CN113866293A - 一种快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法 - Google Patents
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本发明公开了一种快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其包括以下步骤：制备供试品溶液；建立超高效液相色谱‑质谱检测程序，并获得色谱质谱总离子流原始数据；根据所述色谱质谱总离子流原始数据匹配目的组份，结合比对色谱保留时间、准确相对分子质量以及碎片离子碎片信息进行快速的结构鉴定，以实现对洋甘菊中化学成分定性。本发明中采用UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS法对洋甘菊所含化学成分进行分析测定，为洋甘菊中化学成分鉴定提供了一种快速、准确和高效的鉴定方法，为研究洋甘菊药材的药效物质基础、质量变化规律及质量标准提升提供理论依据和技术参考。
Description
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及一种快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法。
背景技术
洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)为菊科(Compositae)母菊属(Matricaria)一年生草本植物，又名德国洋甘菊或母菊，维吾尔医药又称其为巴布那儿、巴木乃，味苦、甘香，是一种重要的药用植物和香料资源，它的干燥头状花序已成为一种重要的出口物资，其具有生干生热、软坚消肿、温胃开胃、散气消炎、祛风止痛、明目等功能，主治湿寒性或黏液质性疾病，如湿寒性各种硬块炎肿、关节肿痛、消化不良、筋肌松弛、经闭、尿闭等，为《国家药品标准维吾尔药分册》、《中国卫生部药品标准》等所收藏。目前洋甘菊在国外应用非常广泛，《美国药典》、《欧洲药典》、《英国药典》均收载了洋甘菊干燥花和精油。
洋甘菊化学成分种类众多，在此前的研究中已发现其化学成分主要包括挥发油类、黄酮类、香豆素类、有机酸类等，对洋甘菊的成分研究主要以挥发油为主，质量研究主要以显微鉴别和含量测定为主。中药的质量评价往往以药材中一个或某几个成分来评价药材的质量优劣，但对于中药而言，由于其化学成分复杂，各成分之间还存在配伍关系，仅仅采用传统的HPLC-UV指纹图谱和多指标含量测定对制剂和药材进行质量控制研究存在一定的局限性，其指纹图谱存在的共有峰、差异性成分、不具有显著生色团的化合物等均无法准确分析鉴定出来。目前，关于洋甘菊的药效物质基础研究还不够深入，并缺乏对洋甘菊中化学成分的全面定性分析，尚未有关于采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术的洋甘菊中化学成分分析的报道。因此，研究洋甘菊的药效物质基础对洋甘菊药材及其制剂的质量标准提升具有重要的现实意义。
超高效液相联用四级杆-串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术已成为研究中药复杂体系中化学成分和定性分析的重要工具，具有扫描速度快、高灵敏度、高分辨率、测定化合物精确质荷比和离子扫描范围广等强大的化学鉴别分析的优点，可在缺少对照品的情况下对成分进行结构预测分析。根据精确质量数、碎片离子、裂解规律等信息，结合数据库、文献数据、对照品及等质谱数据库，对检测的化学成分进行定性分析，是一种系统性阐明中药化学物质基础的有效手段。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明公开了一种快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：
一种快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其包括以下步骤：
步骤1，制备供试品溶液；
步骤2，建立超高效液相色谱-质谱检测程序，并获得色谱质谱总离子流原始数据；
步骤3，根据所述色谱质谱总离子流原始数据匹配目的组份，结合比对色谱保留时间、准确相对分子质量以及碎片离子碎片信息进行快速的结构鉴定，以实现对洋甘菊中化学成分定性。
上述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其中在所述步骤1中，取洋甘菊粉末0.25g，过3号筛，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定质量，超声处理30min，功率300W，频率40KHz，放冷，摇匀，以13000r·min-1的转速离心10min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液。
上述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其中在所述步骤2中色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱规格为150mm×2.1mm、1.7μm，流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，体积流量0.2mL·min-1，柱温40℃，进样量1mL。
4.根据权利要求3所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0～4min，5％～25％A；4～9min，25％～65％A；9～15min，65％～87％A；15～19min，87％～98％A；19～22min，98％A。
上述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其中在所述步骤2中质谱条件为：负离子模式扫描测定，电喷雾离子源ESI，仪器参数如下：扫描范围m/z50～1500，雾化气55psi，辅助气55psi，气帘气35psi，雾化温度500℃，负离子进行全扫描ESI，毛细管电压4500V，裂解电压-80V，碰撞能量35eV。
上述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其中所述步骤3的具体步骤为：将采集到的所述色谱质谱总离子流原始数据运用MasterView数据软件，与数据库NaturalProducts HR-MS/MS中预存的组份信息进行匹配，导出化学成分的名称、分子式、理论分子量、实际分子量、加和形式、误差、响应值、保留时间。
