CN112526047A - 基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法 - Google Patents

基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于超高效液相色谱‑高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法。本发明定量检测黄酮类化合物的方法包括：建立黄酮类化合物的标准曲线；获得待测样品的色谱峰面积；获得待测样品中黄酮类化合物的含量。本发明基于超高效液相色谱‑高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法，准确反映了沙棘中主要黄酮类化合物的真实含量，解决了目前沙棘中黄酮类化合物定性难、定量结果不准的问题，为开展沙棘果实质量等级划分提供了新的技术方案，方法灵敏度和分辨率高、结果稳定，可满足快速、高通量和准确检测的需求，具有良好的应用前景。

Description

基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮 类化合物的方法
技术领域
本发明涉及分析检测领域。更具体地，涉及基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法。
背景技术
沙棘是一种药食同源的植物，其功效成分主要包括多糖类、黄酮类、维生素类、脂类、三萜类及甾醇类等。沙棘中的黄酮类化合物在保护心血管系统、改善血液系统、增强免疫、抗氧化、抗癌、抗过敏、抑菌等方面均具有显著的药理活性，是衡量沙棘产品质量的重要指标。《中国药典》2015版一部(国家药典委员会.《中国药典》.2015年版.一部[S].2015:23,184.)沙棘的含量测定项中，总黄酮含量测定方法是以芦丁为对照品，亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠为显色剂，反应液于500nm测定吸收值，进行计算。异鼠李素以高效液相色谱法进行分析。郭亚健等(郭亚健,张兰珍.关于《中国药典》2005 年版中山楂叶、沙棘总黄酮含量测定的商榷.中国药品标准，2010,11(4)： 246-247.)指出，《中国药典》中总黄酮含量测定方法，不是黄酮类成分含量测定的专属方法，并不能反映沙棘中黄酮的真实含量。当一个供试品溶液中既含芦丁等结构类似的黄酮类化合物，也含有绿原酸或咖啡酸或原儿茶醛等非黄酮类化合物，或当一个供试品溶液中既有芦丁及其结构类似成分，又有山奈酚等黄酮，采用总黄酮含量测定方法所得结果均不能反应真实的总黄酮的含量。另外，沙棘中含有的黄酮类化合物有异鼠李素、槲皮素、以及以山柰酚为苷元的低聚糖苷，采用总黄酮含量测定方法所测得结果未包括山柰酚、异鼠李素的苷类成分，因此所得结果不是真实的总黄酮含量。由此可见，对沙棘的质量进行评价的传统分析技术存在着明显的技术缺陷，亟需发展新的质量评价体系，采用新的分析方法对沙棘中的黄酮进行定性和定量分析。
黄酮类化合物的定性方法主要包括紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、核磁共振法(NRM)、液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等。高分辨质谱由于分辨率高，选择性好，在化合物结构鉴定方面具有较大优势，为沙棘黄酮苷元结构鉴定提供了新的分析手段。Ma等(Ma XY,O Laaksonen,Zheng J,et al.Flavonol glycosides in berries of twomajor subspecies of sea buckthorn(
Figure BDA0002739269040000021
rhamnoides L.)and influence ofgrowth sites.Food Chemistry,2016,200:189-198.)采用HPLC-DAD-MS/MS分析技术，对中国四川、芬兰、加拿大等地的沙棘进行了鉴定和量化，共发现26种黄酮醇苷类化合物，并以异鼠李素和槲皮素为主要配基。秦振娴等(秦振娴，张瑜，齐梦蝶，等.中国沙棘和西藏沙棘叶中化学成分的UPLC/Q-TOF-MS快速分析, 中国中药杂志，2016,41(8)：1461-1468.)采用UPLC-Q-TOF-MS技术，在中国沙棘和西藏沙棘叶中发现了35种黄酮类化合物。
黄酮类化合物的定量分析方法主要有紫外分光光度法、液相色谱法和液相色谱-质谱法。在缺少具体的标准物质的情况下，通过紫外吸收光谱对黄酮类化合物进行定性，相对定量法进行定量，如张元元等(张元元，吕珊，陈梦杰等，沙棘酚类特征成分含量测定及其特征图谱质量表征关联分析研究，北京中医药大学学报，2018,41(5)：383-394.)采用液相色谱法对沙棘中的槲皮素和异鼠李素进行定量分析，定量方法为以水仙苷为参照，通过主要黄酮类成分的峰面积表征黄酮类成分含量。由于HPLC方法的选择性和灵敏度有限，对于具体的黄酮类化合物的定性和定量分析存在较大的局限性。液相色谱-串联质谱技术(HPLC-MS/MS)采用多反应检测模式(MRM)对化合物进行定量。王志聪等(王智聪，沙跃兵，余笑波，等.超高效液相色谱－二极管阵列检测－串联质谱法测定茶叶中15种黄酮醇糖苷类化合物，色谱， 2015,33(9)：974-980.)采用超高效液相色谱-二极管阵列检测-串联质谱法测定茶叶中15种黄酮醇糖苷类化合物，结合色谱保留时间、紫外光谱、一级和二级质谱参数等信息，在绿茶和红茶中共识别了15种黄酮醇糖苷类化合物，定量分析采用串联四级杆质谱，同时采用相对定量法，以槲皮素-3-葡萄糖- 鼠李糖二糖糖苷为标准品，其他黄酮醇糖苷进行相对定量。MRM是基于已知化合物信息，有针对性的选择母离子和子离子进行质谱信号采集，从而进行准确定量的质谱技术，具有灵敏、准确和特异等优点，缺点在于只能检测已知化合物，不能有效发现未知化合物，因此有可能漏掉重要的化合物信息。
目前已知沙棘中的黄酮主要是异鼠李素、槲皮素、山奈酚、杨梅素等黄酮苷元及其苷类，但具体到黄酮苷元的具体结构，不同的研究得出的结论并不相同。同时由于沙棘中的黄酮类化合物具有不同的配基和苷元，不同的化合物在质谱上的响应差别较大，因此采用相对定量法进行定量的准确性尚有待探讨。
因此，提供一种既能定性、又能准确定量分析沙棘中黄酮类化合物的方法，对于全面掌握沙棘中的活性成份，建立沙棘质量评价体系具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法，该方法能准确的反映沙棘中主要黄酮类化合物的真实含量。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法，
