CN104587014A - 一种提取中药枳壳中黄酮类有效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取中药枳壳中的黄酮类有效成分的方法：取枳壳药材粉末和弗罗里硅土，以质量比1:1～4混合，加入研钵中研磨；取固相萃取柱，固相萃取柱的底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的固相萃取柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入固相萃取柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液；所述洗脱剂为浓度150～300mmol/L的离子液体水溶液。本发明采用离子液作为洗脱剂，结合基质固相分散萃取技术，能高效、环保地提取和检测枳壳药材中的黄酮类有效成分。

Description

一种提取中药枳壳中黄酮类有效成分的方法

技术领域

本发明属于天然药物提取检测领域。它涉及一种中药的微量提取方法，具体地说，它涉及由离子液体作为洗脱剂，结合微量基质固相分散萃取技术，用来提取中药枳壳中黄酮类有效成分的新方法。

背景技术

枳壳(Fructus aurantii)为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果。性温，味苦、辛、酸，性微寒，归脾胃经。具有理气宽中行滞消胀之功效，主治胸肋气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停及胃下垂，脱肛，子宫脱垂等。现代研究表明，枳壳中主要含有挥发油、黄酮类、生物碱类成分。黄酮类成分是评价枳壳饮片质量的主要指标，包括新圣草苷、异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及新枸桔苷等，其中又以新橙皮苷和柚皮苷含量最大。

目前，对中药进行提取分析的方法层出不穷。通常采用的提取方法包括超声回流法、索氏提取法等，这一类方法存在的缺陷也是显而易见：实验过程中使用有毒害的有机溶剂且用量较大，提取所用时间漫长，提取效率低下，对实验操作人员身体有害，对环境污染严重，背离“绿色化学”的倡议。

近年发展起来各种样品预处理技术，固相萃取(Solid-Phase Extraction，简称SPE)作为具有代表性的一种，广泛地应用在食品、环境、医药、化工、商检等领域。随着科技的发展，诸多建立在SPE基础上的新型提取方法，也随之应运而生。

基质固相分散萃取(MSPD)是建立在固相萃取基础上的一种新型样品处理技术，为近年来国内外研究的一个热门领域。与传统的SPE不同，MSPD是将样品与固相吸附剂直接混合研磨，将样品研磨成为微小的碎片分散在固相吸附剂中，然后将此混合物填入固相萃取柱，用适当的溶剂将目标化合物洗脱下来。

当前文献报道的基质固相分散萃取技术，特别是针对天然产物领域，其吸附剂的量、药材用量和以及洗脱剂的用量较大，且为有毒害的有机溶剂，对操作员的身体有害，对环境又会造成污染。作为近年来研究热点之一的环境友好型溶剂——离子液体，是传统有毒有机溶剂的理想替代品。目前，国内外已有一些将离子液体用于萃取分离的报道。

截止目前，以离子液体作为洗脱剂，并结合基质固相分散萃取技术，在中药的活性成分提取检测方面尚未见报道，该方法对于中药枳壳的提取检测这一研究领域更是一片空白。

发明内容

本发明的目的在于寻求一种比常规方法更加绿色环保的中药提取检测技术，使其应用于枳壳药材提取检测。发明要点在于创造性地将离子液作为洗脱剂，应用在基质固相分散萃取领域。离子液作为基质固相分散萃取的洗脱剂与基质固相分散混合物中的目标分子吸附结合，从而使得目标分子从吸附剂中解吸出来，得到含有目标分子的洗脱液。且本发明在一个微量体系中实施，所用药材以及实验药品试剂均在微克级别。另外，本实验所用的洗脱液为离子液的水溶液，相比药典的提取方法使用甲醇作为提取液，本发明的有机溶剂使用量为零，使得本发明所述实验流程中不含任何有毒有害的有机溶剂，对实验操作员和外界环境的毒害作用降低到零。

本发明具体提供了一种以离子液体作为洗脱剂，结合基质固相分散萃取技术，提取微量中药药材中目标分子的方法。可用于提取检测微量枳壳药材中的黄酮类有效成分。

本发明采用的技术方案是：

一种提取中药枳壳中黄酮类有效成分的方法，所述黄酮类有效成分为新橙皮苷、柚皮苷中的一种或两种，所述方法包括以下步骤：

取枳壳药材粉末和弗罗里硅土，以质量比1:1～4混合，加入研钵中研磨，得研磨后的固体混合物；取固相萃取柱，固相萃取柱的底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的固相萃取柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入固相萃取柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液；