上述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其中主要参数设置如下：响应值>1000counts，信噪比为3，提取离子宽度为0.02Da，保留时间宽度为2min，阈值为100cps，分子量误差<5ppm，根据公式：误差ppm＝(实际分子量-理论分子量)/理论分子量×106，剔除计算结果误差大于5ppm的化合物。
上述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其中在进行所述步骤2之前，还需制备对照品溶液，具体步骤如下：分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C、棕榈酸、亚油酸、油酸各对照品适量，加适量甲醇超声使溶解，室温放至澄清，取上清液适量，过0.22μm微孔滤膜，置于样品瓶中，作为混合对照品溶液。
本发明的有益效果为：
(1)依赖于UPLC的超高效分离能力和Q-TOF-MS/MS的高灵敏和准确定性定量能力，超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)联用技术，在一次扫描中可同时检测痕量级和高丰度化合物，可用于洋甘菊中药复杂体系的快速分析和成分识别，其具有高分辨率、高灵敏度、高准确性、重现性好、分析时间短、扫描范围广等优点，可以避免繁琐和复杂的样品前处理，同时能根据高分辨质谱获得的化合物精确分子质量、碎片离子峰、色谱保留时间及对照品信息，结合相关文献数据，鉴定洋甘菊天然药物中的化学成分；
(2)本发明一方面可以避免繁琐样品前处理方法，最大程度地保留样品中的原有化学成分，另一方面洋甘菊中化学成分的分析方法首次对其用UPLC-Q-TOF-MS/MS进行分析测定，为洋甘菊中化学成分鉴定提供了一种快速、准确和高效的鉴定方法，为研究洋甘菊药材的药效物质基础、质量变化规律及质量标准提升提供理论依据和技术参考。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为洋甘菊于负离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS/MS高分辨质谱总离子流图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，而非对本发明进行限制。
实施例1：
1.材料与试剂
洋甘菊药材购自购自广东康美药业股份有限公司，洋甘菊样品经广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)刘法锦研究员鉴定为菊科(Compositae)母菊属(Matricaria)植物洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)；对照品绿原酸(批号：110753-201415，纯度96.2％)、咖啡酸(批号：110885-200102，纯度98.0％)、油酸(批号111621-201205，质量分数99.6％)购自中国食品药品检定研究院，新绿原酸(批号:X-014-180410，纯度＞98％)、异绿原酸B(批号：Y-069-150624，纯度＞98％)，成都瑞芬思生物科技有限公司；棕榈酸(批号PRF9061144，纯度95％)购自成都普瑞法科技开发有限公司，隐绿原酸(17061401，纯度98％)购自成都普菲德生物技术有限公司；异绿原酸C(批号：AF20121801，纯度＞98％)、亚油酸(批号AF7060202，质量分数98％)购自成都埃法生物科技公司，可用于定性研究。甲醇、甲酸、乙腈(质谱纯，美国Fisher公司)，蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)，甲醇(分析纯)购于广州化学试剂厂。
2.仪器
UPLC-Q-TOF-MS/MS系统：ExionLC AC型高效液相色谱仪(美国AB SCIEX公司)，XTOF 500R质谱仪，配有ESI离子源(美国AB SCIEX公司)，Mettler TOLEDO XS205型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，Sorvall Legend Micro 17R微量离心机(半径＝8.6cm)(美国Thermo Scientific公司)，KQ-700DE型数控超声波清洗仪(超声功率700W，工作频率40KHz)(昆山市超声仪器有限公司)。
3.样品溶液的制备
供试品溶液的制备：取洋甘菊粉末(过3号筛)0.25g，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定质量，超声(功率300W，频率40KHz)，处理30min，放冷，摇匀，离心(13000r·min-1)10min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液,即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C、棕榈酸、亚油酸、油酸各对照品适量，加适量甲醇超声使溶解，室温放至澄清，取上清液适量，过0.22μm微孔滤膜，置于样品瓶中，作为混合对照品溶液。
4.UPLC-Q-TOF-MS/MS高分辨质谱分析方法
UPLC条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～4min，5％～25％A；4～9min，25％～65％A；9～15min，65％～87％A；15～19min，87％～98％A；19～22min，98％A；体积流量0.2mL·min-1；柱温40℃；进样量1mL。
质谱条件：Sciex X500R QTOF质谱仪：负离子模式扫描测定；电喷雾离子源(ESI)；仪器参数如下：扫描范围m/z 50～1500，雾化气55psi，辅助气55psi，气帘气35psi，雾化温度500℃，负离子进行全扫描(ESI)，毛细管电压4500V，裂解电压-80V，碰撞能量35eV。
5.数据处理
洋甘菊于负离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS/MS高分辨质谱总离子流图如图1所示。