所述黄酮类化合物包括山柰酚、圣草酚、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、二氢槲皮素、异鼠李素、二氢杨梅素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-戊糖苷、槲皮素-3-O-异鼠李素、异鼠李素-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异夏佛塔苷、槲皮素-3-O-戊糖苷-7-O-鼠李糖苷、山奈酚 -3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-α-L-阿拉伯糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素 -3-O-葡糖糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-龙胆二糖苷、异鼠李素-二己糖苷、山奈酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O- 芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷和异鼠李素-3-O-芸香糖 -7-O-葡萄糖苷33种黄酮类化合物；
所述方法包括如下步骤：
建立黄酮类化合物的标准曲线：
选择24种黄酮类化合物作为标准对照品，以甲醇为溶剂配制24种黄酮类化合物的标准对照品储备液，吸取适量各标准对照品储备液混匀，用甲醇稀释得到混合标准中间液，吸取适量混合标准中间液，用NH4Ac-乙腈进行稀释得到5-10个含有已知浓度的24种黄酮类化合物的混合标准工作液；所述 24种黄酮类化合物包括山柰酚、圣草酚、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、二氢槲皮素、异鼠李素、二氢杨梅素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-异鼠李素、异鼠李素-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异夏佛塔苷、异鼠李素-3-O-α-L-阿拉伯糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖 -7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-龙胆二糖苷、山奈酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素 -3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将各混合标准工作液分别进行超高效液相色谱分离和高分辨质谱检测，确定各色谱图中各色谱峰的黄酮类化合物并获得各黄酮类化合物的色谱峰面积；
以各黄酮类化合物的浓度为横坐标，各黄酮类化合物的色谱峰面积为纵坐标，分别建立各黄酮类化合物的标准曲线；
获得待测样品的色谱峰面积：
在与建立黄酮类化合物的标准曲线中相同的色谱条件和质谱条件下对待测样品溶液进行超高效液相色谱分离和高分辨质谱检测，确定各色谱图中各色谱峰的黄酮类化合物及对应的色谱峰面积；
确定待测样品中33种黄酮类化合物的含量：
对于有标准对照品的各黄酮类化合物，根据已建立的各黄酮类化合物的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的有标准对照品的各黄酮类化合物的含量；
对于有同分异构体但无标准对照品的各黄酮类化合物，根据已建立的黄酮类化合物的同分异构体的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的有同分异构体但无标准对照品的各黄酮类化合物的含量；
对于既无同分异构体又无标准对照品的各黄酮类化合物，根据已建立的槲皮素-3-O-芸香糖苷的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的既无同分异构体又无标准对照品的各黄酮类化合物的含量。
在本发明中，上述有同分异构体但无标准对照品的黄酮类化合物包括异鼠李素-戊糖苷(同分异构体为槲皮素-3-O-异鼠李素)；山奈酚-3-O-葡萄糖 -7-O-鼠李糖苷(同分异构体为山奈酚-3-O-芸香糖苷)；槲皮素-3-O-葡萄糖 -7-O-鼠李糖苷(同分异构体为槲皮素-3-O-芸香糖苷)；槲皮素-3-O-葡糖糖 -7-O-葡萄糖苷(同分异构体为槲皮素-3-O-龙胆二糖苷)；槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷(同分异构体为槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷)、槲皮素 -3-O-芸香糖葡萄糖苷(同分异构体为槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷)、异鼠李素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷(同分异构体为异鼠李素-3-O-槐二糖 -7-O-鼠李糖苷)；
上述既无同分异构体又无标准对照品的黄酮类化合物包括槲皮素-3-O-戊糖苷-7-O-鼠李糖苷和异鼠李素-二己糖苷。
上述方法中，用甲醇稀释得到混合标准中间液时，得到的混合标准中间液的浓度为10μg/ml，即混合标准中间液中24种黄酮类化合物的浓度均为 10μg/ml；用NH4Ac-乙腈进行稀释得到5-10个含有已知浓度的24种黄酮类化合物的混合标准工作液是利用5mmol/LNH4Ac-乙腈(9:1，v/v)进行稀释得到8个含有已知浓度的24种黄酮类化合物的混合标准工作液，其中，8个混合标准工作液浓度分别为2.5，5.0，10，25，50，100，250，500ng/mL。
上述方法中，所述色谱条件为：
色谱柱：Waters HSS T3色谱柱，规格为2.1mm×150mm，1.7μm；
流动相：A相为5mmol/L醋酸铵溶液、B相为乙腈；
梯度洗脱程序：0～2min，10％B；2～12min，10％～90％B；12～17 min，90％B；17～17.1min，90％～10％B；17.1～20min，10％B；
