CN115112783A - 银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用 - Google Patents

银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115112783A
CN115112783A CN202210193621.0A CN202210193621A CN115112783A CN 115112783 A CN115112783 A CN 115112783A CN 202210193621 A CN202210193621 A CN 202210193621A CN 115112783 A CN115112783 A CN 115112783A
Authority
CN
China
Prior art keywords
volume
vol
methanol
ginkgo
bilobalide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210193621.0A
Other languages
English (en)
Inventor
肖伟
王跃飞
高霞
陈夏霖
李雨蔓
王佳佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN202210193621.0A priority Critical patent/CN115112783A/zh
Publication of CN115112783A publication Critical patent/CN115112783A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8624—Detection of slopes or peaks; baseline correction
    • G01N30/8631—Peaks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components

Abstract

本申请提供一种银杏叶的指纹图谱检测方法，包括如下步骤:取银杏叶对照品和供试品进行检测，该检测的色谱条件包括:色谱柱为ZORBAX SB‑C18(4.6×250mm，5μm)；流动相为0.1体积％甲酸水(A)‑甲醇(B)；梯度洗脱程序为：0‑10min:90体积％‑80体积％A；10‑25min:80体积％‑70体积％A；25–35min:70体积％A；35–45min:70体积％‑58体积％A；45‑70min:58体积％‑45体积％A；70‑85min:45体积％‑30体积％A；85‑95min:30体积％‑5体积％A；95‑115min:5体积％A。流速0.9‑1.1mL/min；检测波长360nm，柱温25‑35℃，进样量10μL；蒸发光散射检测器参数:漂移管温度为110℃，载气流速3.0mL/min，增益值4。经方法学考察，确认本申请的检测方法简便、快速、准确，可在短时间内完成银杏叶中多种指标成分的指纹图谱测定，为银杏叶制品质量的有效控制提供了可靠的分析方法。

Description

银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用
技术领域
本申请涉及分析化学检测技术领域，具体涉及一种采用高效液相色谱(HPLC)—蒸发光散射检测法(ELSD)和中药指纹图谱相似度计算软件相结合建立银杏叶化学成分的检测方法和指纹图谱的构建。
背景技术
银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶。性甘、苦、涩、平，归心、肺经，具有活血化瘀、通经活络、敛肺平喘、化浊降脂等作用。银杏叶作为中药材，已广泛地运用到各类中药制剂中，主要用于冠状动脉性心脏病、心绞痛、高血脂等疾病的治疗。
银杏叶中所含的内酯类化合物(Terpene lactones)和黄酮类(Flavonoids)化合物是银杏叶的主要药用活性成分；银杏叶中引起临床不良反应的主要物质是银杏酸(Ginkglic acids)，其具有致敏性、神经损伤和致突变毒性，致敏机理可能是抑制酶活性、细胞毒性和变态反应等。如果不能准确得知并控制银杏酸的含量，会使得银杏叶的利用受到限制，降低其药用价值。
银杏叶的产地众多，成分复杂，如何有效反映其整体信息并进行质量评价是亟需解决的一个难题。随着现代分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际上公认的控制中药质量的质控模式，能从原药材的栽培、引种及中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量标准的制定提供全方位的质量保证。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量控制手段，其基本属性是整体性和模糊性，这与中医理论的整体性原则和中药作用机理的模糊性是相符合的。中药指纹图谱技术的兴起为银杏叶制品质量的有效控制提供了可靠的分析方法。其具有高分离度、整体性和专属性等优点，可应用于不同产地、等级和不同生长年限的银杏叶药材整体质量的评价。
