CN102721779A - 植物硒形态的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种植物硒形态的检测方法，按如下四个步骤进行：一是检测前期的准备，确定检测用的仪器和试剂。二是建立高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱即HPLC-ICP-MS联用技术。三是建立五种硒形态标准溶液的色谱图。四是植物样品的预处理及硒形态的提取与检测，用超纯水洗净待测植物材料，冷冻干燥、粉碎过滤和测得含水量，密封放在4℃保存备用；或立即用酶在37℃条件下超声提取30min，离心后取上清液，按照HPLC-ICP-MS联用技术进行硒形态的检测，以采集图谱中所示样品各硒形态对应峰面积计算植物中硒形态的含量。采用本方法检测植物硒形态，形态分离完全，样品前处理简便快捷，流动相成分单一、配制简单，重复性和精确度良好，定量结果准确可靠。

Description

植物硒形态的检测方法

技术领域

本发明涉及一种植物硒形态的检测方法。 

背景技术

硒是人体必需的微量元素，具有防癌抗癌、清除体内自由基和抗衰老等作用。植物是天然有机硒合成的生化工厂，植物有机硒具有较高的生物利用度和生物活性，衡量硒的生物功能水平不仅与总硒量有关，更与硒的化学形态有关，因此检测出硒的不同化学形态有其重要的现实意义。植物作为富硒载体可以将无机硒转化为有机硒，但硒在代谢过程中所需的酶极其复杂，硒的不稳定性等特性又影响着人们对硒形态的进一步认识，目前硒的检测方法研究从痕量检测向硒形态检测的方向发展，因此检测分析方法实用化、仪器简单化、标准化是硒形态研究的一个重要方向。近年来，电喷雾质谱(ES-MS)在分析富硒植物(大蒜、洋葱、坚果)的硒形态检测应用较多，但其灵敏度和精确度不高；随着电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)中碰撞反应池技术的发展，高效液相与电感耦合等离子体质谱HPLC-ICP-MS联用技术以其较高的分离效率和较低的检测限，将成为植物硒形态分析的一种新的技术手段，对此经检索尚未发现有关的资料报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物硒形态的检测方法 

解决上述技术问题采用的技术方案是： 

本植物硒形态的检测方法按照如下步骤进行： 

(1)检测前期的准备： 

①选用的设备：美国waters公司1525型高效液相色谱仪HPLC，美国Thermo Fisher Scientific公司XSeries2电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS，离心机，超声波仪，冻干机； 

②HPLC与ICP-MS采用0.25mm聚醚醚酮PEEK管连接； 

③选用的试剂：盐酸为分析纯，柠檬酸为色谱纯，4℃保存的链霉蛋白酶E，以上试剂均采购于上海生物工程有限公司；硒代胱氨酸(SeCys₂)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亚硒酸钠(Na₂SeO₃)和硒酸钠(Na₂SeO₄)，以上五个硒标准品的纯度≥98％，均采购于Sigma公司； 

④五个硒标准品均用0.1mol/L HC1稀释为100μg/L的混标溶液，4℃保存；试验中所有试剂的配制均采用MΩ为18.2超纯水； 

(2)建立高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱即HPLC-ICP-MS联用技术： 

①HPLC的操作参数：采用Hamilton PRP-X100、250mm×4.1mm ×10μm的阴离子柱为色谱柱，流动相为PH4.725m mol/L的柠檬酸，进样量为50μL，流速为1.0mL/min； 

②ICP-MS的操作参数：采用射频功率为1300W，冷却气流速为13.0L/min，辅助气流速为0.8L/min，雾化气流速为0.85L/min，碰撞反应池为CCT模式，氢氦混合气比例为8∶92，混合气流速为6.95mL/min，测量同位素为⁷⁸Se； 

(3)建立五种硒形态标准溶液的色谱图：取100μg/L硒混标溶液，采用步骤(2)HPLC-ICP-MS的操作参数进行检测，以保留时间Time/ms为横坐标，响应值Intensity/cps纵坐标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图； 

(4)植物硒形态的提取与检测： 

①选取植物材料用超纯水洗净，进行冷冻干燥、粉碎、过40目筛，并测出含水量，样品密封放在4℃保存备用； 

②酶提取法：取样品粉末0.1g放入15mL离心管中，加入20mg链霉蛋白酶E，再加入3mL超纯水后，37℃超声提取30min，14000r/min离心30min，取上清液，过0.22μm滤膜2次，待测； 

③待测样品按照步骤(2)建立的HPLC-ICP-MS联用技术进行硒形态的检测，以保留时间Time/ms为横坐标，响应值Intensity/cps纵坐标，建立样品硒形态色谱图，以采集图谱中所示样品各硒形态对应峰面积计算硒形态的含量： 

