CN112858550A - 一种不同厂家/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法,其特征在于采用高效液相色谱法测定银杏叶或银杏叶提取物或其注射液制剂的银杏叶指纹图谱。方法包括:(a)供试品溶液的制备;(b)HPLC检测条件;(c)差异性分析。该方法采用紫外检测器与蒸发光散射检测器串联的方法建立银杏叶的HPLC指纹图谱,能够同时检测黄酮类化合物和萜内酯类化合物,有利于全面监控药材的质量。该方法对供试品的前处理简单,特征性成分保留完整,方法重复性好,精密度高;可快速、准确、全面地反应银杏叶药材、提取物及其注射液制剂的质量概貌。可用于银杏叶药材、提取物及其注射液制剂全过程质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及中药药材的指纹图谱分析技术领域,具体涉及一种不同厂 家和/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法,其特征在于采用 高效液相色谱法测定银杏叶或银杏叶提取物或其注射液制剂的银杏叶指纹 图谱。
背景技术
中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后,采用一定的 分析手段,得到的能够标示其化学特征的图谱。中药色谱指纹图谱能较为 全面地反映中药中所含化学成分的种类与数量,从整体上控制药材的质量。 它是现阶段可以较全面反映中药材内在质量的最有效的手段之一。
银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科银杏属植物,是现存最古老的物种 之一。银杏叶是其干燥叶,作为我国传统中医,具有扩张血管、改善脑循 环、抑制血小板活化因子(PAF)等作用,是一种极有开发利用前途的天然植 物药资源。银杏叶中的主要成分有黄酮、萜内酯、有机酸、氨基酸、聚戊 烯醇、糖、矿物质、色素、生物碱等,其中有效成分为黄酮类和萜烯内酯 类化合物。两类物质差异较大,通常分别采用不同的方法进行测定,包括 银杏叶黄酮指纹图谱方法和內酯含量测定方法,其中內酯含量测定方法尤 为复杂、耗时。因此如果能够发展一种简单、快速,且能够同时反映黄酮 和內酯的指纹图谱方法,对于银杏叶的质量控制具有重要意义和实用价值。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种采用双检测器的银杏叶高效液相指纹图 谱建立方法及其标准指纹图谱,该方法使用紫外检测器(UV)及蒸发光散 射检测器(ELSD)串联的方式,实现对银杏叶药材、提取物及其注射液制 剂中黄酮指纹峰和内酯指纹峰的同时检测,进而根据谱图提供一种不同厂 家和/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法,完成对于银杏叶 的质量控制具有重要意义和实用价值。
本发明是通过以下技术方案来实现:
银杏叶药材指纹图谱的检测方法,包括如下步骤:
1)供试品溶液的制备:
银杏叶药材供试品的制备:取2个以上不同厂家和/或相同厂家不同批 次银杏叶药材粉末(过50目筛,取通过筛子的组分)4g,置索氏提取器中, 加60ml石油醚(馏分30-60℃)在60℃水浴上回流提取1小时,弃去石油 醚(馏分30-60℃)液,药渣挥尽石油醚,置于60℃烘箱中烘干;转移至 具塞锥形瓶中,再加入甲醇40mL声处理(功率200W,频率40kHz)30分钟,放冷至室温,用甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取提取液25mL,蒸 干,残渣加甲醇溶解,转移至容量瓶中,加甲醇稀释至5ml,摇匀,用22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得银杏叶药材供试品溶液;
或,银杏叶提取物供试品的制备:精密称取2个以上不同厂家和/或相 同厂家不同批次银杏叶提取物60mg,加入甲醇溶解,转移至容量瓶中, 加甲醇稀释至5ml,摇匀,用22μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得银杏叶 提取物供试品。
或,银杏叶注射液制剂供试品的制备:量取2个以上不同厂家和/或相 同厂家不同批次银杏叶注射剂制剂供试品10mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加 甲醇溶解,转移至容量瓶中,加甲醇稀释至2ml,摇匀,用22μm微孔滤膜 过滤,取续滤液,即得舒血宁注射液供试品;
2)HPLC检测:采用高效液相色谱-紫外-ELSD检测串联系统分别对供 试品溶液进行分析;获得供试品的紫外谱图和ELSD谱图。
色谱柱为Waters-ACCHROM Tnature C18(250mm×4.6mm,5μm); 柱温为20~40℃;流速为0.8~1.2ml/min;流动相A为甲醇,流动相B为 0.1~1%甲酸溶液;进行梯度洗脱。