柱温：35℃；
体积流量：0.20mL/min；
进样体积：10μL。
所述质谱条件为：
四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱(Q-Exactive)系统，离子源为加热电喷雾离子源(HESI)，参数如下：电离模式为负离子模式，喷雾电压为3.2kV，毛细管温度和辅助气温度分别为325℃和350℃，鞘气流速和辅助气流速分别为40L/min和10L/min，S-lens RF值为60，喷雾气和碰撞气均为氮气；
扫描方式为Full MS模式，参数如下：分辨率70 000FWHM，扫描范围 m/z 200-1000，自动增益控制(AGC)为1e6，最大注入时间(maximum IT)为 100ms。
进一步，所述高分辨质谱检测中特征离子信息如下所示：
Figure BDA0002739269040000051
Figure BDA0002739269040000061
*表示无标准对照品。
进一步，所述待测样品为沙棘。
进一步，所述待测样品溶液的制备方法为将沙棘鲜果均质，加石油醚振荡，离心，弃上层石油醚得残渣，在残渣中加入甲醇，振荡，离心，取上清液，过滤，得到待测样品溶液。
本发明进一步提供了基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术检测总黄酮含量的方法，所述方法包括：将上述方法获得的各黄酮类化合物的含量相加即得总黄酮含量。
本发明的有益效果如下：
与现有技术比较，本发明对沙棘中黄酮类化合物进行分离和结构解析，明确了多个同分异构体的结构信息，建立了沙棘中33种黄酮类化合物数据库，进而对33种黄酮类化合物定量分析，能涵盖沙棘中的主要黄酮类化合物。
本发明建立基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测沙棘中黄酮类化合物的方法，准确反映了沙棘中主要黄酮类化合物的真实含量，解决了目前沙棘中黄酮类化合物定性难、定量结果不准的问题，为开展沙棘果实质量等级划分提供了新的技术方案，方法灵敏度和分辨率高、结果稳定，可满足快速、高通量和准确检测的需求，具有良好的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出沙棘中33种黄酮类化合物的UPLC-Q-ExactiveMS色谱图；其中，1-33分别代表如下黄酮类化合物的色谱峰：1.山奈酚、2.圣草酚、3.儿茶素、4.表儿茶素、5.槲皮素、6.二氢槲皮素、7.异鼠李素、8.二氢杨梅素、9.山奈酚-3-O-葡萄糖苷、10.异鼠李素-戊糖苷、11.槲皮素-3-O-异鼠李素、12.异鼠李素-7-O-鼠李糖苷、13.槲皮素-3-O-葡萄糖苷、14.异鼠李素 -3-O-葡萄糖苷、15.异夏佛塔苷、16.槲皮素-3-O-戊糖苷-7-O-鼠李糖苷、17. 山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、18.异鼠李素-3-O-α-L-阿拉伯糖-7-O-α-L- 鼠李糖苷、19.山奈酚-3-O-芸香糖苷、20.槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、 21.槲皮素-3-O-芸香糖苷、22.异鼠李素-3-O-芸香糖苷、23.异鼠李素-3-O- 葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、24.槲皮素-3-O-葡糖糖-7-O-葡萄糖苷、25.槲皮素 -3-O-龙胆二糖苷、26.异鼠李素-二己糖苷、27.山奈酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、28.槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷、29.槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷、30.槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、31.槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷、32.异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、33.异鼠李素-3-O-芸香糖-7-O- 葡萄糖苷。
图2示出母离子[M-H]-精确质量数m/z609.14501对应的色谱图及二级质谱；其中，(a)为m/z609.14501提取离子色谱图，(b)为标准对照品提取离子色谱，(c)为色谱峰1对应二级质谱图，(d)为色谱峰2对应二级质谱图。
图3示出母离子[M-H]-精确质量数m/z 771.19783对应的色谱图及二级质谱；其中，(a)为m/z 771.19783提取离子色谱图，(b)为标准对照品提取离子色谱，(c)为色谱峰1对应二级质谱图，(d)为色谱峰2对应二级质谱图, (e)为色谱峰3对应二级质谱图。
图4示出不同沙棘样本中黄酮类化合物的含量分布区间图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中数据采集与处理采用Tracefinder 3.0软件。
下述实施例中的试剂与仪器：
UltiMate3000超高相液相色谱仪(美国Thermo Scientific公司)，配备在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、自动进样器；
四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱仪(Q-Exactive mass spectrometer)(美国Thermo Scientific公司)；
加热电喷雾离子源(HESI源)(德国Thermo Scientific公司)；
恒温振荡器(Memmert)，高速冷冻离心机(Sigma 3K15)，Milli-Q纯水器(美国Millipore公司)，涡旋混匀器(IKA MS3)。
实施例1沙棘中黄酮类化合物的超高效液相色谱-高分辨质谱技术 (UPLC-Q-Exactive-MS)数据库的建立及标准对照品的选择
一、沙棘样品制备：
沙棘鲜果用均质器均质，称量沙棘汁2.0g，加10mL石油醚，振荡30min， 8000rpm/min离心10min，弃去上层石油醚。在残渣中加入甲醇10mL，振荡 30min，8000rpm/min离心10min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到提取液。将提取液稀释20倍，得到沙棘鲜果待测液。
