

1.2仪器：博朗旋转榨汁机（德国法兰克福），美的料理机（中国顺德），ContechCAR-02阿贝折射计（印度门拜），梅特勒-托利多FiveEasyPlus pH计（中国上海），沃特世Sep-PakC-8固相萃取柱（美国米尔福德），拜泰齐Pressure+48正压固相萃取系统（英国加的夫），安捷伦1260 HPLC系统（德国瓦尔德布隆）。

1.3酚类标准物质

68种酚类物质分别为：1没食子酸、2新绿原酸、3原儿茶酸、4绿原酸、5隐绿原酸、6香草酸、7龙胆酸、8咖啡酸、9 3,4-二咖啡酰奎尼酸、10介子酸、11对香豆酸、12阿魏酸、13圣草次苷、14芦丁、15新圣草次苷、16芸香柚皮苷、17橙皮苷、18异野漆树苷、19地奥司明、20柚皮苷、21新橙皮苷、22野漆树苷、23 3,5-二咖啡酰奎尼酸、24迷迭香酸、25 4,5-二咖啡酰奎尼酸、26新地奥司明、27桂皮酸、28香蜂草苷、29枸橘苷、30东莨菪亭、31伞形花内酯、32槲皮素、33橙皮素、34脱肠草素、35白芷属脑、36水合橙皮内酯、37佛手酚、38水合氧化前胡素、39白当归素、40柠檬油素、41佛手柑内酯、42酸橙素烯醇、43独活素、44橙皮内酯、45异橙皮内酯、46异甜橙黄酮、47白当归脑、48甜橙黄酮、49氧化前胡素、50马尔敏、51栎草亭六甲醚、52异野黄芩素四甲醚、53川陈皮素、54野黄芩素四甲醚、55七甲氧基黄酮、56二羟基佛手柑素、57橘皮素、58去甲川陈皮素、59欧前胡素、60珊瑚菜素、61去甲橘皮素、62蛇床子素、63异欧前胡素、64环氧佛手柑素、65 8-香叶氧基补骨脂素、66橙皮油素、67佛手柑素、68 5-香叶氧基-7-甲氧基香豆素。其中，1~12、23~25和27等16种物质为酚酸类成分，13~22、26、28和29等13种物质为类黄酮苷类成分，30、31、34、36、40、42、44、45、50、62、66和68等12种物质为香豆素类成分，35、37~39、41、43、47、49、56、59、60、63-65和67等15种物质为呋喃香豆素类成分，32、33、46、48、51~55、57、58和61等12种物质为甲氧基黄酮类成分。上述物质分别购自TRC（加拿大多伦多）、ChromaDex（美国欧文）、源叶生物科技（中国上海）、普瑞法科技（中国成都）和西格玛公司（美国圣路易斯）。

2待检样品的制备

2.1样品的选择

选择68批次甜橙、40批次桔子、17批次葡萄柚、36批次柚子、9批次柠檬、3批次青柠的成熟柑桔果实作为样品；

2.2样品预处理

样品的预处理包括以下步骤：

S11、将样品切成两半，通过榨汁机提取果汁，其后将得到的果汁过80目筛网，将过筛后的果汁分配至多个15ml的离心管中，每个离心管中分装9ml的果汁，其后将离心管放入100℃的水中浸泡60s，其后将离心管快速冷冻并存储于-20℃下备用；

S12、取冻存的果汁在13362g、4℃下离心10min；

S13、其后取上清液通过Sep-Pak C-8 SPE柱，在氮气加压条件下，用4.5 mL磷酸/乙腈溶液缓慢冲洗SPE柱，随后通过氮气吹扫收集柱内残留的液体，得到含有上清液中的类黄酮苷、酚酸和其他极性分子的洗脱液，命名为F1；其后通过乙酸乙酯洗脱柱内保留的酚类物质；同时向离心后的果肉中加入乙腈，在20℃下超声5min，重复超声处理3次；其后将乙酸乙酯提取液和全部乙腈提取液合并，命名为F2；其后将F1和F2合并；

S14、其后将合并的提取液在温度为40℃下的氮气流中干燥，其后加入甲醇，在超声条件为300W、20-40℃的超声条件下超声5分钟，并用甲醇定容至1.8mL，其后通过0.20µm的过滤器过滤形成待测样品，并置于-20℃下冻存。