目前，利用指纹图谱评价银杏叶的质量仅针对银杏内酯类或黄酮类化合物，业内普遍不关注银杏叶中银杏酸的含量，这样就无法解决银杏酸的毒副作用可能造成的致敏反应、神经损伤和基因突变；从而，银杏叶制品的质量也就无法保证。且银杏叶中黄酮类化合物与内酯类化合物的理化性质差异很大，需分别采用不同的方法对这两类物质进行检测，其中银杏内酯的检测方法尤为复杂、耗时、费力。银杏叶内酯类、黄酮类成分的含量以及银杏酸的限量均为评价银杏叶制剂质量的关键指标，但至今还不能将银杏酸、银杏内酯和银杏黄酮同时反映在一个指纹图谱中，整体检测过程复杂、步骤多、时间长且难度大。
虽然已建立有银杏叶提取物中银杏萜类内酯的指纹图谱，但是银杏酸的指纹图谱仅局限于银杏总酸。对于银杏叶提取物及制剂中的银杏内酯类成分，因其紫外吸收较差，在检测时易受干扰，故多采用高效液相色谱与蒸发光散射检测器(ELSD)联用法检测。银杏黄酮也是银杏提取物质量的主要评价指标,黄酮类化合物的种类众多,其成分不能完全明确,同时难以获得对照品,使得直接测定其含量比较困难。当前对于银杏黄酮类成分，主要采用高效液相色谱与二极管阵列检测器(DAD)联用法检测，以槲皮素3-O-葡萄糖苷为内标物，建立内标物与其他12个黄酮醇苷组成混合标准品，以此建立银杏黄酮类的指纹图谱检测方法。本申请正是基于目前缺乏将银杏内酯类、银杏黄酮类和银杏酸类物质同时反映的指纹图谱检测方法，采用HPLC-ELSD联用的方式，即解决了紫外光对于紫外吸收弱的银杏内酯类检测效果不好的问题，又能实现同时、简便、快捷检测的目的，此方法的重复性和精确度高，可全面地同时反映银杏叶药材化学组成的整体特征，适用于银杏叶药材的真伪和品质鉴别，为提高银杏叶及其制剂质量控制水平，准确、全面地评价其内在品质提供了有力的技术依据。
发明内容
有鉴于上述背景技术，本申请针对存在的不能简便、快速、灵敏的全面评价银杏叶制品质量的问题，提供一种通过HPLC-ELSD联用法和中药指纹图谱相似度计算软件相结合的方式，建立一种简单、可靠、稳定的银杏叶指纹图谱测定方法，用于同时表征银杏叶中内酯类成分、黄酮类成分和银杏酸类成分，并进一步应用该方法对银杏叶中各化学成分进行分析，以获得可靠的银杏叶及其制品质量评价的新方法，为银杏叶药材内在质量的综合评价和全面控制提供更好的方法。
为了实现上述目的，本申请提供以下技术方案:
银杏叶的指纹图谱检测，包括如下步骤：取银杏叶供试品和对照品进行检测，色谱条件如下：
色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相A为0.1体积％甲酸水，流动相B为甲醇；
梯度洗脱程序：0-10min:90体积％-80体积％A；10-25min:80体积％-70体积％A；25–35min:70体积％A；35–45min:70体积％-58A；45-70min:58体积％-45体积％A；70-85min:45体积％-30体积％A；85-95min:30体积％-5体积％A；95-115min:5体积％A；
采用蒸发光散射器(ELSD)进行检测，具体参数为:漂移管温度为110-115℃，载气流速3.0mL/min，增益值4。
进一步地，色谱条件还包括:柱温25～35℃，流速0.9～1.1mL/min，检测波长为360nm。
其中，对照品选自银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1和芦丁中的一种或多种。
本申请还进一步提供对照品和供试品溶液的制备
供试品溶液的制备方法如下：银杏叶与50体积％-90体积％甲醇按1g:100ml～1g:10ml的料液比混合后称重，超声提取55～65min，离心后取上清液，经滤膜过滤，即得。
可选为，银杏叶与所述90体积％甲醇按0.5g:5mL的比例混合，称定重量，超声提取60min，取出放至室温，再用90体积％甲醇补足减失的重量，离心后取上清液，过0.45μm滤膜，即得。
对照品溶液的制备方法如下:
取各对照品适量，加无水甲醇制成含各成分浓度为100μg/mL的混合对照品溶液。
本申请进一步提供了银杏叶指纹图谱的构建方法，具体如下：
先制备供试品溶液：称取干燥银杏叶粉末，置于离心管中，加入90体积％甲醇，称定重量，超声处理，取出放至室温，再用90体积％甲醇补足减失的重量，离心后取上清液，经滤膜过滤，得到供试品溶液；
再制备对照品溶液：分别称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1和芦丁对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/mL的对照品储备液；
分离采用以下色谱条件:
色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：0.1体积％甲酸水(A)：甲醇(B)，梯度洗脱程序：0-10min:90体积％-80体积％A；10-25min:80体积％-70体积％A；25–35min:70体积％A；35–45min:70体积％-58A；45-70min:58体积％-45体积％A；70-85min:45体积％-30体积％A；85-95min:30体积％-5体积％A；95-115min:5体积％A；柱温为25-35℃，流速0.9～1.1mL/min，进样量：10μL，检测波长360nm。
蒸发光散射检测器的检测参数为:
漂移管温度：110-115℃；载气流速：3.0L/min，增益值4；
根据高效液相色谱-串联ELSD检测结果，获得银杏叶指纹图谱。
构建方法还包括方法学考察：
精密度考察：取同一供试品溶液，进行HPLC-ELSD分析，连续重复进样6次，记录各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算其RSD(相对标准偏差)值，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行评价；