二、超高效液相色谱分离
将沙棘鲜果待测液注入到UltiMate3000超高相液相色谱仪中进行超高效液相色谱分离，获得色谱流出液；其中，超高效液相色谱分离的条件为：
色谱柱：Waters HSS T3色谱柱，规格为2.1mm×150mm，1.7μm；
流动相：A相为5mmol/L醋酸铵溶液、B相为乙腈；
梯度洗脱程序：
0～2min，10％B；2～12min，10％～90％B；12～17min，90％B； 17～17.1min，90％～10％B；17.1～20min，10％B；
柱温：35℃；
体积流量：0.20mL/min；
进样体积：10μL。
三、高分辨质谱进行数据采集，获得高分辨质谱数据
色谱流出液进入电喷雾离子源，经离子源雾化、电离后形成待测离子，待测离子进入四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱仪，经高分辨质谱检测器进行扫描，获得高分辨质谱数据，质谱条件为：离子源为加热电喷雾离子源(HESI)，设置参数如下：电离模式为负离子模式，喷雾电压为3.2kV，毛细管温度和辅助气温度分别为325℃和350℃，鞘气流速和辅助气流速分别为40L/min和 10L/min，S-lens RF值为60，喷雾气和碰撞气均为氮气。扫描方式采用Full MS/dd-MS2模式，即在一级全扫描基础上进行数据依赖型二级扫描：一级全扫描(Full MS)范围为m/z200-1000，分辨率为70 000FWHM，提取离子的质量精度为5ppm，自动增益控制(AGC)和离子注入时间(IT)分别设为1.0e6 和100ms；数据依赖型二级扫描(dd-MS2)分辨率为17 500FWHM，AGC为 2.0e5，最大IT为60ms，观察窗(isolation window)设置为2.0m/z，碰撞能量HCD 30。
四、对高分辨质谱数据进行特征离子提取及质谱数据解析，推测各色谱峰对应的黄酮类化合物
通过步骤二和步骤三的超高效液相色谱和高分辨质谱 (UPLC-Q-Exactive-MS)技术获得沙棘鲜果待测液的特征轮廓谱，基于质谱一级全扫描技术获取的化合物信息非常丰富，需要结合天然产物数据库检索功能初步判断沙棘中可能存在的黄酮类化合物。但由于目前数据库统计的化合物信息不全，另外数据库匹配出同分异构体数量较多，很难判断具体是哪一种化合物，需要在一级全扫描基础上通过二级扫描进一步进行质谱数据解析。具体对高分辨质谱数据进行解析包含以下步骤：
第一步：一级全扫描提取得到以下21个精确质量数的母离子的色谱图：285.03936，287.05501，289.07066，301.03428，303.04993，315.04993，319.04484，447.09219，461.10784，463.0871，477.10275，563.13953，579.13445，593.1501，609.14501，623.16066，625.13993，639.15558，755.20292，771.19783，785.21348。
第二步：二级扫描提取上述母离子的二级质谱，分析不同保留时间对应的二级质谱图，找出对应的子离子和丢失的碎片信息。根据以下碎片信息推测黄酮醇苷所带的糖基：葡萄糖苷(m/z 162)、五碳糖苷(m/z 132)、鼠李糖苷(m/z146)和葡萄糖醛酸苷(m/z 176)，根据以下碎片信息推测黄酮苷元母核：槲皮素m/z 301、异鼠李素m/z 315、山柰酚m/z 285。33种黄酮类化合物的提取离子流色谱图见图1，对应的保留时间见表1。
第三步：根据母离子、子离子、糖基信息、母核信息推测黄酮类化合物的结构，共解析出33种黄酮类化合物。
21个精确质量数对应的母离子提取色谱图中有如下9个质量数对应多个色谱峰：289.07066，447.09219，593.1501，609.14501，623.16066，625.13993， 755.20292，771.19783，785.21348，说明这些化合物有同分异构体的存在。
以母离子[M-H]-精确质量数m/z609.14501(提取离子色谱图如图2中(a) 所示)为例，提取离子流图有两个色谱峰，对应保留时间为7.68min和8.04min。提取这两个色谱图的二级质谱图，保留时间为7.68min的色谱峰对应的二级质谱图(图2中(c)所示)对应的两个子离子为m/z 446.08215和m/z 301.03305。 m/z 446.08215为m/z 609.14614脱去一分子鼠李糖，继而脱去一分子葡萄糖得到m/z 301.03305，m/z 301.03305与槲皮素特征离子峰符合，推测母核是槲皮素，鼠李糖苷和葡萄糖苷分别结合在槲皮素的两个位点，推测其结构为槲皮素 -3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷。保留时间为8.04min的色谱峰对应的二级质谱图(图2中(d)所示)对应一个子离子为m/z 301.03305，推测质谱裂解机理为母离子同时丢失一分子鼠李糖和一分子葡萄糖，即最有可能以芸香糖苷(一分子鼠李糖和一分子葡萄糖)的形式结合在母核的一个位点上，得到m/z 301.03407[M-H-146-162]。推测化合物结构为槲皮素-3-O-芸香糖苷，通过与标准品保留时间比对，进一步证实该化合物为槲皮素-3-O-芸香糖苷。
以母离子[M-H]-精确质量数m/z 771.19783(提取离子色谱图如图3中(a) 所示)为例，提取离子流图有三个色谱峰，对应保留时间为6.40min，7.06min 和7.45min。提取这三个色谱图的二级质谱图，保留时间为6.40min的色谱峰对应的二级质谱图(图3中(c)所示)对应的子离子为m/z 609.14099，462.07715 和m/z 300.02356。m/z 609.14099为m/z771.19783失去一分子葡萄糖，继而失去一分子鼠李糖得到m/z 462.07715，再失去一分子葡萄糖得到m/z 300.02356， m/z 300.02356与槲皮素特征离子峰符合，推测母核是槲皮素，通过与标准品保留时间比对，证实该化合物为槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷。保留时间为7.06min的色谱峰对应的二级质谱图(图3中(d)所示)对应子离子为m/z625.13708,m/z 446.08231和m/z 300.02356，推测质谱裂解机理为母离子丢失一分子鼠李糖得到m/z 625.13708，继而失去一分子槐糖得到m/z 446.08231，再失去一分子鼠李糖得到m/z 300.02356，推测化合物结构为槲皮素-3-O-槐二糖 -7-O-鼠李糖苷。保留时间为7.45min的色谱峰对应的二级质谱图(图3中(e) 所示)对应子离子为m/z 300.02356，即最有可能以芸香糖葡萄糖苷(一分子芸香糖和一分子葡萄糖)的形式结合在母核的一个位点上，推测化合物结构为槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷。