梯度洗条件为:0~10min,10%A;10~35min,线性10%~20%A;35~53 min,线性40%~52%A;53~65min,线性52%~100%A;65~85min,100%A。
紫外检测波长为360nm。
蒸发光散射检测器的漂移管温度75℃,气体压力40psi,增益为100。
3)数据分析:通过不同供试品的紫外谱图和ELSD谱图,进行不同厂 家和/或相同厂家不同批次银杏叶药材的差异性分析,计算相似度;
或,通过不同供试品的紫外谱图和ELSD谱图,进行不同厂家和/或相 同厂家不同批次银杏叶提取物的差异性分析,计算相似度;
或,通过不同供试品的紫外谱图和ELSD谱图,进行不同厂家和/或相 同厂家不同批次银杏叶注射剂制剂的差异性分析,计算相似度。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1、本方法采用紫外检测器与ELSD检测器串联的方法建立银杏叶的HPLC 指纹图谱,能够同时检测黄酮类化合物和萜内酯类化合物,有利于全面监 控药材的质量。
2、方法简单,稳定,精密度高,重现性好,且样品处理简单,色谱条 件容易实现,未使用有毒有害的溶剂,对环境无害。
3、本发明所建立的标准指纹图谱有15个共有峰,信息量较大,较完 整的保留化学信息。
4、该方法可快速准确的对产品进行分析。
下面通过实施例及附图对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1实例1银杏叶药材的分析谱图
图2实例2银杏叶提取物的分析谱图
图3实例3银杏叶注射液制剂的分析谱图
图4 10批次银杏叶指纹图谱叠加图
图5银杏叶药材标准指纹图谱
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步地说明。但这些实施例仅限于说明 本发明而不是用于限制本发明的范围。
仪器:Waters Alliance高效液相色谱仪(2695梯度泵,2498紫外检 测器,2424蒸发光检测器,自动进样器,柱恒温系统,Empower色谱工作 站)。
试剂:乙腈(色谱纯,MERYER),甲醇(色谱纯,MERYER,中国),甲 酸(色谱纯,Sigma-Aldrich),实验用水为Mill-Q纯水系统生成;其余试 剂均为分析纯。
对照品:芦丁(含量:91.7%;批号:100080-201811,中国食品药品 检定研究院);银杏内酯J(含量:≥98%;批号:D29J0G53845,上海源叶 生物有限公司);银杏内酯A(实验室自制)
实施例1银杏叶药材的指纹图谱
1.供试品溶液的制备:精密称取银杏叶药材粉末(过3号筛),索式 提取后,加入甲醇,超声处理后,放冷,用甲醇补足减失重量,摇匀,滤 过,取滤液浓缩5倍,即得银杏叶药材供试品溶液。
2.对照品溶液的制备:取芦丁和银杏内酯A、银杏内酯J对照品适量, 精密称定,加甲醇制成每1mL各含0.5~2mg的混合溶液,即得对照品溶 液。
3.HPLC检测:采用高效液相色谱-紫外-蒸发光散射检测器进行分析。
色谱柱为Waters-ACCHROM Tnature C18(250mm×4.6mm,5μm); 柱温为30℃;流速为1ml/min;流动相A为甲醇,流动相B为甲酸溶液; 进行梯度洗脱。
梯度洗条件为:0~10min,10%A;10~35min,线性10%~20%A;35~53 min,线性40%~52%A;53~65min,线性52%~100%A;65~85min,100%A。
紫外检测波长为360nm。
蒸发光散射检测器的漂移管温度75℃,气体压力为25psi,增益为 100。
4.分析:进样10uL进行分析检测,得到谱图见图1。
实施例2银杏叶提取物的指纹图谱
1.供试品溶液的制备:精密称取提取物60mg,加入少量甲醇溶解, 后置2mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得银杏 叶提取物供试品。
2.对照品溶液的制备:取芦丁和银杏内酯A、银杏内酯J对照品适量, 精密称定,加甲醇制成每1mL各含0.5~2mg的混合溶液,即得对照品溶 液。
3.HPLC检测:采用高效液相色谱-紫外-蒸发光散射检测器进行分析。
色谱柱为Waters-ACCHROM Tnature C18(250mm×4.6mm,5μm); 柱温为30℃;流速为1ml/min;流动相A为甲醇,流动相B为甲酸溶液; 进行梯度洗脱。
梯度洗条件为:0~10min,10%A;10~35min,线性10%~20%A;35~53 min,线性40%~52%A;53~65min,线性52%~100%A;65~85min,100%A。
紫外检测波长为360nm。
蒸发光散射检测器的漂移管温度75℃,气体压力为25psi,增益为 100。