3对预处理后的待测样品进行高效液相色谱分析

色谱条件：

色谱柱为AgilentPoroshell120EC-C8column(4.6×150mm,2.7μm)，保护柱为EC-C18guardcolumn(4.6×5mm,2.7μm)，流动相A为0.05%的磷酸溶液、流动相B为甲醇，流动相C为乙腈，流动相D为体积比为水：乙腈：四氢呋喃=55:20:25的混合溶液，流速为1ml/min，柱温保持在30℃；流动相配比及洗脱时间见表3，50分钟后，溶剂组分立即恢复初始条件，并保持25分钟以重新平衡色谱柱。

采用安捷伦1260 HPLC系统，PDA设置为扫描210-400nm，并在330、284、270、250 nm处监测紫外线信号。FLD设置为在340nm激发，并记录340-560nm范围内的发射光谱。在400、450和500nm处同时监测三个FL发射信号。

表1

4保留指数计算

在液相色谱中运行一系列烷基芳基酮（C8-C14），并使用vanDenDool和Kratz保留指数方程（vanDenDool&Dec.Kratz，1963）测定每个OHCs的保留指数（RI），

RI=100z+100

，其中z为碳原子数，t_R(x)为待测物质的保留时间，t_R(z)为紧邻待测物质前流出的烷基芳基酮的保留时间，t_R(z+1)为紧邻待测物质后流出的烷基芳基酮的保留时间。

5酚类化合物的鉴定

通过光谱和色谱信息的组合用于酚类物质的鉴定。测定每种标准化合物的紫外光谱和荧光发射光谱，并在自建库中编译。通过使用安捷伦OpenLAB CDS ChemStation软件（美国圣克拉拉）检查样品峰与标准峰的一致性程度，使用整个光谱来确认峰特性和纯度。将保留指数值与相应标准物质进行比较，以进一步确保鉴定的准确性。

6酚类化合物标准曲线的绘制

准确称取68种酚类标准物质各1 mg，分别溶于1 mL甲醇或二甲基甲酰胺中，得到1mg/mL储备液。将储备液梯级稀释，按照S2中所示方法用HPLC检测，得到各物质不同浓度对应的峰面积，做线性拟合，得到各物质的标准曲线。

7果汁样品中酚类化合物的定量分析

将样品中鉴定出的酚类物质的峰面积代入对应标准曲线中，计算该物质的浓度。

8统计分析

所有样品做3个平行检测，结果以“均值±标准偏差”表示。显著性分析采用SPSS22（IBM）进行处理。

结果与讨论：

1柑桔果汁中酚类物质的色谱分离和定性分析

结果如图1所示。图1A展示了68种酚类标准物质通过HPLC分离的情况。如图可知，68种酚类物质基本实现完全分离（分辨率≥1.5），仅有3,4-二咖啡酰奎尼酸和芥子酸（9,10）、新橙皮苷和野漆树苷（21, 22）、异橙皮内酯和异甜橙黄酮（45, 46）以及甜橙黄酮和氧化前胡素（48,49）未能实现基线分离。

将样品色谱峰与酚类标准物质进行对比，计算两者的全紫外光谱、全荧光光谱以及保留指数（RI）的匹配程度。只有当全紫外和全荧光光谱匹配度均≥90%，且保留指数匹配度≥99%时，才能确认样品峰对应于某个酚类物质。图1B展示了按照这一原则确定的沃尔卡默柠檬果汁中酚类物质的定性分析结果（仅显示紫外响应，荧光响应略）。共鉴定出40种酚类物质，其中30东莨菪亭、36水合橙皮内酯、48甜橙黄酮、52异野黄芩素四甲醚、54野黄芩素四甲醚、55七甲氧基黄酮、58去甲川陈皮素等7种酚类成分首次在柠檬汁中检出。此外，对于橙汁、桔汁、西柚汁、柚子汁和青柠汁，利用该方法较之以前的文献报道^[1-11]多检测出7、10、12、6和4种酚类物质。基于上述结果可知，本发明大大扩展了6大类柑桔果汁所含酚类物质的检测数量，对于全面掌握柑桔果汁酚类物质的组成起了重要的促进作用。本示例中获取的更详尽的酚类物质组成信息，对研究来自果汁的特定酚类物质与其潜在健康作用的相关性提供了分子基础。