类似的，有标准品的化合物根据标准品对照保留时间，无标准品的化合物结合质谱信息解析，得到以下同分异构体信息：m/z 289.07066对应两个同分异构体，分别为儿茶素和表儿茶素；m/z 623.16066对应两个同分异构体，分别为异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷；m/z 625.13993对应两个同分异构体，分别为槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-龙胆二糖苷；m/z755.20292对应两个同分异构体，分别为山奈酚 -3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷；m/z785.21348对应两个同分异构体，分别为异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、异鼠李素 -3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷。m/z 447.09219对应三个同分异构体，分别为山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-戊糖苷和槲皮素-3-O-异鼠李素；m/z 593.15010 对应三个同分异构体，分别为山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素 -3-O-a-L-阿拉伯糖-7-O-a-L-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷。
将33种黄酮类化合物的名称、分子式、精确母离子质量数、保留时间、子离子质量数等信息输入质谱软件，建立沙棘中33种黄酮类化合物的高分辨质谱数据库，结果如表1所示。
表1 33种黄酮类化合物的高分辨质谱数据库信息
Figure BDA0002739269040000111
Figure BDA0002739269040000121
Figure BDA0002739269040000131
五、标准对照品的筛选
通过高分辨质谱鉴定出来沙棘中的33种黄酮类化合物，有24种可获得标准对照品，选择24种黄酮类化合物作为标准对照品实现相应黄酮类化合物的定量检测，24种黄酮类化合物标准对照品的特征离子信息如表2所示，包括：山柰酚、圣草酚、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、二氢槲皮素、异鼠李素、二氢杨梅素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-异鼠李素、异鼠李素-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异夏佛塔苷、异鼠李素-3-O-α-L-阿拉伯糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-龙胆二糖苷、山奈酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷。
表2 24种黄酮类化合物标准对照品的特征离子信息
Figure BDA0002739269040000132
Figure BDA0002739269040000141
实施例2基于UPLC-Q-Exactive-MS技术定量分析沙棘中黄酮类化合物时色谱和质谱条件的选择
一、色谱条件的选择
由于沙棘中的黄酮类化合物存在很多同分异构的现象，因此良好的色谱分离是准确定性定量分析的关键，不同色谱柱对色谱峰的分离效果有较大影响。比较了ThermoHypersil GOLD色谱柱(100×2.1mm,1.8μm)、Waters BEH C18 色谱柱(100×2.1mm,1.8μm)、Waters HSS T3色谱柱(2.1mm×150mm，1. 7μm)等色谱柱对分离效果的影响，结果表明：Waters HSS T3色谱柱的分离效果最好，所获得的同分异构体信息最全，因此选择WatersHSS T3色谱柱(规格为2.1mm×150mm，1.7μm)进行黄酮类化合物的含量分析。
不同的梯度洗脱溶剂对色谱峰分离度、峰形以及离子响应有较大影响。比较了水-乙腈、0.1％甲酸-水-乙腈，5mmol/L醋酸铵-乙腈、5mmol/L醋酸铵- 甲醇4种流动相对色谱峰分离度、峰形以及离子响应的影响，结果表明：当采用不含甲酸的水-乙腈梯度洗脱时，色谱峰容易拖尾，加入0.1％甲酸后，可改善拖尾现象，但同时甲酸对负离子电离模式的离子相应有抑制作用，对微量成分的定量分析不利。加入5mmol/L醋酸铵可提高黄酮类化合物的离子响应，且获得的色谱峰峰形对称。采用5mmol/L醋酸铵-甲醇为流动相时，大部分化合物都在高比例有机相时出峰，出峰时间比较集中，分离度较差，采用5mmol/L 醋酸铵-乙腈为流动相时，分离效果最好，所获得的同分异构体信息最全，最终选择5mmol/L醋酸铵-乙腈作为梯度洗脱溶剂。
不同梯度洗脱程序对分离效果的影响。比较了不同梯度程序对分离效果的影响，结果表明：当梯度洗脱时间设置为14min时(0～1min，10％B；1～ 4min，10％～50％B；4～6.5min，50％～95％B；6.5～10.0min， 95％B；10.1min，95％～10％B；10.1～14min，10％B)，化合物的分离度不够理想，部分同分异构体如槲皮素-3-O-异鼠李素和山奈酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间没有差异。当梯度时间设置为20min时(0～2min，10％B；2～ 12min，10％～90％B；12～17min，90％B；17～17.1min，90％～10％B； 17.1～20min，10％B)，槲皮素-3-O-异鼠李素和山奈酚-3-O-葡萄糖苷得到了基线分离。母离子m/z为289.07066、593.15010、609.14501、623.16066、625.13993、 755.20292、771.19783、785.21348的同分异构体均得到了有效分离。