稳定性考察：按前述方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、16h、24h进行测定，记录指纹图谱及各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算其RSD值；
重复性考察：按供试品溶液制备方法平行处理同一批次银杏叶样品6份，按前述方法进样测定，记录指纹图谱及各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算其RSD值，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)进行评价。
本申请还进一步提供一种银杏叶中化学成分的分析方法，采用HPLC-串联ELSD对银杏叶进行分析；
供试品溶液的制备：称取干燥银杏叶粉末，置于离心管中，加入90体积％甲醇，称定重量，超声处理，取出放至室温，再用90体积％甲醇补足减失的重量，离心后取上清液，经滤膜过滤，得到供试品溶液；
对照品溶液的制备：分别称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1和芦丁对照品，置于容量瓶中，加无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/mL的对照品储备液；
测定：对照品溶液与供试品溶液的进样量各10μl，进样分析，并记录115分钟以内的色谱图；
其中，色谱条件和蒸发光散射参数分别如下：
色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相A为0.1体积％甲酸水，流动相B为甲醇；
洗脱程序为0-10min:90体积％-80体积％A；10-25min:80体积％-70体积％A；25–35min:70体积％A；35–45min:70体积％-58体积％A；45-70min:58体积％-45体积％A；70-85min:45体积％-30体积％A；85-95min:30体积％-5体积％A；95-115min:5体积％A；
柱温25～35℃，流速0.9～1.1mL/min，检测波长360nm；
ELSD检测参数:漂移管温度为110-115℃，载气流速3.0mL/min，增益值4；
根据检测结果分析银杏叶供试品中的化学成分。
如上，本申请通过HPLC-ELSD联用建立了银杏叶的检测方法和构建其指纹图谱，选定其中10种具有代表性的银杏内酯类、银杏酸类、黄酮类化学成分的色谱峰为共有峰将其有效分离，实现了在相同条件下，将银杏叶中的银杏内酯类、银杏酸类、黄酮类化学成分同时反映在一张色谱图上，解决了目前检测方法繁琐、效率低、费时的问题。此方法可全面地反映银杏叶药材化学组成的整体特征，能简单、快速的分析银杏叶成分，可应用于银杏叶药材的真伪和品质鉴别，为提高银杏叶及其制剂质量控制水平，准确、全面地评价其内在品质提供了有力的技术依据。
附图说明
图1为不同提取溶剂考察的谱图。
图2为不同提取料液比考察的谱图。
图3为不同提取时间考察的谱图。
图4为不同提取时间下10个特征峰峰面积总和。
图5为供试品溶液在不同检测器下的色谱图(1.白果内酯，2.银杏内酯C，3.银杏内酯A，4.银杏内酯B，5.芦丁，6.3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚，7.银杏双黄酮，8.金松双黄酮，9.银杏酸C15:1，10.银杏酸C17:1)。
图6为供试品溶液在不同漂移管温度下的色谱图。
图7为精密度试验结果(1.白果内酯，2.银杏内酯C，3.银杏内酯A，4.银杏内酯B，5.芦丁，6.3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚，7.银杏双黄酮，8.金松双黄酮，9.银杏酸C15:1，10.银杏酸C17:1)。
图8为稳定性试验结果(1.白果内酯，2.银杏内酯C，3.银杏内酯A，4.银杏内酯B，5.芦丁，6.3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚，7.银杏双黄酮，8.金松双黄酮，9.银杏酸C15:1，10.银杏酸C17:1)。
图9为重复性试验结果(1.白果内酯，2.银杏内酯C，3.银杏内酯A，4.银杏内酯B，5.芦丁，6.3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚，7.银杏双黄酮，8.金松双黄酮，9.银杏酸C15:1，10.银杏酸C17:1)。
图10为银杏叶的对照品指纹图谱(1.白果内酯，2.银杏内酯C，3.银杏内酯A，4.银杏内酯B，5.芦丁，6.3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚，7.银杏双黄酮，8.金松双黄酮，9.银杏酸C15:1，10.银杏酸C17:1)。
图11为35批银杏叶样品指纹图谱。
具体实施方式
除特别指出，本申请提供的技术方案中所用药品、试剂、仪器均可由常规渠道或市场购得。本申请公开了一种银杏叶指纹图谱测定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本申请之中。
以下结合具体实施例对本申请做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本申请的基本原理、主要特征和优点，而本申请不受以下实施例的范围限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