2酚类物质定量分析的线性方程和准确性分析

以二极管阵列检测器对酚类物质紫外信号的检测为例，68种酚类物质的定量方程、线性范围和相关系数、检出限和定量限以及校正因子如表2所示：

续表：

由表2可知，本定量分析方法具有极高的相关系数，所有酚类物质R²≥0.9994，定量限（LOQ）≤3.20 mg/L，具有优良的分析精度。随机选择10个样品进行回收率计算，结果表明，所有酚类物质的回收率在87%和109%之间，说明前处理方法对果汁中酚类物质的提取完全，方法的整体可信度高。

3柑桔果汁中重要酚类物质的定量分析结果

68种酚类中，编号为30、31、34-68的物质为柑桔中所特有的重要酚类物质。采用前一节中所述定量分析方法对橙汁、桔汁、西柚汁、柚子汁、柠檬汁和青柠汁共6大类51个品种173个样品进行定量检测，得到这些柑桔汁样品中上述重要酚类物质的含量。由于不同品种间的样本差异巨大，很难通过直接比较得出重要酚类物质的组成和分布特征，因此对所有品种的各酚类物质定量结果进行标准化处理（即归一化），并以热图的形式展示（图2）。每种酚类物质的最高含量设定为1.0，颜色最深；含量越低，颜色越浅，含量为0时显示为白色。图中左侧标注柑桔汁大类和各类中的不同品种，其中柠檬和青柠较为相似，因而归为一个大类。顶部标注为柑桔汁中重要的酚类物质编号，与表2中号码一致，共37种物质。

如图2所示，位于左上部区域的橙汁和桔汁的重要酚类物质组成较为相似，都包括含量较高的48、54、55、53、57、58、46和52等物质。然而，两类果汁中这些共有酚类物质的相对含量不同，橙汁中48、54和55相对含量更高，桔汁中55、53、57、58、46和52相对含量较高。此外，橙汁还含有1种特有的酚类物质51，桔汁也含有1种特有酚类物质61，两者相对含量都较高。

葡萄柚汁和柚子汁的重要酚类物质位于图2的中下部，它们的组成也较为相似，主要共有成分包括49、45、36、37、42、43、50、62、66、67、30、31、64、38、56、47、63、40等近20种酚类物质。葡萄柚汁中的重要酚类物质总相对含量高于柚子汁，表现为前者的深色块数量和颜色深度都大于后者。此外，与橙汁和桔汁的差异相似，两类果汁共有酚类物质的分布比重也有所不同，葡萄柚汁中49~56（编号按图中显示的顺序排列）相对含量较高，而柚子汁中66~47及40相对含量较高。葡萄柚汁还含有中等浓度的55~61，这些成分是橙汁和桔汁的重要酚类物质，显示出葡萄柚与橙和桔的亲缘关系；相对的，柚子汁中则几乎不含这些物质。

柠檬和青柠果汁中的共有重要酚类物质主要有38、65、39、40、41、60、68等，位于图中右下角。由于两类果汁间的重要酚类物质差异不显著，故将两者归于同一大类中。

综上：本发明分别对离心后的上清液和沉淀进行单独处理，分步分别提取所述上清液和沉淀中的酚类，后将提取液混合，再进行干燥、溶解等操作形成酚类的含量浓度提升至原果汁中5倍的浓缩待测样品。新开发了一种反相HPLC流动相浓度梯度，以三种有机溶剂形成四元溶剂系统，以保证完全解析目标酚类，结合光电二极管阵列和荧光检测技术，以优异的分辨率在65分钟内同时对多达68种柑桔果汁酚类物质进行分离和鉴定，同时实现准确的定量分析。该方法能够更全面综合的获得柑桔汁中具有生物活性的酚类物质信息，从而为更准确、更全面的评价柑桔果汁的健康作用和保健功能提供重要的参考。利用本发明方法对六大类柑桔汁中的重要酚类物质差异研究发现，橙汁和桔汁重要酚类物质组成相近但相对含量有显著差异，葡萄柚汁和柚子汁也有类似区别，柠檬汁和青柠汁差异不显著。重要酚类物质的差异可用于区分橙汁和桔汁，以及葡萄柚汁和柚子汁。