所述洗脱剂为浓度150～300mmol/L的离子液体水溶液；

本发明所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、溴化1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、溴化1-己基-3-甲基咪唑或1-己基吡啶四氟硼酸盐，优选为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。

本发明所述离子液均可于市场上直接购买获得，本发明实施例中所用的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐购于Alfa Aesar公司。

本发明所述离子液体水溶液中离子液体的浓度为150～300mmol/L，优选为250mmol/L。

所述枳壳药材粉末和弗罗里硅土的质量比为1:1～4，优选1:3。

所述研磨的时间为0.5～1.25min，优选为1min。

本发明所述离子液体水溶液的体积用量优选以枳壳药材粉末的质量计为0.006～0.012mL/mg，优选为0.008mL/mg。

所述固相萃取柱有不同体积规格，根据枳壳药材粉末和弗罗里硅土研磨后固体混合物的体积量来选择合适体积的固相萃取柱即可，这是本领域技术人员公知的。

所述离心优选在13000rpmin离心5min。

进一步，本发明方法针对微量样品，优选按以下步骤操作：

称取枳壳药材粉末50mg，按照质量比1:3称取弗罗里硅土150mg，加入研钵中研磨1min，得研磨后的固体混合物；取3mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，量取0.4mL的浓度250mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的水溶液，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液。

本发明可通过超高效液相色谱仪(UPLC)测定枳壳药材中有效成分的含量来表征该基质固相分散萃取方法的有效性。

本发明制得的黄酮类有效成分提取液可用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析，得到黄酮类有效成分提取液的液相色谱图；

然后以新橙皮苷的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照黄酮类有效成分提取液的同样条件用超高效液相色谱仪检测，获得新橙皮苷对照品的液相色谱图，以新橙皮苷对照品的进样量为横坐标，以新橙皮苷对照品的液相色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，制作新橙皮苷素标准曲线，按同样方法制作柚皮苷标准曲线；根据黄酮类有效成分提取液的液相色谱图中各色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到黄酮类有效成分提取液中新橙皮苷、柚皮苷的含量，可相应换算得到提取的新橙皮苷、柚皮苷相对于枳壳药材粉末的含量。

因此本发明方法可用于检测微量的枳壳药材粉末中的黄酮类有效成分含量，具体的，所述方法为：

称取枳壳药材粉末50mg，按照质量比1:3称取弗罗里硅土150mg，加入研钵中研磨1min，得研磨后的固体混合物；取3mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，量取0.4mL的浓度250mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的水溶液，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液；黄酮类有效成分提取液用超高效液相色谱仪采样分析，得到黄酮类有效成分提取液的液相色谱图；

然后以新橙皮苷的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照黄酮类有效成分提取液的同样条件用超高效液相色谱仪检测，获得新橙皮苷对照品的液相色谱图，以新橙皮苷对照品的进样量为横坐标，以新橙皮苷对照品的液相色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，制作新橙皮苷素标准曲线，按同样方法制作柚皮苷标准曲线；根据黄酮类有效成分提取液的液相色谱图中各色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到黄酮类有效成分提取液中新橙皮苷、柚皮苷的含量，可相应换算得到提取的新橙皮苷、柚皮苷相对于枳壳药材粉末的含量。

本发明检测微量的枳壳药材粉末中的黄酮类有效成分的检测限可达新橙皮苷0.0499ng，柚皮苷0.0560ng，对微量样品具有很好的提取检测效果。

本发明的优点在于：

1.本发明方法属首次以离子液体作为洗脱剂应用在基质固相分散萃取领域，具有独创性，在国内外的期刊专利中，均未报道使用离子液体作为洗脱剂的案例，并且将该方案应用到天然产物(中药枳壳)的提取检测中，亦属首例。

2.本方法采用了微量体系下进行提取检测，采用的药材、吸附剂、洗脱剂的用量极低，且安全环保无污染。中国药典常规的提取方法为：取本品粗粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。相比药典的提取方法，本发明的方法使用的有机溶剂为零，这就使得该技术方案对操作人员的毒害降低至零，对环境的污染也降低至零。并且本发明所得提取液中有效成分的含量远远高于药典的提取方法，提取效率更高。

3.本发明所述的离子液体，具备一系列优异突出的的物理化学性质：首先是对人体和环境的无毒害、无污染，完全符合“绿色化学”所倡导的概念，且离子液本身化学稳定性和热稳定性良好，对人体无毒、不污染环境，不燃，使得操作人员的实验环境安全可靠。