高效液相色谱(HPLC)应用于分析高沸点、不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物。仪器由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分构成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以软件进行分析。HPLC具有分辨率高、灵敏度高、速度快、色谱柱可重复使用、出水成分易收集等优点。
由于银杏内酯的低紫外吸收特性，易受黄酮类物质干扰，使用紫外检测器检测效果不好或者必须先衍生再检测，而蒸发光检测器ELSD不依赖于样品的光学性质，只要挥发性小于流动相的物质，都可以在ELSD上产生响应。其次，ELSD可以很好的支持梯度洗脱，ELSD可以消除流动相配比变化对基线产生的影响。因此，本申请采用HPLC-ELSD联用对银杏叶进行检测。本申请具体由以下几部分实验组成
1.对照品溶液制备
2.供试品溶液制备，包括：提取溶剂、料液比和提取时间的优化选择3.检测条件的优化，包括：色谱条件的选择和蒸发光散射器温度的优化4.方法学验证，包括：精密度测试、稳定性测试、重复性测试
5.指纹图谱检测方法的构建和具体应用
6.其它说明
以下为各部分实验的具体内容
1.对照品溶液的制备
(1)对照品的选择：根据银杏叶中已知的成分，分别选择银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1、芦丁中的一种或多种，分别代表内酯类、黄酮类和酚酸类物质。
(2)对照品溶液配制：使用十万分之一精度电子天平(Mettler XS205，梅特勒-托利多上海有限公司)分别称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1和芦丁对照品2mg，置于20mL量瓶中，加无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/mL的对照品储备液，置于4℃冰箱内保存备用。
其中，银杏内酯A(批号:110862-201612)、银杏内酯B(批号:110863-201611)、银杏内酯C(110864-201508)、白果内酯(110865-201507)、银杏酸C15:1(111762-200601)和芦丁(100080-201610)产自中国药品生物制品检定研究院；银杏酸C17:1(Y23M9H62018)(Y04J9H64929)产自上海源叶生物科技有限公司；3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮产自上海源叶生物科技有限公司。
2.供试品溶液制备
供试银杏叶采样时间为2018年4月至9月，地点江苏邳州，经江苏康缘药业股份有限公司执业药师吴舟鉴定均为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶。
提取溶剂浓度和料液比的优化方法：精密称取干燥的银杏叶中粉，以不同浓度的甲醇作为提取溶剂，固定料液比，超声处理60min，评价高效液相色谱峰响应值和特征峰峰面积，比较结果得到适合的甲醇浓度。
再以相同浓度甲醇作为提取溶剂和不同料液比超声提取处理60min，评价高效液相色谱峰响应值和特征峰峰面积，比较结果得到适合的料液比。
超声提取时间的优化：在确定甲醇浓度和料液比后，设置不同超声时间，评价高效液相色谱峰响应值和特征峰峰面积，比较结果得到适合的超声时间。
根据以上提取方法，考察了90体积％甲醇、75体积％甲醇、60体积％甲醇、50体积％甲醇溶剂的提取效率，其中90体积％甲醇的提取效果最好见图1)。
然后，再以90体积％甲醇作为提取溶剂考察料液比(g:mL)1:10、1:20、1:50、1:100时的提取效果，结果发现料液比为1:10时的提取效果最好(见图2)。
进一步以90体积％甲醇作为提取溶剂，料液比(g:mL)1:10，考察提取时间30min、45min、60min、75min时的提取效果，结果发现提取60min时可将成分提取完全(见图3和图4)。故确定以90体积％甲醇作为提取溶剂，料液比(g:mL)1:10，超声提取60min来制备供试品溶液。
根据以上提取条件优化结果，将上述银杏叶样品在DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏仪器设备有限公司)中，以60℃热风干燥至恒重，再粉碎，获得干燥的银杏叶中粉。使用万分之一精度电子分析天平(ME 204E，梅特勒-托利多上海仪器有限公司)精密称取干燥的银杏叶中粉0.5g，置于50mL离心管中，加入90体积％甲醇5mL(用Pacific TⅡ7超纯水仪生产的超纯水稀释无水甲醇制得(美国赛默飞公司)，称定重量后，用超声波清洗器(KH-300DB，昆山禾创超声仪器有限公司)超声处理60min(功率300W，温度25℃)，使各成分充分溶解，取出放冷至室温，再用90体积％甲醇补足减失的重量，用Eppendorf Centrifuge5424R离心机(德国艾本德)离心去除沉淀收取上清液，经0.45μm滤膜过滤，收取滤液，即得。
3.色谱条件的优化
