CN108459093B - 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测方法，尤其涉及超高效液相色谱‑串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法。本发明样品分果皮和果肉两部位，经甲醇‑水充分提取处理；采用Accucore XL C18柱(150×4mm，4.6μm)分离，甲醇‑0.15％甲酸水为流动相梯度洗脱，电喷雾离子源正负离子切换多反应监测模式串联质谱下检测，外标法定量。结果表明：九种功能性成分在较宽的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997。三个添加量水平的回收率在83.57％～112.91％之间，相对标准偏差均小于在1.58％～8.33％之间(n＝6)。测定了4批次常山胡柚样品，同时测定了其中的九种功能性成分。本方法快速、灵敏、准确，适用于常山胡柚中九种功能性成分的定性和定量检测。

Description

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成 分的方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其涉及超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法。

背景技术

枳壳(zhǐqiào)是《中国药典》收录的草药，药用来源为芸香科植物酸橙Citrusaurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。枳壳性苦、辛、酸、温，具有理气宽中、行滞消胀的功效，主治胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停；胃下垂，脱肛，子宫脱垂等病症。枳壳在我国多地都有生产，以湖南和江西的产品为佳。其中江西省新干县的枳壳又名商洲枳壳、三湖枳壳，具有“果肉厚，外翻如覆盆，瓤瓣数较多”的特点，其药用的有效成分优于其他品种，被列为中国国家地理标志保护产品。

随着对枳壳保健功能的认识逐步加强，对枳壳中所含的主要功能性成分的含量也越来越关注。但枳壳中不同部位的多种功能性成分含量的超高效液相色谱-串联质谱法同时测定一直未见文献报道。因此，建立枳壳中不同部位的九种功能性成分的分析方法并得到功能成分的含量测定结果，有助于公众更好地了解和应用枳壳的保健功能，也有利于企业和主管部门对功能成分的含量进行有效的跟踪控制，该方法对促进枳壳的开发十分必要。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法，该方法操作简便、灵敏度高、结果准确，适用于作为枳壳中不同部位的九种功能性成分的快速筛查和确证的检测手段。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法，其特征在于，九种功能性成分分别为圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、柠檬苦素、橙皮素和诺米林，该方法包括以下的步骤：

1)标准溶液的配制

精密称取九种功能性成分的标准品10mg，精确至0.1mg，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成1mg/mL的单标储备液；并根据需要移取适量储备液，用甲醇：水＝1∶1v/v溶液，稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4℃冰箱中；

2)试样的制备

称取1g粉末，加30ml 50％甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm滤膜，进样，计算得第一次提取得率；将滤渣重复提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm滤膜，进样，计算得第二次提取得率；将滤渣再次提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm有机系滤膜，进样，计算得第三次提取得率；

m:活性物质测定所得质量，mg；

4)色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore XL C18，150×4.6mm，4μm；液相洗脱梯度：A:0.15％甲酸水溶液，B:甲醇；B相变化：0-0.5min:30％；0.5-14min:30％→65％；14-14.01min:65％→95％；14.01-20min:95％；20-20.01min:95％→30％；20.01-22min:30％；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：2μL；

5)质谱分析条件

电喷雾离子源，正负电离模式，干燥器温度：350℃，电喷雾电压：3500V，扫描方式为多反应监测模式；出峰时间、母离子、子离子、碰撞能和监测模式的质谱条件如下：

*为定量离子。

本发明由于采用了上述的技术方案，九种功能性成分在较宽的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997。三个添加量水平的回收率在83.57％～112.91％之间，相对标准偏差均小于在1.58％～8.33％之间(n＝6)。测定了4批次枳壳样品，同时测定了其中的九种功能性成分。本方法快速、灵敏、准确，适用于枳壳中九种功能性成分的定性和定量检测。