4.本发明提供的操作环境安全，操作步骤简洁明了，实验效率高，操作人员无需专业培训即可开展操作。

即本发明创造性地提供了一种中药的微量提取方法，该方法采用离子液体作为洗脱剂，结合基质固相分散萃取技术，能高效、环保地提取和检测枳壳药材中的黄酮类有效成分。

附图说明

图1为本发明基质固相分散萃取方法的工艺流程图。

图2为考察不同种类离子液体的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2分别代表枳壳中的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。A、B、C、D、E代表不同的离子液，分别为：A：溴化1-乙基-3-甲基咪唑、B：1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、C：溴化1-己基-3-甲基咪唑、D：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、E：1-己基吡啶四氟硼酸盐。

图3为考察不同浓度的离子液体水溶液的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2分别代表枳壳中的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。图中横坐标为离子液体水溶液的浓度，单位mM。

图4为考察不同体积离子液体水溶液的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2分别代表枳壳中的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。图中横坐标为离子液体水溶液的体积，单位mL。

图5为考察不同种类吸附剂的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2分别代表枳壳中的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。A、B、C、D代表不同种类的吸附剂，分别为：A：弗罗里硅土、B：C18反向硅胶、C：硅胶、D：氧化铝。

图6为考察药材、弗罗里硅土在不同质量比例条件下的的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2分别代表枳壳中的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。图中横坐标代表药材、弗罗里硅土的质量比。

图7为考察不同的研磨时间对基质固相分散萃取效果影响的柱状图。图中，1、2分别代表枳壳中的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。图中横坐标代表研磨时间，单位为min。

图8为本发明方法和药典方法分别提取得到的提取液的液相色谱图。图中，1、2分别代表枳壳中的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷。A图为参照药典提取方法所得提取液的液相色谱图、B图为本发明方法提取得到的黄酮类有效成分提取液的液相色谱图。

具体实施方式

通过以下实例来对本发明所提供的检测方法进行更为详细的描述。由于其应用范围广，故具体实施方案也多，下面将结合几个实例的讨论对本发明的内容作进一步的阐述。但本发明的保护范围不限于此。

枳壳对照品溶液的制备方法具体步骤为：分别取新橙皮苷、柚皮苷的对照品适量，精密称定，混合置棕色量瓶中，加甲醇制成每lmL含新橙皮苷500μg、柚皮苷500μg的溶液，即得对照品溶液。

本发明实施例中所用的离子液体溴化1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、溴化1-己基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-己基吡啶四氟硼酸盐购于AlfaAesar公司。

实施例1

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg各5份，分别加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物分别加入5支3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将所有填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL不同种类的离子液体水溶液，离子液体分别为溴化1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、溴化1-己基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-己基吡啶四氟硼酸盐，上述5种离子液体水溶液的浓度均为250mM，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用分别用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液，即为黄酮类有效成分提取液，分别取样后，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实施例所用仪器为Waters Acquity Uplc H-Class。色谱柱：ACQUITYBEH C18，1.7μm，2.1×50mm(Waters)，检测波长：283nm，柱温：40℃，进样量：0.1μL，流速0.4mL/min，流动相：A：0.1v％甲酸水，B：乙腈。梯度洗脱：0～2min，15％～20％B；2～4min，20％～30％B；4～6min，30％～50％B；6～8min，50％～100％B；8～9min，100％～100％B，9～10min，100％～15％B。后续实施例中的色谱条件均和实施例1相同。

实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积。

表1.

其中：A为溴化1-乙基-3-甲基咪唑、B为1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、C为溴化1-己基-3-甲基咪唑、D为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、E为1-己基吡啶四氟硼酸盐；1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

不同种类离子液体的固相萃取效果柱状图如图2所示。结果显示，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的效果最好，可能的原因是，相比其他种类的离子液，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐这类物质对枳壳这两类活性成分作用力更强，反映在提取液外观上，用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐作为洗脱剂的一组，颜色最深。

实施例2

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg各4份，分别加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物分别加入4支3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将所有填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL不同浓度(150mM、200mM、250mM、300mM)的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐水溶液，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液分别用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表2，表2中的数据为峰面积。

表2.

其中：1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

不同的离子液体浓度的基质固相分散萃取效果的柱状图如图3所示。随着离子液体浓度的增大，基质固相萃取的效果逐步增大，直到离子液体浓度达到250mM时达到最佳，后随着离子液体浓度的增大，萃取效果有下降趋势，可能的原因是，离子液体浓度越大，对活性成分的吸附效果越明显，但浓度过高会使得离子液体的水溶液粘度变大，不易被洗脱收集，最终影响了萃取效果，故250mM是最佳条件。

实施例3

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg各4份，分别加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物分别加入4支3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将所有填好的小柱置于固相萃取仪上。量取不同体积(0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL)的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐水溶液，浓度250mM，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表3，表3中的数据为峰面积。

表3.