将采集到的色谱质谱总离子流原始数据运用MasterView数据软件，与数据库(Natural Products HR-MS/MS，Version 1.0，AB Sciex，Forster City，USA)中预存组份信息进行匹配，导出样品名称、分子式、理论分子量、实际分子量、加和形式、误差、响应值、保留时间；主要参数设置如下：响应值>1000counts；信噪比：3；提取离子宽度：0.02Da；保留时间宽度：2min；阈值：100cps；分子量误差：<5ppm，根据公式：误差ppm＝(实际分子量-理论分子量)/理论分子量×106，剔除计算结果误差大于5ppm的化合物；
6.实验方法优化
(1)提取方法、时间及溶剂选择
对比超声和加热回流两种提取方法，在20～40min内的提取，并采用50％甲醇、50％乙醇、甲醇、水分别对其进行提取，对比不同条件下洋甘菊提取物的提取效率。结果表明甲醇超声30min提取效率较高。
(2)流动相、色谱柱及正、负离子扫描模式选择
在相同实验条件下，对比ACQUITY BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)以及ACQUITYUPLC C18(100mm×2.1mm，1.7μm)两种色谱柱的分离效率。BEH型色谱柱可以对大多数化合物提供较好的分离效率及峰形，具有普适性。
考察流动相时比较了甲醇-水、乙腈-水2种溶剂系统，结果显示甲醇-水的洗脱效果优于乙腈-水，且加入0.1％的甲酸可以更有效的提高负离子模式的质谱响应，因此采用0.1％甲酸水溶液-甲醇作为流动相。
同时，考虑到洋甘菊药材中所含化合物响应模式不同，为了更好的地推测样品中的化合物，本实验采用正、负2种离子模式进行扫描检测，结果发现负离子模式下可以大多数化合物的鉴定，因此选用负离子模式进行检测。
7.分析结果
根据对照品比对、文献报道及Scifinder、Chemspider、Pubchem、TCMSP和MassBank等数据库查询，结合色谱保留行为、分子量信息以及质谱裂解规律，对其化学成分进行鉴定，结果见表1。
表1洋甘菊负离子模式下化学成分分析结果
综上，本实验在负离子模式下，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS高分辨质谱对洋甘菊中的各类成分进行色谱分离、质谱数据采集以及固有成分的结构鉴定，共分析鉴定34个化合物，主要含有有机酸和黄酮类化合物。该方法能够快速、高效地对洋甘菊中化合物进行分析，为洋甘菊的药效物质研究、快速准确鉴定提供了依据，有利于洋甘菊的后续开发与利用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术手段和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。故凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明之形状、构造及原理所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤1，制备供试品溶液；
步骤2，建立超高效液相色谱-质谱检测程序，并获得色谱质谱总离子流原始数据；
步骤3，根据所述色谱质谱总离子流原始数据匹配目的组份，结合比对色谱保留时间、准确相对分子质量以及碎片离子碎片信息进行快速的结构鉴定，以实现对洋甘菊中化学成分定性。
2.根据权利要求1所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，在所述步骤1中，取洋甘菊粉末0.25g，过3号筛，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定质量，超声处理30min，功率300W，频率40KHz，放冷，摇匀，以13000r·min-1的转速离心10min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，在所述步骤2中色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱规格为150mm×2.1mm、1.7μm，流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，体积流量0.2mL·min-1，柱温40℃，进样量1mL。
4.根据权利要求3所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0～4min，5％～25％A；4～9min，25％～65％A；9～15min，65％～87％A；15～19min，87％～98％A；19～22min，98％A。
5.根据权利要求4所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，在所述步骤2中质谱条件为：负离子模式扫描测定，电喷雾离子源ESI，仪器参数如下：扫描范围m/z50～1500，雾化气55psi，辅助气55psi，气帘气35psi，雾化温度500℃，负离子进行全扫描ESI，毛细管电压4500V，裂解电压-80V，碰撞能量35eV。
6.根据权利要求1所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，所述步骤3的具体步骤为：将采集到的所述色谱质谱总离子流原始数据运用MasterView数据软件，与数据库Natural Products HR-MS/MS中预存的组份信息进行匹配，导出化学成分的名称、分子式、理论分子量、实际分子量、加和形式、误差、响应值、保留时间。
7.根据权利要求6所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，主要参数设置如下：响应值>1000counts，信噪比为3，提取离子宽度为0.02Da，保留时间宽度为2min，阈值为100cps，分子量误差<5ppm，根据公式：误差ppm＝(实际分子量-理论分子量)/理论分子量×106，剔除计算结果误差大于5ppm的化合物。
8.根据权利要求1所述的快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法，其特征在于，在进行所述步骤2之前，还需制备对照品溶液，具体步骤如下：分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸C、棕榈酸、亚油酸、油酸各对照品适量，加适量甲醇超声使溶解，室温放至澄清，取上清液适量，过0.22μm微孔滤膜，置于样品瓶中，作为混合对照品溶液。
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