实施例2

利用重要酚类物质信息鉴别向橙汁中掺入桔汁的造假

1试剂与仪器：同实施例1。

2待检样品的制备

2.1样品的选择

购买10个品种的甜橙果实以及15个品种的桔子果实作为待检样品，果实均已成熟。

2.2样品的前处理

样品的预处理步骤同实施例1。

3对前处理后的待测样品进行高效液相色谱分析

色谱条件以及鉴定和定量分析方法同实施例1。

4统计分析和掺假鉴别方法

所有样品做3个平行检测，结果以“均值±标准偏差”表示。显著性分析采用SPSS22（IBM）进行处理。用于构建鉴别模型的重要酚类物质含量数据来自实施例1中的65个橙汁样品和40个桔汁样品。使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)在The Unscrambler X10.4（Camo，Norway）软件上进行多元统计分析。

结果、分析与讨论

在全世界范围内柑桔类果汁掺假最常见的做法是向高价值的果汁中掺入价格低廉的柑桔汁，如向橙汁中加入桔汁，以谋求不当获利。为规范果汁市场，中国、美国和欧盟相关食品法规规定，允许向橙汁中加入最多不超过10%（体积分数或固形物含量）的桔汁以调整产品的色泽和口感，此情况下产品标签中的“品名项”仍可标注为“橙汁”，但需在成分目录中注明桔汁的添加量。如超过10%添加，则产品只能称为混合果汁。虽有法规限制，但由于橙汁和桔汁在外观和基础物性上的相似性较高，10%的添加量较小，当前还缺乏灵敏、可靠的分析手段来判定添加量是否超标。本发明通过对橙汁和桔汁中酚类物质的精确分析，获得了两类果汁中重要酚类物质的组成和浓度信息（见实施例1），本例中进一步通过对这些信息的筛选和统计分析，建立橙汁和桔汁的重要酚类物质判别模型，可快速实现对未知检测样品中桔汁添加比例的初步判定，从而提供一种新的判别方法。具体过程和结果如下：

1重要酚类物质的筛选

实施例1图2中显示了橙汁和桔汁中的重要酚类物质。本实施例中，将利用这些物质在橙汁和桔汁中的含量差异来区分两类柑桔果汁。根据多元统计学原理，应选取共有重要酚类中差异显著的物质作为建立模型的初始变量。分析48、54、55、53、57、58、46和52共8个共有酚类物质，除55在两类果汁中含量无显著性差异外，其它7个物质均存在显著性差异，故筛选出这7个物质作为初始变量。

2变量缩减

为进一步找出对橙汁和桔汁差异性贡献最大的关键变量（即关键酚类物质），对实施例1中65个橙汁和40个桔汁样品中上述7个初始变量的含量数据作进一步分析和处理。该数据集构成105（样品总数）×7（变量数）的矩阵，对其采用偏最小二乘法（PLS）回归分析，并应用完全交叉验证（cross validation）和马氏不确定度检验（Marten’s uncertaintytest）。结果如图3A所示。尽管在PLS模型中，所有7个重要酚类物质都具有较高的相关负荷（correlation loadings, R²>0.9），但它们的稳定性存在差异。图中放大显示了所有子模型中稳定性差异的平方和，每个子模型越汇聚，变量的不确定性就越小。如图可知，酚类物质46、57和48的汇聚程度更高，稳定性也更高。图3A右下角的加权回归系数分析进一步验证了上述结果。48的回归系数恒大于0，表示对橙汁有显著贡献；46和57的回归系数恒小于0，表明对桔汁有显著贡献。而52、53、54和58的回归系数误差线穿过Y坐标的零线，表明其对两类果汁的贡献均不显著。因此，通过上述变量缩减得出48是代表橙汁特征的关键变量，46和57是代表桔汁特征的关键变量。