附图说明

图1为流动相对9种活性物质峰面积的影响图。

图2为同分异构体的总离子流图(1:柚皮苷；2：芸香柚皮苷；3：新橙皮苷；4：橙皮苷)。

图3为提取次数对9种活性物质含量的影响图。

图4为提取试剂的浓度对9种活性物质提取所得含量的影响图。

图5为料液比对9种活性物质的提取得率的影响图。

图6为超声时间对9种活性物质的提取得率的影响图。

图7为HPLC-MS/MS色谱图(A:标准品1,圣草次苷；2，芸香柚皮苷；3，柚皮苷；4，橙皮苷；5，新橙皮苷；6，柚皮素；7，柠檬苦素；8，橙皮素；9，诺米林；B:衢州枳壳样品)。

具体实施方式

1实验部分

1.1仪器与试剂

TSQ vantage三重四级杆串联液质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；高速粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)；KQ-500B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Multifuge X1R高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司)。

标准品：橙皮苷(CAS:520-26-3，纯度:97.06％)，新橙皮苷(CAS:13241-33-3，纯度：98.76％)，橙皮素(CAS:520-33-2，纯度：98.45％)，柚皮苷(CAS:10236-47-2，纯度：99.33％)，芸香柚皮苷(CAS:14259-46-2，纯度:99.38％)，柚皮素(CAS:480-41-1，纯度：98.09％)，柠檬苦素(CAS:1180-71-8，纯度：99.08％)，诺米林(CAS:1063-77-0，纯度：99.32％)，圣草次苷(CAS:13463-28-0，纯度：98.16％)均购自上海安谱实验科技股份有限公司。枳壳样品来源信息见表1。

表1枳壳样品来源

1.2测定方法

1.2.1色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore XL C18，150×4.6mm，4μ；液相洗脱梯度：A:0.15％甲酸水溶液，B:甲醇。B相变化：0-0.5min:30％；0.5-14min:30％→65％；14-14.01min:65％→95％；14.01-20min:95％；20-20.01min:95％→30％；20.01-22min:30％。流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：2μL。

1.2.2质谱条件

电喷雾(ESI)离子源，正负电离模式，干燥器温度：350℃，电喷雾电压：3500V，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，各活性物质的质谱参数见表2。

表2 9种活性物质的出峰时间及质谱参数

标*号的是定量离子。

1.2.3提取方法优化

1.2.3.1提取次数优化

称取1g粉末，加30ml 50％甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm滤膜，进样，计算得第一次提取得率；将滤渣重复提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm滤膜，进样，计算得第二次提取得率；将滤渣再次提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm有机系滤膜，进样，计算得第三次提取得率。

m:活性物质测定所得质量，mg；

1.2.3.2提取试剂浓度优化

设置5个的提取试剂的浓度梯度，40％、50％、60％、70％、80％甲醇水，称取1g粉末，分别加30mL不同浓度的甲醇水溶液于50mL离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm有机系滤膜，进样。

2.2.3.3料液比优化

设置5个不同的料液比(g:ml)梯度，1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，称取1g粉末，分别加入不同料液比的50％甲醇水溶液于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm有机系滤膜，进样。

2.2.3.4超声时间优化

设置6个超声提取时间梯度，10min、20min、30min、40min、50min、60min，称取1g粉末，加入30mL 50％甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，按设置的超声时间分别进行提取，8500r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm有机系滤膜，进样。

2.2.3.5正交试验

以提取试剂浓度、超声时间、料液比为3个因素，选取每个单因素实验中提取效果较好的2个水平，做3因素2水平的正交实验，每个实验做3个平行实验。

表3三因素两水平L₄(2³)

表4正交实验设置

1.2.4色谱条件优化

流动相的组成和配比会影响目标化合物的色谱分离效果和离子化效率。本实验考察了甲醇-0.15％甲酸水溶液(A)、乙腈-0.15％甲酸水溶液(B)、乙腈-水(C)等3种流动相体系对辛弗林、圣草次甙、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮甙、新橙皮苷、柠檬苦素、柚皮素、橙皮素、诺米林、桔皮素等11种目标分析物的分离效果和峰信号强度。对比A、B体系时，可发现甲醇对柚皮苷、柠檬苦素、诺米林的影响显著，峰面积分别提高了28.99％、2028％、3443％(图)；对比B、C体系发现，加甲酸使各物质的峰型改善，提高稳定性。综合比较结果，使用A体系时目标分析物的色谱峰分离效果佳、灵敏度高、检出限低。故最终确定甲醇-0.15％甲酸水溶液作为分离11种化合物的流动相。试验选择甲醇-0.15％甲酸水溶液为流动相。