银杏萜类内酯成分最大吸收波长为220nm，紫外吸收能力弱，在UV检测器下灵敏度低，因此本研究采用ELSD对萜类内酯成分进行检测(见图5)。实验中使用的色谱柱为ZORBAXSB-C18，规格为：4.6×250mm，5μm，流动相为0.1体积％甲酸水(A)-甲醇(B)梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1指纹图谱检测方法的梯度洗脱程序
Figure BDA0003525963830000121
Figure BDA0003525963830000131
流速是1.0mL min-1；检测波长360nm，柱温是30℃。
4.ELSD漂移管温度的优化
ELSD漂移管温度选择:
(1)本申请使用的ELSD检测器可以采用分流进样与不分流进样两种方式，不同的分流方式可采用不同的漂移管温度以适应溶剂沸点的温度。
(2)温度降低时挥发性成分的颗粒越大，ELSD响应值就越高，但温度过低时，由于部分流动相没有蒸发，会导致检测噪音增大，使信噪比减低。
(3)利用工作站进行模拟，考察110℃，不分流进样，与漂移管温度为65℃分流进样时的采集效果，结果表明ELSD检测器采用不分流模式，漂移管温度110℃时，银杏内酯类成分的信噪比最大，故选用漂移管温度110℃，不分流进样(见图6)。
根据以上检测条件优化结果，进行以下检测：
每份样品平行制备两份并进样分析两次，取供试品和对照品溶液各10ul通过自动进样器进样；检测漂移管温度110℃，载气流速3.0mL/min，增益值4时，进行检测，产生响应信号，记录115分钟以内的色谱图，计算1～10号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，并通过中药指纹图谱相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度。
按照上述方法进行供试品溶液检测，通过与对照品的色谱峰特征比对，获得供试品的成分信息。
5.方法学验证
(1)精密度测试
取同一供试品溶液，进行HPLC-ELSD分析，连续重复进样6次，以3号峰银杏内酯A为参照峰，计算1～10号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值(见图7)，计算其RSD(相对标准偏差)值，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行评价，结果表明各共有峰相对保留时间的RSD均<0.2％，相对峰面积的RSD<5.0％，色谱图相似度>0.99(见表3-1、3-2和3-3)，说明仪器精密度良好。
表3-1精密度试验结果
Figure BDA0003525963830000141
表3-1精密度-相对保留时间
Figure BDA0003525963830000142
表3-2精密度-相对峰面积
Figure BDA0003525963830000143
Figure BDA0003525963830000151
(2)重复性测试
按供试品溶液制备方法平行处理同一批次银杏叶样品6份，按前述方法进样测定，以3号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积(见图8)，计算其RSD值，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)进行评价，结果表明各共有峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积的RSD<5.0％，色谱图相似度>0.99(见表4-1、4-2和4-3)，表明方法重复性良好。
表4-1重复性试验结果
Figure BDA0003525963830000152
表4-2重复性-相对保留时间
Figure BDA0003525963830000153
表4-3重复性-相对峰面积
Figure BDA0003525963830000154
Figure BDA0003525963830000161
(3)稳定性测试
取同一供试品溶液进行HPLC-ELSD分析，分别在0、2、4、8、12、16、24h测定，记录指纹图谱，以3号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积(见图9)，计算其RSD值。结果表明各共有峰的相对保留时间RSD<0.4％，相对峰面积的RSD<4.5％，色谱图相似度>0.99(见表5-1、5-2和5-3)，说明供试品溶液在24h内稳定。
表5-1稳定性-相似度评价结果
Figure BDA0003525963830000162
表5-2稳定性-相对保留时间
Figure BDA0003525963830000163
表5-3稳定性-相对峰面积
Figure BDA0003525963830000171
6.银杏叶指纹图谱的构建
将采收于邳州，采集期7、8月份，树龄为二年至四年生的银杏叶作为样品，将样品按照以上检测方法进行检测，获得的银杏叶指纹图谱(见图10)。
7.指纹图谱检测方法的应用
将以上方法得到的银杏叶指纹图谱作为对照指纹图谱，检测35批银杏叶样品的相似度，结果显示供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均不低于0.9(见图11)。
结果表明，35批不同来源的银杏叶药材指纹图谱中指纹峰的相对保留时间基本一致，各样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.9，说明样品间所含化学成分的组成基本相同。
8.其它说明