通过以上分析，在基于UPLC-Q-Exactive-MS技术定量分析沙棘中黄酮类化合物时，超高效液相色谱分离的条件为：
色谱柱：Waters HSS T3色谱柱(规格为2.1mm×150mm，1.7μm)；
流动相：A相为5mmol/L醋酸铵溶液、B相为乙腈；
梯度洗脱程序：
0～2min，10％B；2～12min，10％～90％B；12～17min，90％B； 17～17.1min，90％～10％B；17.1～20min，10％B；
柱温：35℃；
体积流量：0.20mL/min；
进样体积：10μL。
二、质谱分析条件的选择
高分辨质谱的最大优势在于不用对单一标准品的具体参数进行设置，采用全扫描模式可以最大限度的获取样品中的质谱信息，在后续数据处理过程中再根据需要对待测化合物进行精确质量数提取。由实施例1可以看出，沙棘中大部分黄酮类化合物的分子量介于m/z 200-1000，选择质谱扫描范围为m/z 200-1000。
比较采用正离子模式和负离子模式分析黄酮类化合物，比对发现：在负离子模式下，黄酮类化合物的质谱响应更好，因此，选择电离模式采用负离子模式进行数据采集。
通过以上分析，在基于UPLC-Q-Exactive-MS技术定量分析沙棘中黄酮类化合物时，高分辨质谱的条件为：四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱(Q-Exactive) 系统，离子源为加热电喷雾离子源(HESI)，参数如下：电离模式采用负离子模式，喷雾电压为3.2kV，毛细管温度和辅助气温度分别为325℃和350℃，鞘气流速和辅助气流速分别为40L/min和10L/min，S-lens RF值为60，喷雾气和碰撞气均为氮气；
扫描方式为Full MS模式，参数如下：分辨率70 000FWHM，扫描范围 m/z 200-1000，自动增益控制(AGC)为1e6，最大注入时间(maximum IT)为 100ms。
实施例3基于UPLC-Q-Exactive-MS技术定量分析沙棘中黄酮类化合物的方法
一、实验方法
1.1.标准溶液的制备
精密称取实施例1中表2的24种黄酮类化合物作为标准对照品，分别置于 10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度约为200μg/ml 的相应的24种黄酮类化合物的标准对照品储备液，避光冷冻保存(-20℃)。精密吸取适量体积的各标准对照品储备液，混匀，用甲醇稀释浓度至10μg/ml 的混合标准中间液，吸取适量混合标准中间液，用5mmol/L NH4Ac-乙腈(9:1， v/v)进行稀释得到8个含有已知浓度的24种黄酮类化合物的混合标准工作液，备用。其中，8个混合标准工作液浓度分别为2.5，5.0，10，25，50，100，250，500ng/mL。
1.2.混合标准工作液的分析
在相同的质谱条件和色谱条件下，将各混合标准工作液分别注入 UltiMate3000超高效液相色谱仪中进行超高效液相色谱分离，并通过四级杆- 静电场轨道阱超高分辨质谱仪进行高分辨质谱检测，根据表2确定各色谱图中各色谱峰的黄酮类化合物，获得各黄酮类化合物的色谱峰面积Y；以各黄酮类化合物的浓度X为横坐标，各黄酮类化合物的色谱峰面积Y为纵坐标，建立各黄酮类化合物的标准曲线。
1.3沙棘样品的采集
沙棘鲜果采集于新疆阿勒泰、吉林白城、四川阿坝、山西吕梁，共14个样本，14个样本的品种、产地、经度、纬度、海拔高度、采摘时间等信息见表 3。
表3沙棘样品信息
Figure RE-GDA0002941864480000161
Figure RE-GDA0002941864480000171
1.4沙棘样品前处理
沙棘鲜果用均质器均质，称量沙棘汁2.0g，加10mL石油醚，振荡30min， 8000rpm/min离心10min，弃去上层石油醚。在残渣中加入甲醇10mL，振荡 30min，8000rpm/min离心10min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到沙棘样品提取液。
1.5沙棘样品提取液分析
将沙棘样品提取液稀释50倍，得到稀释液，在与步骤1.2相同的质谱条件和色谱条件下，取10μL稀释液注入UltiMate3000超高效液相色谱仪中进行超高效液相色谱分离，并通过四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱仪进行高分辨质谱检测，根据表2确定各色谱图中各色谱峰的黄酮类化合物及对应的色谱峰面积。
根据1.2中已建立的各黄酮类化合物的标准曲线和沙棘样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得各个沙棘样品的33种黄酮类化合物的含量，具体为：
对于有标准对照品的各黄酮类化合物(表2中示出的24种黄酮类化合物)，根据已建立的各黄酮类化合物的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的有标准对照品的各黄酮类化合物的含量；
对于有同分异构体但无标准对照品的各黄酮类化合物(7种，分别为异鼠李素-戊糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡糖糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷)，根据已建立的黄酮类化合物的同分异构体(异鼠李素-戊糖苷的同分异构体为槲皮素-3-O-异鼠李素、山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷的同分异构体为山奈酚 -3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷的同分异构体为槲皮素 -3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡糖糖-7-O-葡萄糖苷的同分异构体为槲皮素 -3-O-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷的同分异构体均为槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O- 芸香糖-7-O-葡萄糖苷的同分异构体为异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷)的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的有同分异构体但无标准对照品的各黄酮类化合物的含量；