本发明的有益效果是创建了一种HPLC-ICP-MS联用技术，分别检 测出植物中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亚硒酸钠和硒酸钠五种硒形态，样品的前处理简便快捷，流动相成分单一，配制简单，定量结果准确可靠，重复性和精确度良好，可完全满足植物中硒形态分析的需要，为植物中硒元素的准确定量和形态鉴定提供了切实可行的方法，对富硒植物进一步开发提供了新的理论依据，为预防和缓解我国硒缺乏现状的整体目标作出一份贡献。 

附图说明

图1为本发明的五种硒形态标样色谱图。 

图2为含硒雷竹笋的硒形态色谱图 

图3为图2的放大色谱图 

具体实施方法 

本发明下面结合实施例予以进一步详述： 

植物硒形态的测定方法中，设备的选用考虑到的是植物中硒含量极低，检测设备必须具备较高的精密度和灵敏度，因此采用美国Thermo Fisher Scientific公司的ICP-MS，美国waters公司的HPLC，HPLC与ICP-MS连接采用的PEEK管具有高性能、耐腐蚀、机械性能优良且耐热性等特点；离心机、超声仪、冻干机是常规设备，型号无特殊要求； 

植物硒化合物种类繁多且含量低，为了保证检测方法的精确度，具体实施选用的试剂需到达相应的级别(分析纯、色谱纯、标准品)，链霉蛋白酶E需4℃保存避免失活，试剂和样品配制均采用18.2MΩ超纯水； 

硒的不稳定性是影响着人们对硒形态进一步认识的重要因素，具体 实施采用冷冻干燥前处理样品和酶解法提取，可以减少硒形态之间相互转化，确保硒形态定性定量的准确性且效率高。 

需说明的是硒标准品的局限性和目标化合物的不可知性一直是困扰硒形态研究的瓶颈问题，本发明优化并创建了一种HPLC-ICP-MS联用技术检测植物中五中硒形态的方法，采用柠檬酸溶液作为流动相分离效果较好，此方法定量结果准确可靠，重复性和精确度良好，可完全满足植物中硒形态分析的需要。动植物对硒的吸收不仅与总硒的含量有关而且更与硒的形态关系密切，不同化学形态的硒其安全性、生物功能性存在较大差异，植物体中硒形态的深入研究为人类硒源的生物安全性和高效可利用性提供了理论依据。 

下面以含硒雷竹笋为植物材料采用HPLC-ICP-MS联用技术检测其硒形态的情况为例，介绍如下： 

1、检测前期的准备： 

(1)选用的设备：美国waters公司1525型高效液相色谱仪HPLC，美国Thermo Fisher Scientific公司XSeries2电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS，日立公司CF16RX离心机，上海之信仪器有限公司JYD-250智能型超声波仪，美国CHRIST公司ALPHR1-2冻干机； 

(2)HPLC与ICP-MS采用0.25mm聚醚醚酮PEEK管连接； 

(3)选用的试剂：盐酸为分析纯，柠檬酸为色谱纯，4℃保存的链霉蛋白酶E，以上试剂均采购于上海生物工程有限公司；硒代胱氨酸(SeCys₂)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亚 硒酸钠(Na₂SeO₃)和硒酸钠(Na₂SeO₄)，以上五个硒标准品的纯度≥98％，均采购于Sigma公司； 

(4)五个硒标准品均用0.1mol/L HCl稀释为100μg/L的混标溶液，4℃保存；试验中所有试剂的配制均采用MΩ为18.2超纯水； 

2、检测方法： 

(1)建立五种硒形态标准溶液的色谱图： 

取100μg/L硒混标溶液，按照HPLC-ICP-MS操作参数(见表1)进样检测，以保留时间Time/ms为横坐标，响应值Intensity/cps纵坐标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图。 

表1HPLC-ICP-MS工作参数 

(2)五种硒形态线性关系的考察： 

将硒混合标样分别以0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0μL的进样量，按照表1HPLC-ICP-MS的操作参数进行检测，记录峰面积。分别以质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程及线性范围，按照试剂空白连续测定11次的3δ计算检 出限。 

(3)含硒雷竹笋样品前处理： 

含硒雷竹笋用超纯水洗净，进行冷冻干燥、粉碎、过40目筛，并测出含水量，样品密封放在4℃备用；取0.1g样品放入15mL离心管中，加入20mg链霉蛋白酶E，再加入3mL超纯水后，37℃超声提取30min，14000r/min离心30min，取上清液，过0.22μm滤膜2次。 

(4)含硒雷竹笋硒形态检测： 

过滤后的样品按照表1HPLC-ICP-MS联用技术进行测定，以采集图谱中所示样品各硒形态对应峰面积计算含硒雷竹硒形态的含量： 

(5)样品加标回收率测定： 

精确平行称取0.1g样品，放入1-7号离心管中，分别加入1.5mL超纯水和20mg链霉蛋白酶E，37℃超声提取30min。超声结束后，在1号管加入1.5mL超纯水，2-7号管加入1.5mL硒混标溶液Na₂SeO₃、Na₂SeO₄和MeSeCys各50ppb，SeCys₂100ppb、SeMet300ppb，在14000r/min条件下离心30min，取上清液，过0.22μm滤膜，按照表1HPLC-ICP-MS的操作参数进行测定，按下列公式计算出加标回收率： 