本申请建立银杏叶指纹图谱，可以整体反应银杏叶中主要的三类化学成分信息，充分展现银杏叶药材的化学组成信息，借助相似度评价软件，对银杏叶药材进行整体层面的质量评价，有利于多成分、多靶点的药用植物的质量控制。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种银杏叶的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤:取对照品和供试品溶液进行检测，检测的色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX SB-C18，规格为：4.6×250mm，5μm；流动相A为0.1重量体积％甲酸水，流动相B为甲醇；
梯度洗脱程序：0-10min:90体积％–80体积％A；10-25min:80体积％-70体积％A；25–35min:70体积％A；35–45min:70体积％-58体积％A；45-70min:58体积％-45体积％A；70-85min:45体积％-30体积％A；85-95min:30体积％-5体积％A；95-115min:5体积％A；
根据检测结果，获得所述银杏叶的成分信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，柱温为25～35℃，流速为0.9～1.1mL/min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
对照品选自银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1和芦丁中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：
所述银杏叶与50体积％-90体积％甲醇按1g:100mL～1g:10mL的料液比混合后称重，超声提取30-75min，离心后取上清液，经滤膜过滤，即得。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，
所述银杏叶与90体积％甲醇按0.5g:5mL的比例混合，称定重量，超声提取60min，取出放至室温，再用90体积％甲醇补足减失的重量，离心后取上清液，过0.45μm滤膜，即得。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，对照品溶液的制备方法包括：
取所述各对照品，加甲醇制成含各成分浓度为80-120μg/mL的混合对照品溶液。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测器为蒸发光散射检测器ELSD,检测参数为:漂移管温度为110-115℃；载气流速：3mL/min，增益值4。
8.一种银杏叶指纹图谱的构建方法，其特征在于，采用高效液相色谱-串联ELSD对银杏叶进行检测；其中，
供试品溶液的制备：称取银杏叶粉末，置于离心管中，加入90体积％甲醇，称定重量，超声处理，取出放至室温，再用90体积％甲醇补足减失的重量，离心后取上清液，经滤膜过滤，得到供试品溶液；
对照品溶液的制备：分别称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1和芦丁对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制对照品储备液；
高效液相色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX SB-C18，规格为：4.6×250mm，5μm；流动相:0.1体积％甲酸水(A)：甲醇(B)，梯度洗脱程序：0-10min:90体积％–80体积％A；10-25min:80体积％-70体积％A；25–35min:70体积％A；35–45min:70体积％-58体积％A；45-70min:58体积％-45体积％A；70-85min:45体积％-30体积％A；85-95min:30体积％-5体积％A；95-115min:5体积％A；
蒸发光散射检测器的检测参数:漂移管温度:110-115℃；载气流速:3mL/min，增益值4；
根据高效液相色谱-串联ELSD检测结果，获得银杏叶指纹图谱。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述色谱条件还包括:柱温25～35℃，流速0.9～1.1mL/min。
10.一种银杏叶制品化学成分的分析方法，其特征在于，用HPLC-串联ELSD对银杏叶进行分析；
供试品溶液的制备:称取银杏叶粉末，置于离心管中，加入90体积％甲醇，称定重量，超声处理，取出放至室温，再用90体积％甲醇补足减失的重量，离心后取上清液，经滤膜过滤，得到供试品溶液；
对照品溶液的制备:分别称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、3-O-{2-O-[6-O-(p羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}山奈酚、银杏双黄酮、金松双黄酮、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1和芦丁对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制的对照品储备液；
测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定并记录115分钟以内的色谱图；