对于既无同分异构体又无标准对照品的各黄酮类化合物(2种，分别为槲皮素-3-O-戊糖苷-7-O-鼠李糖苷、和异鼠李素-二己糖苷)，根据已建立的槲皮素-3-O-芸香糖苷的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的既无同分异构体又无标准对照品的各黄酮类化合物的含量。
1.6色谱条件
色谱柱：Waters HSS T3色谱柱，规格为2.1mm×150mm，1.7μm；
流动相：A相为5mmol/L醋酸铵溶液、B相为乙腈；
梯度洗脱程序：0～2min，10％B；2～12min，10％～90％B；12～17 min，90％B；17～17.1min，90％～10％B；17.1～20min，10％B；
柱温：35℃；
体积流量：0.20mL/min；
进样体积：10μL。
1.7质谱条件
四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱(Q-Exactive)系统，离子源为加热电喷雾离子源(HESI)，参数如下：电离模式为负离子模式，喷雾电压为3.2kV，毛细管温度和辅助气温度分别为325℃和350℃，鞘气流速和辅助气流速分别为40L/min和10L/min，S-lens RF值为60，喷雾气和碰撞气均为氮气；
扫描方式为Full MS模式，参数如下：分辨率70 000FWHM，扫描范围 m/z 200-1000，自动增益控制(AGC)为1e6，最大注入时间(maximum IT)为 100ms。
二、结果与分析
2.1线性关系、最低定量限、最低检出线考察
以各黄酮类化合物的色谱峰面积Y对浓度X作线性回归，绘制各黄酮类化合物的标准曲线，以信噪比(S/N)3为最低检出限(LOD)，信噪比(S/N) 10为最低定量限(LOQ)。结果如表4所示，24个黄酮类化合物在2.5-500ng/mL 浓度范围内，具有良好的线性关系，LOD为1.0ng/mL，LOQ为3.0ng/mL。
表4 24种黄酮类化合物的线性和灵敏度
Figure BDA0002739269040000191
Figure BDA0002739269040000201
2.2重复性和精密度实验
精密称取已知含量的同一份样品9份，每份2g，取24种黄酮类化合物的混合标准工作液，以相当于样品原含有质量的50％，100％，150％的量加入样品中，每个浓度平行制备3份，按照1.4和1.5所述方法制备供试品溶液，进样分析，计算回收率和相对标准偏差，结果表明，24种黄酮类化合物的平均加标回收率在84.0％-110.5％，RSD值均小于15％，表明该方法准确可靠。
2.3样品测定结果
根据上述方法得到14个沙棘鲜果样品的各黄酮类化合物的含量，结果见表5。根据各个沙棘样品的含水率，计算相应干燥品中黄酮类化合物的总含量。结果表明，不同的沙棘样品中黄酮类化合物的含量范围为217.32–853.76 mg/100g(以干重计)。其中，含量最高的是来自四川阿坝的野生沙棘S13，含量最低的是新疆阿勒泰的深秋红S10。S1-S10均采自新疆阿勒泰同一地区，不同品种间黄酮类化合物的含量有所差别，介于217.32–518.68mg/100g(以干重计) 之间。S10、S11和S12均为同一品种深秋红，分别生长于新疆阿勒泰、新疆阿克苏和吉林白城三个地区，黄酮类化合物的含量分别为217.32mg/100g、 652.00mg/100g和221.99mg/100g。三个地区中新疆阿克苏位于较高海拔地区，其黄酮类化合物的含量明显高于其他两个海拔较低地区。
表5不同沙棘样品中黄酮类化合物的含量(mg/100g)
Figure BDA0002739269040000202
Figure 1
注：该表中的编号与表1中的编号对应的黄酮类化合物名称相同
33种黄酮类化合物以槲皮素苷类和异鼠李素苷类为主要存在形态，实验结果表明，约98％的黄酮以槲皮素苷元和异鼠李素苷元的形态存在，槲皮素苷元平均含量为50.0％，异鼠李素苷元平均含量为48.3％，另外含有0.9％左右的山奈酚苷元和0.6％左右的儿茶素。异鼠李素苷元的主要存在形态为异鼠李素 -3-O-芸香糖苷(水仙苷)及其同分异构体异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、异鼠李素-二己糖苷；槲皮素苷元的主要存在形态为槲皮素-3-O-芸香糖苷(芦丁)及其同分异构体槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷-葡萄糖苷。
不同样品中槲皮素苷元和异鼠李素苷元的比例有较大不同，S1、S2、S10、 S11、S12、S13总异鼠李素苷元所占比例(49.28％-79.57％)高于总槲皮素苷元(18.94％-47.94％)，S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S14总槲皮素苷元所占比例(55.04％-72.07％)大于总异鼠李素苷元(27.5％-42.85％)。
三、黄酮含量在沙棘质量评价中的应用
对来自新疆、四川、吉林、山西等不同产地不同品种的沙棘样品进一步分析，沙棘中黄酮类化合物的含量分布区间结果见图4，从图4可以看出，沙棘中黄酮类化合物的含量大致分布为三个浓度区间：<300mg/100g， 300mg/100g～600mg/100g，以及>600mg/100g，有2个样本的结果低于 300mg/100g，占总样本量的14％，10个样本的结果介于300-600mg/100g之间，占总样本量的71％，2个样本的结果高于600mg/100g，占总样本量的14％。
14个样本中，人工栽培品种有8个，平均值为357.1mg/100g，野生品种有 6个，平均值为532.4mg/100g。野生品种中黄酮类化合物的含量明显高于人工栽培品种。
对比例1石油醚和正己烷除酯的效果比较
为了尽可能将沙棘中的黄酮类化合物全部提取出来，本实验选取S5沙棘样品考察沙棘样品前处理方法对黄酮类化合物提出效率的影响。将实施例3 中“2、沙棘样品前处理”中的石油醚替换为正己烷，结果发现采用正己烷除酯后山奈酚未检出，而采用石油醚除酯可检出山奈酚苷元成分，因此，沙棘样品前处理选用石油醚除酯。
对比例2甲醇提取次数的比较