3判别模型的构建

利用橙汁和桔汁中三个关键变量的浓度数据构建训练集。以5%、10%和20%的桔汁添加百分比建立训练集，其对应的橙汁纯度95%、90%和80%设定为Y。通过两类果汁中来自不同产区的各品种的穷举组合由两个果汁组中来自不同产区的每个可用品种的所有收获年平均值组成。，构成的数据集包括912份混合果汁样品，每种纯度的混合果汁样品304份，同时将纯橙汁（Y=100%）和纯桔汁（Y=0%）样品也被放入训练集中。采用完全交叉验证建立PLS判别模型，结果如图3B所示。PLS潜在变量数（即图中的因子-1、2、3）为3个，在这个三维空间中，随着橙汁纯度自下而上的增加，其混合果汁呈现良好的分层汇聚。每个纯度的混合果汁样品集合与其相邻集合的分离度较好，但各集合之间并没有明确的界限，少数样本可能会突出到相邻集合中。这主要是由于桔汁样品的空间分布较为分散（纯度为0%的桔汁分布在椭圆形标出的大范围内）。桔子丰富的种质多样性导致了包括酚类物质在内的次生代谢产物的巨大差异，因此随着混合果汁中桔汁添加量的增加，混合果汁将表现出更高的分散性，如80%纯度的混合果汁集合比95%纯度的集合更松散。总的来说，模型显示纯度为90%的样品集合与纯度100%的样品完全分离，因此该模型能够区分添加10%桔汁的混合果汁，从而实现对法律规定的橙汁最高添加量的判定。

4应用模型进行未知样品的预测和验证

将本实施例2中购买的10个甜橙品种和15个桔子品种的果汁用于评估判别模型处理未知样本的预测能力。对这些新果汁样品进行相应的前处理和酚类物质的分析，收集关键酚类物质46、48和57的含量数据，按照与训练集相同的方法建立外部测试集。外部测试集中包括25个纯果汁、150个95%纯度的混合果汁、150个90%纯度混合果汁以及150个80%纯度混合果汁的数据，总样本数为475个。使本发明中开发的判别模型预测每个样本的纯度，并与实际纯度进行比较，以验证判别模型的准确度和稳健性。

判别模型的预测准确度通过RMSEP（预测均方根误差）进行评价，其含义是综合各样本的平均误差以分析预测值与实际数据的拟合程度。图3C显示，RMSEP约为4.69，接近于训练集的RMSECV（交叉验证均方根误差）值3.88，表明判别模型对外部测试样品预测值的误差与模型本身误差接近。回归模型的皮尔逊平方相关系数（R²）在外部测试集中为0.924，在训练集中为0.960。RMSE和R²等关键参数在预测集和交叉验证集之间的一致性表明回归模型是准确稳健的。

图3D显示了外部测试集的预测纯度与实际纯度（参考值Ref）的关系。图中右上角，绝大部分纯橙汁（Ref=100%）的预测纯度为96%~101%，两者高度吻合，只有特罗维塔橙汁（购买的柑桔样品中的一种）的预测值偏高，为105%。特罗维塔甜橙是华盛顿脐橙的实生驯化株，可能与普通甜橙存在一定的遗传差异，导致关键酚类物质含量略微不同，因此其数据样本是离群的异常值，其对应的混合果汁样本也被视为异常值。与甜橙相比，桔子不同品种间的差异性更大。如图3D右下角所示，不同品种的桔汁换算成橙汁纯度，其预测值在-34%至40%之间。以预测纯度为40%的南丰蜜桔为例，它将实际纯度80%混合果汁的预测值上限从85%提高到88%，几乎达到90%的参考线。与之类似地，只有当预测纯度高于94%时才能保证混合果汁的实际浓度达到90%及以上，因此判别过量添加的假阳性率可能会增加。

在开发食品真伪鉴别方法的实践中，判别分析面临的主要问题是样本类群并没有完全明确的界限。本发明也存在类似的不足。但利用本发明开发的前处理和分析方法以及判别模型，仅需检测最关键的3个酚类物质，就能基本实现对橙汁中是否超量（>10%）添加桔汁的快速鉴定。根据上述预测和验证研究结果，按照如下规程和标准进行橙汁中是否超量添加桔汁的判断：