1.2.5质谱条件优化

分别将11种化合物标准品溶液采用流动注射直接进样，分别在电喷雾电离源(ESI)的正离子和负离子模式下进行扫描。确定各化合物的母离子，分别优化质谱的S-Lens、碰撞能量(Collision Energy)等参数，进行子离子扫描，选取2种丰度强、稳定的碎片离子作为定性离子对，选择其中离子丰度最高的离子对作为定量离子对。9种物质中存在2对同分异构体，芸香柚皮苷与柚皮苷，橙皮苷与新橙皮苷。图显示，芸香柚皮苷的[M+H]+离子信号强度大于[M-H]-，而柚皮苷的[M+H]+离子信号强度弱于[M-H]-。橙皮苷的[M+H]+离子信号强度大于[M-H]-，而新橙皮苷的[M+H]+离子信号强度弱于[M-H]-。

实验发现，毛细管温度(Capilirry Temperature)对诺米林和辛弗林的离子加合物形态有较大的影响。当毛细管温度(Capilirry Temperature)大于150℃的时候，辛弗林的准离子峰由[M+H]+变为[M-H2O+H]+。当毛细管温度(Capilirry Temperature)270℃左右时，诺米林的[M+H]+准离子峰信号最强。

1.2.6方法评价

1.2.6.1回收率、精密度

样品加标：准确称取1g样品粉末(40-60目)，按照不同活性物质在枳壳中的本底值添加相应质量的标准品，平行做6个样品，以料液比(g/mL)1:25加入50％的甲醇水溶液，涡旋振荡后浸泡2h，超声提取，准确计时10min，离心，取1mL上清液，加入50％甲醇水溶液1mL，混匀，过膜，进样。

样品不加标：准确称取1g样品粉末(40-60目)，加1mL甲醇，做6个平行，以料液比(g/mL)1:25加入50％的甲醇水溶液，涡旋振荡后浸泡2h，超声提取，准确计时10min，离心，取1mL上清液，加入50％甲醇水溶液1mL，混匀，过膜，进样。根据所得数据计算回收率，RSD值。

1.2.6.2线性范围、检出限、定量限

分别配制5、10、20、50、100、200、500、1000ppb的8种标准品的混合标准溶液，用探索出的液相色谱及质谱条件测定，得出物质浓度与峰面积的关系，制作出对应的标准曲线，以S/N＝3确定方法的检出限，以S/N＝10确定方法的定量限。

1.3不同产地枳壳样品测定

选取不同产地的枳壳，分别将其用粉碎机粉碎，过筛，选取40-60目间的粉末，准确称取1g粉末，一个产地做3个平行，以料液比(g/mL)1:25加入50％的甲醇水溶液，涡旋振荡后浸泡2h，超声提取，准确计时10min，离心，取1mL上清液，加入50％甲醇水溶液1mL，混匀，过膜，进样。用标准曲线确定不同产地的枳壳中9种活性物质的含量，并进行分析比较。

2实验结果与讨论

2.1提取次数优化

如图3所示。

3.2提取试剂优化

表5提取试剂对提取所得活性物质含量的影响(x±RSD)n＝6

3.3提取试剂浓度优化

如图4所示。

3.4料液比优化

如图5所示。

3.4超声时间优化

如图6所示。

3.5测定方法评价

表6 9种化合物添加回收率

(n＝6)