其中：1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

不同体积离子液体水溶液的基质固相分散萃取效果柱状图见图4。结果显示，离子液体水溶液体积为0.3mL时，不能充分将固体混合物中的活性成分洗脱下来，但当洗脱体积从0.4mL逐渐增大至0.5mL和0.6mL时，尽管能将混合固体充分洗脱，但由于用量过多，洗脱液浓度变稀，故最佳条件是0.4mL。

实施例4

称取150mg不同种类的吸附剂(弗罗里硅土、C18反向硅胶、硅胶、氧化铝)、以及枳壳药材粉末50mg各4份，分别加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物分别加入4支3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将所有填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表4，表4中的数据为峰面积。

表4.

其中，A为弗罗里硅土、B为C18反向硅胶、C为硅胶、D为氧化铝；1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

不同种类吸附剂的基质固相分散萃取效果柱状图如图5所示。结果显示，吸附剂采用弗罗里硅土时，其萃取效果最佳，采用其他吸附剂所得洗脱液颜色较浅，色谱峰响应也较低。且使用C18反向硅胶和硅胶作为吸附剂时，洗脱所耗时间仅为15s左右，使用氧化铝时则洗脱时间为30s，洗脱时间过短将无法充分将活性成分洗脱下来。

实施例5

称取不同质量(50mg、100mg、150mg、200mg)的弗罗里硅土，以及枳壳药材粉末50mg各4份，分别加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物分别加入4支3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将所有填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表5，表5中的数据为峰面积。

表5.

其中：1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

药材和弗罗里硅土不同质量比例对基质固相分散萃取效果的影响见图6。结果显示，枳壳药材:吸附剂的质量比，从1:1变成1:2、1:3、1:4时，萃取效果先增大，后有减小趋势。且4组的洗脱时间分别为3.5min、2min、60s、50s。可能的原因是吸附剂本身为固体颗粒，中间有较多间隙，较少的吸附剂与药材研磨后，药渣能填充到吸附剂颗粒的缝隙中，使颗粒间的缝隙减少，加大了洗脱剂流过混合固体的阻力，使得洗脱时间变久，而由于吸附剂量较少，对活性成分的吸附也有限。随着吸附剂量的增加，吸附剂颗粒之间的缝隙也逐渐增多，减少了洗脱剂流经混合固体的阻力，减少了洗脱剂和混合固体的接触时间，从而降低了萃取效果，故吸附剂的量过少和过多都会降低萃取效果，在一定范围内，增加吸附剂的用量，能够更好地将枳壳药材进行研磨粉碎，将活性成分更好的吸附在吸附剂中，但过量加入的吸附剂同时也会对洗脱剂产生一定的吸附作用，使得洗脱剂在混合物中有较多的残留，降低了萃取效果，故比例1:3是最佳条件。

实施例6

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg各4份，分别加入研钵中研磨不同时间(0.5min、0.75min、1min、1.25min)。将混合均匀后的固体混合物分别加入4支3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将所有填好的小柱置于固相萃取仪上。量取不同体积0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表6，表6中的数据为峰面积。

表6.

其中：1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

不同研磨时间的基质固相分散萃取效果柱状图如图7所示。结果显示，随着研磨时间的增加，萃取效果先有增加趋势并且在1min处达到最大值，后随着研磨时间的增加，萃取效果有下降趋势，可能的原因是，在一定范围内，研磨时间越充分，能使得吸附剂更好地吸收药材粉末中的活性成分，但过度研磨，会导致吸附剂过量吸附药材中的活性成分，使得洗脱变得困难，故最佳研磨时间是1min。。

日内精密度

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg，加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物加入3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

在同一天内连续进样6次。

日间精密度

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg，加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物加入3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

将该样品连续进样3天，每天2次。

日内、日间精密度实验结果汇总如下表7：

表7.