（1）如果送检橙汁产品的预测纯度不低于94%，则其中加入的桔汁比例未超标（≤10%），该产品可用 “橙汁”作为商品名。

（2）如果送检果汁产品的预测纯度低于82%，则其中掺入的桔汁比例超标（>10%），该产品只能以“混合果汁”为商品名。

（3）如果送检果汁产品的预测纯度在82%~94%之间，则需要其它分析方法来进一步检测其中桔汁的添加比例是否超标。

综上，本实施例展示了利用柑桔汁酚类成分开发判别模型初步实现对橙汁中是否过量添加桔汁而造假的快速鉴别。本发明首先对橙汁和桔汁中的重要酚类物质进行筛选，再通过PLS分析进一步获取其中3个关键酚类物质变量，并以此建立回归判别模型，使用最少数量的关键酚类物质变量来判定橙汁中添加桔汁的比例。该发明具有快速、准确和稳健的特点，能够初步鉴别桔汁是否超量添加（>10%）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种测定柑桔汁产品中酚类的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制取样品

所述前处理包括以下步骤：

S11、选取成熟柑桔果实，通过柑橘提取机提取果汁，其后将得到的果汁过80目筛网精滤，所得精滤果汁快速冷冻并存储于-20℃下备用，或精滤果汁先经95℃巴氏灭菌30秒，再冻存于-20℃备用；

S12、取冻存的果汁在13362g、4℃下离心10min；

S14、其后将合并的提取液在温度为40℃下的氮气流中干燥，其后加入甲醇，在超声条件为300W、20-40℃的超声条件下超声5分钟，并用甲醇定容至1.8mL，其后通过0.20µm的过滤器过滤形成待测样品，并置于-20℃下冻存；

S2、采用高分辨率HPLC分离待测样品成分-紫外和荧光检测各成分

检测器设置：紫外-可见光电二极管阵列检测器设置为扫描210-400nm，并在330、284、270、250 nm处监测紫外线响应，激发-发射荧光检测器设置为在340nm处激发，并记录340和560nm之间的发射光谱，在400、450和500nm处同时监测三个FL发射信号；

所述酚类为酚酸、类黄酮苷、甲氧基黄酮、香豆素、呋喃香豆素类化合物；

所述酚类为68种酚类物质，分别为：1没食子酸、2新绿原酸、3原儿茶酸、4绿原酸、5隐绿原酸、6香草酸、7龙胆酸、8咖啡酸、9 3,4-二咖啡酰奎尼酸、10介子酸、11对香豆酸、12阿魏酸、13圣草次苷、14芦丁、15新圣草次苷、16芸香柚皮苷、17橙皮苷、18异野漆树苷、19地奥司明、20柚皮苷、21新橙皮苷、22野漆树苷、23 3,5-二咖啡酰奎尼酸、24迷迭香酸、25 4,5-二咖啡酰奎尼酸、26新地奥司明、27桂皮酸、28香蜂草苷、29枸橘苷、30东莨菪亭、31伞形花内酯、32槲皮素、33橙皮素、34脱肠草素、35白芷属脑、36水合橙皮内酯、37佛手酚、38水合氧化前胡素、39白当归素、40柠檬油素、41佛手柑内酯、42酸橙素烯醇、43独活素、44橙皮内酯、45异橙皮内酯、46异甜橙黄酮、47白当归脑、48甜橙黄酮、49氧化前胡素、50马尔敏、51栎草亭六甲醚、52异野黄芩素四甲醚、53川陈皮素、54野黄芩素四甲醚、55七甲氧基黄酮、56二羟基佛手柑素、57橘皮素、58去甲川陈皮素、59欧前胡素、60珊瑚菜素、61去甲橘皮素、62蛇床子素、63异欧前胡素、64环氧佛手柑素、65 8-香叶氧基补骨脂素、66橙皮油素、67佛手柑素、685-香叶氧基-7-甲氧基香豆素。

2.根据权利要求1所述的一种测定柑桔汁产品中酚类的方法，其特征在于：所述磷酸/乙腈溶液中磷酸和乙腈的体积比为73:27，pH为5.5，洗脱速率为2mL/min。

3.根据权利要求1所述的一种测定柑桔汁产品中酚类的方法，其特征在于：所述乙酸乙酯的洗脱速率为1mL/min。