4线性范围、检出限、定量限

分别配制5、10、20、50、100、200、500、1000ppb的8种标准品的混合标准溶液，用探索出的液相色谱及质谱条件测定，得出物质浓度与峰面积的关系，制作出对应的标准曲线，以S/N＝3确定方法的检出限，以S/N＝10确定方法的定量限。

表7 9种功能成分的线性方程及相关系数

注：以S/N＝3确定方法的检出限，以S/N＝10确定方法的定量限。

表8正交实验结果

表9正交实验数据极差分析法

表10主次因素排序

对因素A，从主次顺序来看，对柚皮素、柠檬苦素、橙皮素的影响均排在第一位，为主要因素，应以主要因素为主选因素的水平。从初选的最优水平组合中可以看出，对这5种活性物质选A₂水平为好。

对因素B，从主次顺序来看，对橙皮苷、诺米林的影响排在第一位，为其主要因素，而从初选的最优水平组合中可以看出，对这2种物质选B₁水平较好。

对因素C，从主次顺序来看，对圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷的影响排在第一位，为其主要因素。从初选的最优水平组合中可以看出，选C₂水平较好。

按照综合平衡法可知，三个因素的主次顺序为C＞A＞B，A₂B₁C₂为最优组合，即从枳壳中提取9种活性物质时，以料液比(g/mL)1:25加入50％的甲醇水溶液，超声10min，提取所得的活性物质含量最高。

二、不同产地枳壳样品测定

选取不同产地的枳壳，分别将其用粉碎机粉碎，过筛，选取40-60目间的粉末，准确称取1g粉末，一个产地做3个平行，以料液比(g/mL)1:25加入50％的甲醇水溶液，涡旋振荡后浸泡2h，超声提取，准确计时10min，离心，取1mL上清液，加入50％甲醇水溶液1mL，混匀，过膜，进样。用标准曲线确定不同产地的枳壳中9种活性物质的含量，并进行分析比较。

表11不同产地的枳壳中9重活性物质含量(x±SD)单位：mg/g

来源：1.衢州常山县；2.江苏河北省安国药源商贸有限公司；3.江西河北省安国市旭芳中药材经营有限公司；4.江西广东天城中药饮片有限公司；5.江西河北省安国市瑞琪中药材有限公司；6.湖南河北省安国市御颜坊中药材有限公司；7.江西南京鹿江中药饮片厂；8.四川安国药源商贸有限公司；9.江西亳州市张仲景中药饮片有限公司；10.衢州廿里镇。

Claims (1)

1.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定枳壳中九种功能性成分的方法，其特征在于，九种功能性成分分别为圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、柠檬苦素、橙皮素和诺米林，该方法包括以下的步骤：

1）标准溶液的配制

精密称取九种功能性成分的标准品 10 mg，精确至0.1 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成1 mg/mL的单标储备液；并根据需要移取适量储备液，用甲醇：水=1∶1 v/v溶液，稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4 ℃冰箱中；

2）试样的制备

称取1g粉末，加30ml 50%甲醇水于50ml离心管中，浸泡2h，室温下，超声处理30min，8500 r/min离心10min，得上清液，取适量过0.22μm滤膜，进样，计算得第一次提取得率；将滤渣重复提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm滤膜，进样，计算得第二次提取得率；将滤渣再次提取一次，离心后取适量上清液过0.22μm有机系滤膜，进样，计算得第三次提取得率；

提取得率（mg/g）=

m: 活性物质测定所得质量，mg；

4 ）色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore XL C18，150×4.6mm，4μm；液相洗脱梯度：A: 0.15%甲酸水溶液，B: 甲醇；B相变化：0-0.5 min: 30%；0.5-14min: 30%→65%；14-14.01min: 65%→95%；14.01-20min: 95%；20-20.01min: 95%→30%；20.01-22min: 30%；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：2μL；

5 ）质谱分析条件

电喷雾离子源，正负电离模式，干燥器温度：350℃，电喷雾电压：3500V，扫描方式为多反应监测模式；出峰时间、母离子、子离子、碰撞能和监测模式的质谱条件如下：

*为定量离子。

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