3结果与分析： 

(1)五种硒形态标准溶液的色谱图见图1，五种硒形态均能得到有效分离，出峰顺序为SeCys₂、MeSeCys、Na₂SeO₃、SeMet、Na₂SeO₄，且 峰型良好，其中前4种硒形态均在10min以内出峰，Na₂SeO₄的出峰时间较迟，在15min以后再出峰。 

(2)五种硒形态的线性范围、线性方程、相关系数和检出限见表2： 

表2五种硒形态的线性关系 

五种硒形态均获得良好的线性范围、线性方程、相关系数和检出限，说明本发明定量结果准确可靠，重复性和精确度良好。 

(3)含硒雷竹笋的硒形态： 

采用酶解法提取，通过HPLC-ICP-MS联用技术检测发现含硒雷竹笋中硒是以多种形态存在的，参见图2、图3，其中(A)峰是SeCys₂、(B)峰是MeSeCys、(C)峰是Na₂SeO₃、(D)峰是SeMet和(E)峰是Na₂SeO₄，五种硒形态得到较好的分离并出现了一未知峰X(9min左右)有待进一步研究。含硒雷竹笋中硒形态的含量见表3，主要以有机硒形式存在，且有机硒中主要以SeMet形式存在。 

表3含硒雷竹笋硒形态含量 

(4)五种硒形态的加标回收率： 

用酶水解提取考察了方法的加标实验效果，6次平行测定的样品加标回收实验结果见表4，反映出SeMet、SeCys₂、MeSeCys、Na₂SeO₃和Na₂SeO₄的平均回收率分别为118.9％、83.9％、94.9％、107.7％、96.3％，基本达到方法学所需要求，说明本发明定量结果准确可靠，重复性和精确度良好； 

表4五种形态硒的加标回收率(n＝6)

本发明采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS) 联用技术研究检测了含硒雷笋中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亚硒酸钠和硒酸钠5种形态，样品前处理简便快捷，流动相成分单一、配制简单，21min内可将5种硒形态完全分离，定量结果准确可靠，重复性和精确度良好，可完全满足竹笋中无机硒和有机硒形态分析的需要，为硒元素的准确定量和形态鉴定提供了切实可行的方法。 

Claims (1)

1.一种植物硒形态的检测方法，其特征是按照如下步骤进行：

(1)检测前期的准备：

①选用的设备：美国waters公司1525型高效液相色谱仪HPLC，美国Thermo Fisher Scientific公司XSeries2电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS，离心机，超声波仪，冻干机；

②HPLC与ICP-MS采用0.25mm聚醚醚酮PEEK管连接；

③选用的试剂：盐酸为分析纯，柠檬酸为色谱纯，4℃保存的链霉蛋白酶E，以上试剂均采购于上海生物工程有限公司；硒代胱氨酸(SeCys₂)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亚硒酸钠(Na₂SeO₃)和硒酸钠(Na₂SeO₄)，以上五个硒标准品的纯度≥98％，均采购于Sigma公司；

④五个硒标准品均用0.1mol/L HC1稀释为100μg/L的混标溶液，4℃保存；试验中所有试剂的配制均采用MΩ为18.2超纯水；

(2)建立高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱即HPLC-I CP-MS联用技术：

①HPLC的操作参数：采用Hamilton PRP-X100、250mm×4.1mm×10μm的阴离子柱为色谱柱，流动相为PH4.72 5m mol/L的柠檬酸，进样量为50μL，流速为1.0mL/min；

②ICP-MS的操作参数：采用射频功率为1300W，冷却气流速为13.0L/min，辅助气流速为0.8L/min，雾化气流速为0.85L/min，碰撞反应池为CCT模式，氢氦混合气比例为8∶92，混合气流速为6.95mL/min，测量同位素为⁷⁸Se；

(3)建立五种硒形态标准溶液的色谱图：取100μg/L硒混标溶液，采用步骤(2)HPLC-ICP-MS的操作参数进行检测，以保留时间Time/ms为横坐标，响应值Intensity/cps纵坐标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图；

(4)植物硒形态的提取与检测：

①选取植物材料用超纯水洗净，进行冷冻干燥、粉碎、过40目筛，并测出含水量，样品密封放在4℃保存备用；

②酶提取法：取样品粉末0.1g放入15mL离心管中，加入20mg链霉蛋白酶E，再加入3mL超纯水后，37℃超声提取30min，14000r/min离心30min，取上清液，过0.22μm滤膜2次，待测；

③待测样品按照步骤(2)建立的HPLC-ICP-MS联用技术进行硒形态的检测，以保留时间Time/ms为横坐标，响应值Intensity/cps纵坐标，建立样品硒形态色谱图，以采集图谱中所示样品各硒形态对应峰面积计算硒形态的含量：

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