4.分析:进样10uL进行分析检测,得到谱图见图2。
实施例3银杏叶注射液制剂的指纹图谱
1.供试品溶液的制备:精密量取本品10mL,置蒸发皿中蒸干,残渣 加甲醇溶解,转移至5mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续 滤液,即得银杏叶注射液制剂供试品。
2.对照品溶液的制备:取芦丁和银杏内酯A、银杏内酯J对照品适量, 精密称定,加甲醇制成每1mL各含0.5~2mg的混合溶液,即得对照品溶 液。
3.HPLC检测:采用高效液相色谱-紫外-蒸发光散射检测器进行分析。
色谱柱为Waters-ACCHROM Tnature C18(250mm×4.6mm,5μm); 柱温为30℃;流速为1ml/min;流动相A为甲醇,流动相B为甲酸溶液; 进行梯度洗脱。
梯度洗条件为:0~10min,10%A;10~35min,线性10%~20%A;35~53 min,线性40%~52%A;53~65min,线性52%~100%A;65~85min,100%A。
紫外检测波长为360nm。
蒸发光散射检测器的漂移管温度75℃,气体压力为25psi,增益为 100。
4.分析:进样10uL进行分析检测,得到谱图见图3。
实施例4质谱定性分析
1.分析条件:同实施例1。
2.供试品溶液的制备:同实施例1。
3.对照品溶液的制备:同实施例1。
4.分析结果:在最佳分离条件下,采用标准品对银杏叶药材的指纹峰 进行定性,同时对未知的主成分峰进行质谱定性分析,如图4,含有白果内 酯、银杏内酯J(1)、银杏内酯C(2)、槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖 基葡萄糖苷(3)、杨梅素-3-O-芸香糖苷(4)、银杏内酯A(5)、蝶豆素(6)、 银杏内酯A(7)、芦丁(8)、万寿菊素-3-O-芸香糖苷(9)、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖基鼠李糖苷(10)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(11)、水仙苷(12)、槲 皮素-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷(13)、山奈酚-3-O-2”-葡萄糖基 鼠李糖苷(14)、山奈酚-3-O-对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷(15)。
实施例5方法学考察
1.仪器精密度验证
依照实施例1样品制备方法及色谱条件,制备一份供试品溶液连续进 样6次,记录色谱指纹图如图2,取同一银杏叶供试品溶液,在上述液相色 谱条件下重复进样6次,每次10μL,分别在ELSD和UV条件下记录指纹图 谱。ELSD检测器条件下,各特征峰的相对保留时间RSD均小于1%,主要特 征峰的相对峰面积RSD小于5%;UV检测器条件下,各特征峰的相对保留时 间RSD均小于1%,相对峰面积RSD小于5%,以上结果表明仪器精密度良好。
2.稳定性验证
依照实施例1样品制备方法及色谱条件,制备一份供试品溶液,分别 于0h、6h、12h、18h、24h注入液相色谱仪,记录指纹图谱。ELSD检测器 条件下,各特征峰的相对保留时间RSD均小于1%,主要特征峰的相对峰面 积RSD小于5%;紫外检测器条件下,各特征峰的相对保留时间RSD均小于 1%,相对峰面积RSD小于5%,以上结果表明仪器精密度良好。
3.日内重复性验证
依照实施例1样品制备方法及色谱条件,制备6份供试品溶液,进样, 记录指纹图谱。ELSD检测器条件下,各特征峰的相对保留时间RSD均小于 1%,主要特征峰的相对峰面积RSD小于5%;紫外检测器条件下,各特征峰 的相对保留时间RSD均小于1%,相对峰面积RSD小于5%,以上结果表明该 方法重复性良好。
4.经本实施例中各项验证,本发明建立的定量指纹谱方法进行指纹图 谱分析可靠。
实施例6银杏叶药材相似度评价
采用实施例1建立的指纹谱方法,对9个批次的不同产地,不同生长 年限的银杏叶药材分析,药材来源如下。
表1银杏叶药材信息表
采用国家药典委员会“中药色谱指纹相似度评价系统”(2004A)对9 个批次银杏叶药材进行相似度计算,结果见表2,相似度从0.859到0.974, 差异较大。
表2 9个批次银杏叶药材原料相似度计算结果
实施例7银杏叶标准对照指纹图谱
采用实施例1建立的指纹谱方法,对10个批次的银杏叶药材分析,药材 信息见表3,录10-60分钟色谱峰信息,生成叠加图见图4,其平均谱作为银 杏叶药材投料标准指纹图谱,见图5,其中共有峰17个。
表3优质银杏叶药材信息表
Claims (9)
1.一种不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法,其特征在于采用高效液相色谱法测定银杏叶或银杏叶提取物或其注射液制剂的银杏叶指纹图谱,具体包括如下步骤:
1)供试品溶液的制备:
银杏叶药材供试品的制备:取2个以上不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶药材粉末(过50目筛,取通过筛子的组分)1-5g,置索氏提取器中,加40-60ml石油醚(馏分30-60℃)在60-70℃水浴上回流提取1-3小时,弃去石油醚(馏分30-60℃)液,药渣挥尽石油醚,置于40-60℃烘箱中烘干;转移至具塞锥形瓶中,再加入甲醇40-50mL声处理(功率200W,频率40kHz)30-60分钟,放冷至室温,用甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取提取液25-30mL,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至容量瓶中,加甲醇稀释至5-10ml,摇匀,用22-40μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得银杏叶药材供试品溶液;或,银杏叶提取物供试品的制备:精密称取2个以上不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶提取物60-80mg,加入甲醇溶解,转移至容量瓶中,加甲醇稀释至2-5ml,摇匀,用22-40μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得银杏叶提取物供试品。
或,银杏叶注射液制剂供试品的制备:量取2个以上不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶注射剂制剂供试品10-12mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至容量瓶中,加甲醇稀释至2-5ml,摇匀,用22-40μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得舒血宁注射液供试品;
2)HPLC检测:采用高效液相色谱-紫外-ELSD检测串联系统分别对供试品溶液进行分析;获得供试品的紫外谱图和ELSD谱图;
3)数据分析:通过不同供试品的紫外谱图和ELSD谱图,进行不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶药材的差异性分析,计算相似度;
或,通过不同供试品的紫外谱图和ELSD谱图,进行不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶提取物的差异性分析,计算相似度;
或,通过不同供试品的紫外谱图和ELSD谱图,进行不同厂家和/或相同厂家不同批次银杏叶注射剂制剂的差异性分析,计算相似度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述高效液相色谱条件为:色谱柱为Waters-ACCHROM Tnature C18(250mm×4.6mm,5μm);柱温为20-40℃;流速为0.8~1.2ml/min;流动相A为甲醇,流动相B为0.1-1%甲酸溶液;进行梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的银杏叶指纹图谱方法,其特征在于,所述梯度洗条件为:0~10min,10%A;10~35min,线性10%~20%A;35~53min,线性40%~52%A;53~65min,线性52%~100%A;65~85min,100%A。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,检测器为紫外检测器与ELSD检测器串联。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,紫外检测波长为360nm。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,ELSD条件为漂移管温度75~105℃,气体压力为25~40psi,增益值100。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述指纹图谱中有16个共有峰。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,采用国家药典委员会“中药色谱指纹相似度评价系统”进行差异性分析,相似度计算。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,ELSD谱图中包含有内酯类化合物和黄酮类化合物的含量信息。
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