其中，测定的色谱条件为：
色谱柱:ZORBAX SB-C18，规格为:4.6×250mm，5μm；流动相A为0.1体积％甲酸水，流动相B为甲醇；
梯度洗脱程序：0-10min:90体积％-80体积％A；10-25min:80体积％-70体积％A；25-35min:70体积％A；35-45min:70体积％-58A；45-70min:58体积％-45体积％A；70-85min:45体积％-30体积％A；85-95min:30体积％-5体积％A；95-115min:5体积％A；
ELSD质谱条件为：漂移管温度为110℃，载气流速3.0mL/min，增益值4；根据检测结果分析银杏叶供试品的化学成分。
CN202210193621.0A 2022-03-01 2022-03-01 银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用 Pending CN115112783A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210193621.0A CN115112783A (zh) 2022-03-01 2022-03-01 银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210193621.0A CN115112783A (zh) 2022-03-01 2022-03-01 银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115112783A true CN115112783A (zh) 2022-09-27

Family

ID=83324653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210193621.0A Pending CN115112783A (zh) 2022-03-01 2022-03-01 银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115112783A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102727538A (zh) * 2012-05-17 2012-10-17 江苏颐海药业有限责任公司 从银杏叶中提取银杏黄酮、银杏内酯和银杏酚酸的工艺
CN104034826A (zh) * 2014-07-08 2014-09-10 上海信谊百路达药业有限公司 一种银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法
AU2014100873A4 (en) * 2014-02-24 2014-09-18 Macau University Of Science And Technology Quantitative Analysis of the Flavonoid Glycosides and Terpene Trilactones in the Extract of Ginkgo biloba and Evaluation of their Inhibitory Activity towards ß-Amyloid Peptide Aggregation
CN105891355A (zh) * 2016-03-31 2016-08-24 河北神威药业有限公司 一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中黄酮类化合物和萜内酯类化合物含量的检测方法
CN108020611A (zh) * 2017-12-01 2018-05-11 万邦德制药集团股份有限公司 一种检测银杏叶制剂中多种双黄酮含量的方法
CN108785336A (zh) * 2018-08-20 2018-11-13 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 一种银杏酮酯及其制备方法
CN112213410A (zh) * 2020-06-12 2021-01-12 江苏康缘药业股份有限公司 一种银杏叶的检测方法
CN112858550A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种不同厂家/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法
CN112903887A (zh) * 2020-12-28 2021-06-04 中国药科大学 银杏叶滴丸hplc-vwd-elsd特征图谱的建立方法及其特征图谱

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102727538A (zh) * 2012-05-17 2012-10-17 江苏颐海药业有限责任公司 从银杏叶中提取银杏黄酮、银杏内酯和银杏酚酸的工艺
AU2014100873A4 (en) * 2014-02-24 2014-09-18 Macau University Of Science And Technology Quantitative Analysis of the Flavonoid Glycosides and Terpene Trilactones in the Extract of Ginkgo biloba and Evaluation of their Inhibitory Activity towards ß-Amyloid Peptide Aggregation