其中：1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

重复性考察

参照下列实验步骤，平行做5组，作为考察。

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg，加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物加入3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。重复性实验结果见表9。

药材含量测定

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg，加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物加入3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液，即为黄酮类有效成分提取液，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。获得提取液的液相色谱图。

图8中B图为黄酮类有效成分提取液的液相色谱图。图中，1、2分别代表枳壳中不同的有效成分，分别为：1：新橙皮苷、2：柚皮苷，A图为参照药典提取方法所得提取液的液相色谱图、B图为本发明方法提取得到的黄酮类有效成分提取液的液相色谱图。

以新橙皮苷、柚皮苷的对照品配制不同浓度的混合对照品溶液，按同样条件用超高效液相色谱检测，获得对照品溶液的色谱图，以对照品的进样量为横坐标，以对照品溶液的色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，分别制作新橙皮苷标准曲线和柚皮苷标准曲线。根据提取液的液相色谱图和标准曲线计算得到黄酮类有效成分提取液中新橙皮苷、柚皮苷的含量，可相应换算得到提取的新橙皮苷、柚皮苷相对于枳壳药材粉末的含量，含量检测结果见表9。

2种成分的标准曲线以及检测限和定量限如下表8所示：

表8.

其中：1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

回收率实验

称取弗罗里硅土150mg、枳壳药材粉末50mg各2组，第一组加入新橙皮苷、柚皮苷的浓度各自均为50μg/mL的枳壳混标10μL，第二组加入新橙皮苷、柚皮苷的浓度各自均为100μg/mL的枳壳混标10μL，加入研钵中研磨1min。将混合均匀后的固体混合物分别加入3mL规格固相萃取小柱中，小柱的底部事先加入筛板，加入完毕后小柱的顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。量取0.4mL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液水溶液(浓度250mM)，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵(气压为-28.0bar)，对小柱进行洗脱。洗脱液用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

重复性、含量测定、回收率实验结果汇总如下表9：

表9.

其中：1为新橙皮苷，2为柚皮苷。

结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性高。

对照例：

按照中国药典中的提取方法为：取本品粗粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流1.5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。所得提取液用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析，得到液相色谱图(如图8中A图所示)与标准曲线对照，可测得提取液中有效成分相对于陈皮药材的含量为新橙皮苷57.5001mg/g，柚皮苷60.9046mg/g。而本申请方法制得的提取液中有效成分相对于陈皮药材的含量为新橙皮苷123.4461mg/g，柚皮苷111.1667mg/g，提取得到的有效成分含量提高了2倍左右，提取效果优秀。

Claims (10)

1.一种提取中药枳壳中黄酮类有效成分的方法，所述黄酮类有效成分为新橙皮苷、柚皮苷中的一种或两种，其特征在于所述方法为：

取枳壳药材粉末和弗罗里硅土，以质量比1:1～4混合，加入研钵中研磨，得研磨后的固体混合物；取固相萃取柱，固相萃取柱的底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的固相萃取柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入固相萃取柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液；

所述洗脱剂为浓度150～300mmol/L的离子液体水溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、溴化1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸盐、溴化1-己基-3-甲基咪唑或1-己基吡啶四氟硼酸盐。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子液体水溶液中离子液体的浓度为250mmol/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述枳壳药材粉末和弗罗里硅土的质量比为1:3。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子液体水溶液的体积用量以枳壳药材粉末的质量计为0.006～0.012mL/mg。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子液体水溶液的体积用量以枳壳药材粉末的质量计为0.008mL/mg。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述研磨的时间为0.5～1.25min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按以下步骤操作：

称取枳壳药材粉末50mg，按照质量比1:3称取弗罗里硅土150mg，加入研钵中研磨1min，得研磨后的固体混合物；取3mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，量取0.4mL的浓度250mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的水溶液，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液。

10.一种检测微量的枳壳药材粉末中的黄酮类有效成分含量的方法，其特征在于所述方法为：

称取枳壳药材粉末50mg，按照质量比1:3称取弗罗里硅土150mg，加入研钵中研磨1min，得研磨后的固体混合物；取3mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，将研磨后的固体混合物加入固相萃取柱中，填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，量取0.4mL的浓度250mmol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的水溶液，注入小柱内，启动固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱结束后，将洗脱液涡旋10s后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液；黄酮类有效成分提取液用超高效液相色谱仪采样分析，得到黄酮类有效成分提取液的液相色谱图；

以新橙皮苷的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照黄酮类有效成分提取液的同样条件用超高效液相色谱仪检测，获得新橙皮苷对照品的液相色谱图，以新橙皮苷对照品的进样量为横坐标，以新橙皮苷对照品的液相色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，制作新橙皮苷素标准曲线，按同样方法制作柚皮苷标准曲线；根据黄酮类有效成分提取液的液相色谱图中各色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到黄酮类有效成分提取液中新橙皮苷、柚皮苷的含量，相应换算得到提取的新橙皮苷、柚皮苷相对于枳壳药材粉末的含量。