将实施例3中“2、沙棘样品前处理”中残渣用甲醇提取4次，8000rpm/min 离心10min后取上清液，再进一步进行后续的检测，比较提取次数的影响，结果发现95％以上的黄酮类化合物在第1遍后即可提取出来，第2遍可提取剩余5％左右的黄酮类化合物，第3遍和第4遍几乎没有检出黄酮类化合物。由于提取1遍即可提取出95％以上的黄酮类化合物，因此，最终选择甲醇提取1次。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术定量检测黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述黄酮类化合物包括山柰酚、圣草酚、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、二氢槲皮素、异鼠李素、二氢杨梅素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-戊糖苷、槲皮素-3-O-异鼠李素、异鼠李素-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异夏佛塔苷、槲皮素-3-O-戊糖苷-7-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-α-L-阿拉伯糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡糖糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-龙胆二糖苷、异鼠李素-二己糖苷、山奈酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷和异鼠李素-3-O-芸香糖-7-O-葡萄糖苷33种黄酮类化合物；
所述方法包括如下步骤：
建立黄酮类化合物的标准曲线：
选择24种黄酮类化合物作为标准对照品，以甲醇为溶剂配制24种黄酮类化合物的标准对照品储备液，吸取各标准对照品储备液混匀，用甲醇稀释得到混合标准中间液，吸取混合标准中间液，用NH4Ac-乙腈进行稀释得到5-10个含有已知浓度的24种黄酮类化合物的混合标准工作液；所述24种黄酮类化合物包括山柰酚、圣草酚、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、二氢槲皮素、异鼠李素、二氢杨梅素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-异鼠李素、异鼠李素-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异夏佛塔苷、异鼠李素-3-O-α-L-阿拉伯糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-龙胆二糖苷、山奈酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-槐二糖-7-O-鼠李糖苷；
在相同的色谱条件和质谱条件下，将各混合标准工作液分别进行超高效液相色谱分离和高分辨质谱检测，确定各色谱图中各色谱峰的黄酮类化合物并获得各黄酮类化合物的色谱峰面积；
以各黄酮类化合物的浓度为横坐标，各黄酮类化合物的色谱峰面积为纵坐标，建立各黄酮类化合物的标准曲线；
获得待测样品的色谱峰面积：
在与建立黄酮类化合物的标准曲线相同的色谱条件和质谱条件下对待测样品溶液进行超高效液相色谱分离和高分辨质谱检测，确定各色谱图中各色谱峰的黄酮类化合物及对应的色谱峰面积；
确定待测样品中33种黄酮类化合物的含量：
对于有标准对照品的各黄酮类化合物，根据已建立的各黄酮类化合物的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的有标准对照品的各黄酮类化合物的含量；
对于有同分异构体但无标准对照品的各黄酮类化合物，根据已建立的黄酮类化合物的同分异构体的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的有同分异构体但无标准对照品的各黄酮类化合物的含量；
对于既无同分异构体又无标准对照品的各黄酮类化合物，根据已建立的槲皮素-3-O-芸香糖苷的标准曲线和待测样品的各黄酮类化合物的色谱峰面积，分别获得待测样品的既无同分异构体又无标准对照品的各黄酮类化合物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件为：
色谱柱：Waters HSS T3色谱柱，规格为2.1mm×150mm，1.7μm；
流动相：A相为5mmol/L醋酸铵溶液、B相为乙腈；
梯度洗脱程序：
0～2min，10％B；2～12min，10％～90％B；12～17min，90％B；17～17.1min，90％～10％B；17.1～20min，10％B；
柱温：35℃；
体积流量：0.20mL/min；
进样体积：10μL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件为：
四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱系统，离子源为加热电喷雾离子源，参数如下：电离模式为负离子模式，喷雾电压为3.2kV，毛细管温度和辅助气温度分别为325℃和350℃，鞘气流速和辅助气流速分别为40L/min和10L/min，S-lens RF值为60，喷雾气和碰撞气均为氮气；
扫描方式为Full MS模式，参数如下：分辨率70 000FWHM，扫描范围m/z 200-1000，自动增益控制为1e6，最大注入时间为100ms。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高分辨质谱检测时特征离子信息如下所示：
Figure FDA0002739269030000031
*表示无标准对照品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为沙棘。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样品溶液的制备方法为将沙棘鲜果均质，加石油醚振荡，离心，弃上层石油醚得残渣，在残渣中加入甲醇，振荡，离心，取上清液，过滤，得到待测样品溶液。
7.基于超高效液相色谱-高分辨质谱技术检测总黄酮含量的方法，其特征在于，将权利要求1-6任一所述的方法获得的各黄酮类化合物的含量相加得总黄酮含量。
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