CN104034826A (zh) * 2014-07-08 2014-09-10 上海信谊百路达药业有限公司 一种银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法
CN105891355A (zh) * 2016-03-31 2016-08-24 河北神威药业有限公司 一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中黄酮类化合物和萜内酯类化合物含量的检测方法
CN108020611A (zh) * 2017-12-01 2018-05-11 万邦德制药集团股份有限公司 一种检测银杏叶制剂中多种双黄酮含量的方法
CN108785336A (zh) * 2018-08-20 2018-11-13 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 一种银杏酮酯及其制备方法
CN112858550A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种不同厂家/或相同厂家不同批次银杏叶药物相似度的分析方法
CN112213410A (zh) * 2020-06-12 2021-01-12 江苏康缘药业股份有限公司 一种银杏叶的检测方法
CN112903887A (zh) * 2020-12-28 2021-06-04 中国药科大学 银杏叶滴丸hplc-vwd-elsd特征图谱的建立方法及其特征图谱

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TERIS A. VAN BEEK: "Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 21 - 55 *
陈凡: "银杏叶提取物的 HPLC － DAD － ELSD 指纹图谱研究", 药物分析杂志, vol. 31, no. 3, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 534 - 538 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110031570B (zh) 抗感冒颗粒的指纹图谱检测方法
CN107589191B (zh) 金贝口服液hplc指纹图谱建立和检测方法
CN110836944A (zh) 一种小儿解表颗粒hplc指纹图谱建立方法
CN104391072A (zh) 一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂的质量控制方法
CN113960203B (zh) 检测天龙配方颗粒特征图谱的方法
CN115902052A (zh) 一种俄色果及其制剂的hplc特征图谱检测方法
CN113777183A (zh) 女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法、多指标成分含量检测方法
CN110031564B (zh) 基于hplc指纹图谱的天然植物抗球虫饲料添加剂的质量检测方法
CN115112783A (zh) 银杏叶检测方法及多成分同时反映指纹图谱的构建及应用
CN113030316B (zh) 一种治疗腰骶痛中成药hplc特征图谱的构建方法
CN113671055B (zh) 一种检测中药材银杏叶中咖啡因含量的方法
CN105067725B (zh) 一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法
CN110274980B (zh) 一种林下山参与园参新的区分鉴别方法
CN113391005A (zh) 地榆与地榆炭饮片、对照提取物、配方颗粒的高效液相检测方法及其鉴别方法
CN111896637A (zh) 一种金青中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法
CN111505156A (zh) 一种用于小蓟配方颗粒的指纹谱图质量测定方法
CN111398454B (zh) 一种抗肺癌海牡方指纹图谱的检测方法
CN111830150B (zh) 一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法及其应用
CN112782331B (zh) 一种藕节与藕节炭的特征图谱构建方法及鉴别方法
CN115993405B (zh) 斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法
CN113759012B (zh) 一种瞿麦配方颗粒的质量控制方法
CN113960213A (zh) 基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法
CN114878704A (zh) 蔓荆子的指纹图谱构建方法以及多指标含量检测方法
CN114689743A (zh) 一种木姜叶柯质量控制检测方法
CN115184493A (zh) 一种南方红豆杉药材及其中药饮片中活性成分的指纹图谱检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination