CN114689743A - 一种木姜叶柯质量控制检测方法 - Google Patents

一种木姜叶柯质量控制检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种木姜叶柯质量控制检测方法，属于中药质量检测技术领域。该方法包括以下技术步骤：(1)混合对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)检测；(4)对照指纹图谱的建立；(5)相似度的分析；(6)鉴别；(7)待测成分峰位的确定；(8)相对校正因子的计算；(9)待测成分含量的测定。本发明方法通过超高效液相色谱技术，可以得到木姜叶柯的超高效液相色谱图，经过对共有峰的数量、相对保留时间、相似度的分析，可以判断木姜叶柯产品与否以及产品整体质量的稳定情况；再结合一测多评法，可以全面、高效地对产品中多成分的含量进行测定，有利于对产品的全面质量控制，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠。

Description

一种木姜叶柯质量控制检测方法
技术领域
本发明属于中药质量检测技术领域，具体涉及一种木姜叶柯质量控制检测方法。
背景技术
木姜叶柯(学名：Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun)为壳斗科石柯属常绿乔木的干燥嫩叶，别名甜茶、甜叶子树、胖稠、甜味菜、大叶稠子、甘茶、多穗石柯、美丽加嫂等。木姜叶柯以野生状态分布于我国长江以南各省区海拔500～2500m的低山密林中，印度、泰国也有分布。多穗柯甜茶为木姜叶柯的叶经加工而成的代茶饮料和保健食品，民间常采集其嫩叶食用，其茶甘甜清爽，香气浓郁，色泽鲜艳，回味持久，风味独特，据称有生津止渴，消除疲劳之功效。木姜叶柯是广西壮族自治区百色、隆林、平果、马山、龙州、巴马等地区壮族民间常用草药，民间多用嫩叶作为茶叶饮用，主要用于解暑、肺热咳嗽等。本品历代本草未见记载，现散见于我国一些中草药专著和南方地区中草药手册或植物学专著中，如《中国植物志》、《中国高等植物图鉴》、《贵州植物志》、《云南植物志》、《广西药用植物名录》、《全国中草药汇编》等。木姜叶柯含黄酮类、多酚类、多糖类等成分，有降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗癌等功能，兼具茶、糖、药三种功能。
现有对木姜叶柯的质量检测方法有显微鉴别、对照药材薄层色谱鉴别，个别成分的含量测定如根皮苷、三叶苷和根皮素等，以及水分、总灰分、浸出物等检查限度。但是以上的质量检测方法不足以反映木姜叶柯的整体质量信息。
还有对木姜叶柯中根皮苷、三叶苷、根皮素、3'-O-乙酰基根皮苷和2'-O-乙酰基根皮苷的五个成分或者其中某几个成分的含量进行测定，或者对其中的总多酚或者总黄酮进行含量测定，但是3'-O-乙酰基根皮苷、2'-O-乙酰基根皮苷并不完全存在于所有样品中，且需要同时测定三个或者多个成分工作量较大，且含量测定方法不能全面展示样品的整体信息。
虽已有文献(贺莲,徐兰芳等.江西产多穗柯叶的HPLC指纹图谱研究[J].广东药科大学学报,2017,33(04):483-487.)公开了对多穗柯叶的HPLC指纹图谱分析，但是该方法分析时间较长，达到了142min，工作量大，消耗时间长，且试剂消耗量大，导致检测成本高。
由于植物化学成分的复杂性，多指标含量测定已经成为植物来源药物质量控制的共识。以传统测定方法同时测定中药材中几种成分，不但面临对照品难得，检验周期长，耗能、耗时，还不能全面展示样品的整体信息。一测多评法是指利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，只测定其中的一个成分(对照品易于得到)来实现多个成分(对照品难以得到或供应)的同步测定，是适合中药材特点的多指标质量评价模式。在对照品不足的情况下，利用相对校正因子对药材进行质量控制是方便、快速、廉价的，其方法将会是中药材多组分同步定量的发展方向。
目前，用一测多评法评价中药材质量的相关文献较少，而用一测多评法同时测定木姜叶柯中多种不同类型成分的含量的未见报道。
为此，本发明在现有技术的基础上建立了木姜叶柯质量控制检测方法，使得对该产品更加有效的质量分析，更全面反映产品的质量状况，从而更加有效地控制产品的质量。
发明内容
针对以上问题，本发明提供一种更全面、更高效的木姜叶柯质量控制检测方法，通过一次测量分析，可以实现多个成分的含量评价，简单高效，准确性好。
本发明通过以下技术方案实现：
一种木姜叶柯质量控制检测方法，包括以下步骤：
(1)混合对照品溶液的制备：精密称取三种对照品根皮苷、三叶苷和根皮素适量，加甲醇配制成混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称取木姜叶柯粉末适量，于溶剂中浸泡，超声提取，离心，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(3)检测：采用超高效液相色谱分别对步骤(1)中的混合对照品溶液和步骤(2)中的供试品溶液进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
(4)对照指纹图谱的建立：将现行标准评价合格的样品的供试品图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》合成对照指纹图谱，以根皮苷、三叶苷和根皮素参照物溶液标定图谱中特征峰5、特征峰6、特征峰10；
(5)相似度的分析：将待评价样品的供试品指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，与对照指纹图谱进行相似度分析，待评价样品的供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不低于0.9；
(6)鉴别：将待评价样品的供试品指纹图谱与对照指纹图谱进行比对，待评价样品的供试品图谱在与对照指纹图谱特征峰5、特征峰6、特征峰10相应位置有保留峰，即可判定为木姜叶柯；
(7)待测成分峰位的确定：以混合对照品中三叶苷的色谱峰作为对照，计算混合对照品中根皮苷和根皮素相对三叶苷的相对保留时间，采用相对保留时间确定根皮苷和根皮素的峰位；
(8)相对校正因子的计算：确定混合对照品中根皮苷和根皮素的峰位后，以混合对照品中三叶苷的色谱峰作为对照，根据混合对照品中根皮苷和根皮素的色谱峰峰面积分别计算根皮苷和根皮素的相对校正因子；
(9)待测成分含量的测定：根据相对校正因子计算待评价样品的供试品中根皮苷和根皮素的质量含量。
进一步地，步骤(3)中，所述色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温为38～42℃，检测波长为240～300nm，流动相流速为0.29～0.31mL/min；
所述色谱柱为Waters ACQUITY
Figure BDA0003554038780000032
BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱、Dinoex RSLC C18(3.0×50mm，2.2μm)色谱柱或Thermo Syncronis C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱。
进一步地，步骤(3)中，所述色谱条件为：使用Thermo Syncronis C18，2.1×100mm，1.7μm型号色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温为40℃，检测波长为280nm，流动相流速为0.3mL/min。
进一步地，所述梯度洗脱过程如下：0～0.5min，25％A；0.5～10min，25％～35％A；10～12min，35％A；12～14min，35％～60％A。
进一步地，步骤(2)中，所述提取溶剂为纯化水、乙醇或甲醇；提取时间为20～60min；超声条件为150～350W，50～100kHz。
进一步地，步骤(2)中，所述提取溶剂为甲醇；提取时间为40min；超声条件为250W，100kHz。
进一步地，步骤(2)中，所述微孔滤膜的孔径为0.22～0.45μm。
进一步地，步骤(3)中，所述待评价样品的供试品指纹图谱中至少包括根皮苷、三叶苷和根皮素在内的10个特征色谱峰其保留时间与三叶苷色谱峰(S峰)保留时间比较获得的相对保留时间分别为：0.22(特征峰1)、0.28(特征峰2)、0.46(特征峰3)、0.62(特征峰4)、0.79(特征峰5)、1.00(特征峰6)、1.58(特征峰7)、1.82(特征峰8)、1.93(特征峰9)、2.09(特征峰10)，各相对保留时间应在规定值的±10％以内。
进一步地，步骤(8)中，所述相对校正因子的计算采用校准曲线相对斜率法及浓度法，以三叶苷的色谱峰为对照，测定根皮苷和根皮素相对于三叶苷的校正因子；
斜率法相对校正因子的计算过程：
Figure BDA0003554038780000031
其中，fsx为参照物与待测成分x的相对校正因子，ksx为参照物s与待测成分x的相对斜率比值，kx为某待测成分x的标准曲线斜率，ks为参照物s的标准曲线斜率；
浓度法相对校正因子的计算过程：
Figure BDA0003554038780000041
其中，fsx为参照物与待测成分x的相对校正因子，As为参照物峰面积，Ws为参照物浓度，Ax为某待测成分x的峰面积，Wx为某待测成分x的浓度。
进一步地，所述待测成分相对保留时间和相对校正因子为：
待测成分 相对保留时间 相对校正因子
根皮苷 0.795 3.017
三叶苷 1.000 1.000
根皮素 2.085 3.048
其中，相对保留时间计算方法：各待测成分色谱峰保留时间/三叶苷色谱峰保留时间。
各相对保留时间的可以在一定范围内变化，其相对变化幅度不大于10％。
各色谱峰的确认方法为使用相应对照品在相同条件下获得相同保留时间的色谱峰，同时辅助多波长扫描确认其光谱一致性。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
1、本发明方法通过超高效液相色谱技术，可以得到木姜叶柯的超高效液相色谱图，通过对共有峰的数量、相对保留时间的判断可以判定木姜叶柯的合格与否，通过与对照指纹图谱比对，可以对木姜叶柯药材进行定性鉴别，可以对多个共有峰成分含量进行一次性定量，并进一步通过比较测定样品图谱与对照指纹图谱之间的相似度，判断产品整体质量的稳定情况。
2、本发明方法基于超高效液相色谱技术，结合一测多评法，可以全面、高效、快速地对木姜叶柯中多成分的含量进行测定，有利于木姜叶柯及相关制剂的全面质量控制，且本发明方法检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，操作简便，检测成本低，对木姜叶柯的质量控制具有重要意义。
3、本发明方法建立了木姜叶柯一测多评质量评价方法，该方法以三叶苷作为对照物，根据相对保留时间对待测成分进行色谱峰定位，再结合相对校正因子计算各待测成分的含量，通过一测多评法与外标法的相互验证，证明待测成分含量测定结果无显著差异，测定结果准确可靠。
4、本发明的色谱检测过程仅需要14分钟，检测周期短，结果可靠。
附图说明
图1为实施例1中木姜叶柯高效液相色谱图。
图2为实施例1中木姜叶柯在波长分别为245nm和280nm下的高效液相色谱比较图。
图3为实施例1中14批木姜叶柯的指纹图谱叠加图。
图4为实施例2中木姜叶柯指纹图谱与对照指纹图谱叠加图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。
实施例1木姜叶柯一测多评质量控制方法的筛选过程
1.1仪器与材料
色谱仪：Agilent 1290Ⅱ超高效液相色谱仪
色谱柱：Thermo Syncronis C18，2.1×100mm，1.7μm；
试剂：甲醇、乙醇、乙腈，分析纯；磷酸、甲醇、乙腈，色谱纯；
对照品：根皮苷，成都格利普生物科技有限公司，纯度98.47％，批号0092801；
三叶苷，成都德思特生物技术公司，纯度≥98％，批号20160825；
根皮素，成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98％，批号17112402。
1.2方法选择
现有技术中检查发现3'-O-乙酰基根皮苷、2'-O-乙酰基根皮苷并不完全存在于所有样品中，目前尚未有指纹图谱研究方法报道。不能全面展示样品的整体信息。
1.3供试品溶液制备方法考察
1.3.1提取溶剂的考察
考察了水、甲醇、乙醇和乙醇-水溶液等溶剂对木姜叶柯样品的提取影响，结果表明，甲醇的提取效果较其他溶剂更好，结果见表1。
提取方法：取木姜叶柯，研细，取细粉适量(约0.2g)，精密称定，置10mL容量瓶中，加入提取溶剂，超声处理(300W，40kHz)，放冷，加提取溶剂至刻度，摇匀，离心(8000r/min，5min)，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
表1不同溶剂提取结果
Figure BDA0003554038780000051
Figure BDA0003554038780000061
1.3.2提取时间的考察
考察了不同提取时间对提取能力的影响。结果表明，超声20min的峰数量较少，总峰面积也较小，而超声40min和60min，对木姜叶柯的提取效果相差不大，无明显差异，故选取40min为超声时间，结果见表2。
表2不同超声时间提取结果
提取时间/min 20 40 60
峰数量 26 30 30
A根皮苷 446 448 452
A三叶苷 3982 4455 4431
A根皮素 161 179 180
A总峰 8732 9322 9379
1.3.3最终确定的供试品溶液的制备方法
取木姜叶柯，研细，取细粉适量(约0.2g)，精密称定，置10mL容量瓶中，加入提取溶剂，超声处理(300W，40kHz)，放冷，加提取溶剂至刻度，摇匀，离心(8000r/min，5min)，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
1.4色谱条件与系统适用性试验
1.4.1洗脱梯度考察
以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，考察了不同洗脱梯度对根皮苷、三叶苷与根皮素色谱峰的分离影响，结果发现以下梯度洗脱程序对根皮苷、三叶苷与根皮素色谱峰的分离效果最佳，色谱图见图1。
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～0.5 25 75
0.5～10 25→35 75→65
10～12 35 65
12～14 35→60 65→40
1.4.2色谱柱考察
考察了3种色谱柱：Waters ACQUITY
Figure BDA0003554038780000062
BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱，Dinoex RSLC C18(3.0×50mm，2.2μm)色谱柱，Thermo Syncronis C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱。结果表明，Thermo Syncronis C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱分离效果最好，能将根皮苷、三叶苷与根皮素峰分开，其它各峰的分离效果也最佳，故选用Thermo SyncronisC18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱。
1.4.3检测波长考察
对木姜叶柯样品溶液进行全波长扫描(190-400nm)，比较不同波长条件下的洗脱图谱，结合各主要特征性色谱峰的光谱结果，240-300基本符合要求，结合拟定量的根皮苷、三叶苷与根皮素最大吸收波长(280nm)，最终选定280nm作为检测波长，比较图谱见图2(木姜叶柯在波长分别为245nm和280nm下的高效液相色谱比较图)。
1.4.4最终确认的色谱条件
使用Thermo Syncronis C18，2.1×100mm，1.7μm型号色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B；在梯度洗脱过程中，流动相A的比例变化为：0～0.5min，25％乙腈；0.5～10min，25％～35％乙腈；10～12min，35％乙腈；12～14min，35％～60％乙腈；柱温40℃；检测波长285nm；流动相流速0.3mL/min，理论塔板数按三叶苷峰计算应不低于5000。
1.4.5相对校正因子的测定
采用校准曲线相对斜率法及浓度法，以三叶苷峰为对照，测定根皮苷和根皮素指标成分相对于三叶苷的校正因子。
斜率法相对校正因子的计算过程
Figure BDA0003554038780000071
fsx为参照物与待测成分x的相对校正因子
ksx为参照物s与待测成分x的相对斜率比值
kx为某待测成分x的标准曲线斜率
ks为参照物s的标准曲线斜率
浓度法相对校正因子的计算过程
Figure BDA0003554038780000072
fsx为参照物与待测成分x的相对校正因子；
As为参照物峰面积；
Ws为参照物浓度；
Ax为某待测成分x的峰面积；
Wx为某待测成分x的浓度。
相对保留时间的计算过程
相对保留时间＝待测物峰保留时间/参照峰保留时间
校准曲线及斜率法测定校正因子(三份)
测定方法：分别取根皮苷、三叶苷和根皮素对照品适量，精密称定，至10mL量瓶中，加入甲醇至刻度，振摇超声至溶解完全制成每1mL中分别约含0.18mg、0.18mg、0.09mg的溶液，摇匀，过0.22μm滤头，取续滤液，分别精密吸取混合对照品溶液0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL注入超高效液相色谱仪中，测定，每个进样体积连续进样两次，计算各成分对照品溶液峰面积平均值。
以峰面积为纵坐标，浓度为纵坐标绘制三种成分的标准曲线，计算回归方程、相关系数r2(≥0.9990)、线性范围。
确定根皮苷、根皮素相对于三叶苷的校正因子，见表3。
表3相对校正因子的确定
化学成分 斜率法 浓度法 平均 RSD
根皮苷 3.016 3.024 3.020 0.09％
三叶苷 1.000 1.000 1.000 0.00％
根皮素 3.045 3.052 3.049 0.04％
1.5方法学考察
1.5.1样品制备
对照品溶液的制备：分别精密称取根皮苷、三叶苷与根皮素对照品适量，加甲醇制成每1mL含1.78mg根皮苷、1.80mg三叶苷与0.92mg根皮素的对照品储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
供试品溶液的制备：取木姜叶柯，研细，取细粉适量(约0.2g)，精密称定，置10mL容量瓶中，加入提取溶剂，超声处理(250W，100kHz)，放冷，加提取溶剂至刻度，摇匀，离心(8000r/min，5min)，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
1.5.2精密度考察
取木姜叶柯(批号**99)适量，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，含量测定峰峰面积RSD不大于2％，共有峰峰相对保留时间偏差在5％以内；按中药色谱指纹图谱相似度评价，相似度不低于0.95，说明仪器精密度良好，结果见表4、表5。
表4精密度测定结果
精密度 1 2 3 4 5 6 RSD
峰数量 30 30 29 30 30 30 -
根皮苷 448 446 451 449 448 446 0.42％
三叶苷 4455 4468 4461 4439 4440 4473 0.32％
根皮素 179 177 179 178 177 177 0.55％
总峰面积 9322 9498 9187 9437 9207 9476 0.84％
相似度 1.000 0.999 1.000 1.000 1.000 0.999 -
表5精密度各共有峰相对峰保留时间
Figure BDA0003554038780000091
1.5.3重复性考察
取木姜叶柯(批号**99)适量，按供试品溶液制备操作制备样品溶液6份，各进一针测定，记录峰面积，含量测定峰峰面积RSD不大于2％，共有峰峰相对保留时间偏差在5％以内，按中药色谱指纹图谱相似度评价，相似度不低于0.95。结果表明，方法重复性良好，见表6、表7。
表6重复性样品测定结果
Figure BDA0003554038780000092
Figure BDA0003554038780000101
表7重复性样品各共有峰相对保留时间
Figure BDA0003554038780000102
1.5.4耐用性考察
样品溶液稳定性良好；柱温、流速等微小变化对检测无影响。
1.5.4.1溶液稳定性
取木姜叶柯(批号**99)适量，按供试品溶液制备操作制备样品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进行测定，记录色谱图，含量测定峰峰面积RSD不大于2％，共有峰峰相对保留时间偏差在5％以内；按中药色谱指纹图谱相似度评价，相似度不低于0.95，样品溶液稳定性良好，结果见表8、表9。
表8溶液稳定性测定结果
Figure BDA0003554038780000103
Figure BDA0003554038780000111
表9溶液稳定性各共有峰相对保留时间
Figure BDA0003554038780000112
1.5.4.2柱温考察
取木姜叶柯(批号**99)适量，按供试品溶液制备操作制备样品溶液，将色谱条件中柱温分别调整为38℃、42℃，进行测定，记录色谱图，含量测定峰峰面积RSD不大于2％，共有峰峰相对保留时间偏差在40℃条件相对时间5％以内；按中药色谱指纹图谱相似度评价，相似度不低于0.95，柱温对检测无影响，结果见表10、表11。
表10不同柱温测定结果
柱温 38℃ 40℃ 42℃ RSD
峰数量 30 30 30 -
根皮苷 445 448 448 0.39％
三叶苷 4379 4455 4503 1.41％
根皮素 181 179 179 0.64％
相似度 1.000 1.000 0.999 -
表11不同柱温条件各共有峰保留时间
Figure BDA0003554038780000113
Figure BDA0003554038780000121
1.5.4.3流速考察
取木姜叶柯(批号**99)适量，按供试品溶液制备操作制备样品溶液，将色谱条件中流速分别调整为0.29mL/min、0.31mL/min，进行测定，记录色谱图，含量测定峰峰面积随流速增大而整体变小，但相对总峰面积比值没有较大变化，共有峰峰相对保留时间的偏差在0.30mL/min条件相对时间5％以内；按中药色谱指纹图谱相似度评价，相似度不低于0.95，流速对检测无影响，结果见表12、表13。
表12不同流速测定结果
流速mL/min 0.29 0.3 0.31
峰数量 30 30 30
根皮苷 445 448 452
三叶苷 4479 4455 4432
根皮素 176 179 179
总峰面积 9379 9322 9276
相似度 0.999 1.000 0.999
表13不同流速条件各共有峰相对保留时间
Figure BDA0003554038780000122
Figure BDA0003554038780000131
1.5.5线性关系、检测限(LOD)和定量限(LOQ)的考察
分别精密吸取对照品储备液，用流动相逐级稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，分别进样1μL，测定(n＝3)。根皮苷、三叶苷与根皮素以平均峰面积X为横坐标，浓度Y为纵坐标进行线性回归，考察线性关系。取混合对照品储备液适量，加流动相逐级稀释，在上述色谱条件下进样测定，信噪比为3:1和10:1时的浓度分别为绿原酸和木犀草苷的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。由表14可知，各回归方程呈良好的线性关系。
表14根皮苷苷线性测定数据表
Figure BDA0003554038780000132
1.5.6准确性考察
采用加样回收法。取已知含量的木姜叶柯粉末9份，每份约0.1g，精密称定，分成3组，按低(80％)，中(100％)，高(120％)浓度分别精密加入一定量的根皮苷、三叶苷和根皮素对照品溶液，按照供试品的制备方法制备，在上述色谱条件进行测定，计算回收率。结果显示，回收率全达到97％以上，见表15。结果证实所建立的方法对于同时测定根皮苷、三叶苷和根皮素的含量具有较高的准确度。
表15加样回收率试验结果
Figure BDA0003554038780000133
Figure BDA0003554038780000141
实施例2木姜叶柯鉴别、指纹图谱测定以及根皮苷、三叶苷和根皮素含量测定
2.1仪器与材料
色谱仪：Agilent 1290Ⅱ超高效液相色谱仪
色谱柱：Thermo Syncronis C18，2.1×100mm，1.7μm；
试剂：甲醇、乙醇、乙腈，分析纯；磷酸、甲醇、乙腈，色谱纯；
对照品：根皮苷，成都格利普生物科技有限公司，纯度98.47％，批号0092801；
三叶苷，成都德思特生物技术公司，纯度≥98％，批号20160825；
根皮素，成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98％，批号17112402；
色谱柱：Waters CORTECS T3，2.1×150mm，1.6μm；
试剂：甲醇、乙醇、乙腈，分析纯；磷酸、甲醇、乙腈，色谱纯；
2.2样品溶液制备
参照物溶液：分别称根皮苷、三叶苷和根皮素取对照品各约1mg，置于100mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取根皮苷、三叶苷与根皮素对照品适量，加甲醇制成每1mL含1.78mg根皮苷、1.80mg三叶苷与0.92mg根皮素的对照品储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
供试品溶液的制备：取木姜叶柯，研细，取细粉适量(约0.2g)，精密称定，置10mL容量瓶中，加入提取溶剂，超声处理(250W，100kHz)，放冷，加提取溶剂至刻度，摇匀，离心(8000r/min，5min)，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3色谱条件及系统适用性
使用Thermo Syncronis C18，2.1×100mm，1.7μm型号色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B；在梯度洗脱过程中，流动相A的比例变化为：0～0.5min，25％乙腈；0.5～10min，25％～35％乙腈；10～12min，35％乙腈；12～14min，35％～60％乙腈；柱温40℃；检测波长285nm；流动相流速0.3mL/min，理论塔板数按三叶苷峰计算应不低于20000。
2.4测定法
分别精密吸取混合对照溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，用外标法计算根皮苷、三叶苷与根皮素含量，用《中药指纹图谱相似度评价系统》2012版对图谱进行处理，即得木姜叶柯指纹图谱，见图3(14批木姜叶柯的指纹图谱叠加图)。
2.5含量评价
取三批(批号**00、**01、**02)木姜叶柯，按2.2方法制备，供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图峰面积，分别用外标法与校正因子法计算根皮苷、三叶苷与根皮素含量，测定结果见表15。
表15木姜叶柯质量控制对比
Figure BDA0003554038780000151
从表15可知，采用本发明的一测多评法检测得到的含量与外标法检测到的含量无显著差异，说明本发明方法的测定结果是准确可靠的。
本发明的检测方法可以快速地对木姜叶柯中多成分的含量进行测定。
2.6指纹图谱评价
取上述3批木姜叶柯，按2.2方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液、参照物溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱图，记录色谱图，将采集到的UPLC图谱以AIA格式依次导入《中药指纹图谱相似度评价系统》2012版，与“2.4”生成的对照指纹图谱进行相似度对比，分别为0.979，0.978，0.978，均大于一般限度0.9。
供试品有10个特征性色谱峰，其中各特征性色谱峰以及保留时间分别为：
特征峰1(0.22±10％)、特征峰2(0.28±10％)、特征峰3(0.46±10％)、特征峰4(0.62±10％)、特征峰5：根皮苷(0.79±10％)、特征峰6：三叶苷(S±10％)、特征峰7(1.58±10％)、特征峰8(1.82±10％)、特征峰9(1.93±10％)、特征峰10：根皮素(2.09±10％)。
2.7鉴别
将供试品图谱与对照指纹图谱进行比对，以三叶苷色谱峰为参照峰，供试品图谱在与对照指纹图谱特征峰5(根皮苷)、特征峰6(三叶苷)、特征峰10(根皮素)相应位置有保留峰，见图4(木姜叶柯指纹图谱与对照指纹图谱叠加图)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)混合对照品溶液的制备：精密称取三种对照品根皮苷、三叶苷和根皮素适量，加甲醇配制成混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称取木姜叶柯粉末适量，于溶剂中浸泡，超声提取，离心，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液；
(3)检测：采用超高效液相色谱分别对步骤(1)中的混合对照品溶液和步骤(2)中的供试品溶液进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
(4)对照指纹图谱的建立：将现行标准评价合格的样品的供试品图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》合成对照指纹图谱，以根皮苷、三叶苷和根皮素参照物溶液标定图谱中特征峰5、特征峰6、特征峰10；
(5)相似度的分析：将待评价样品的供试品指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，与对照指纹图谱进行相似度分析，待评价样品的供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不低于0.9；
(6)鉴别：将待评价样品的供试品指纹图谱与对照指纹图谱进行比对，待评价样品的供试品图谱在与对照指纹图谱特征峰5、特征峰6、特征峰10相应位置有保留峰，即可判定为木姜叶柯；
(7)待测成分峰位的确定：以混合对照品中三叶苷的色谱峰作为对照，计算混合对照品中根皮苷和根皮素相对三叶苷的相对保留时间，采用相对保留时间确定根皮苷和根皮素的峰位；
(8)相对校正因子的计算：确定混合对照品中根皮苷和根皮素的峰位后，以混合对照品中三叶苷的色谱峰作为对照，根据混合对照品中根皮苷和根皮素的色谱峰峰面积分别计算根皮苷和根皮素的相对校正因子；
(9)待测成分含量的测定：根据相对校正因子计算待评价样品的供试品中根皮苷和根皮素的质量含量。
2.根据权利要求1所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温为38～42℃，检测波长为240～300nm，流动相流速为0.29～0.31mL/min；
所述色谱柱为Waters ACQUITY
Figure FDA0003554038770000011
BEH C18，2.1×100mm，1.7μm型号色谱柱；DinoexRSLC C18，3.0×50mm，2.2μm型号色谱柱；Thermo Syncronis C18，2.1×100mm，1.7μm型号色谱柱中的任一种。
3.根据权利要求2所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述色谱条件为：使用Thermo Syncronis C18，2.1×100mm，1.7μm型号色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温为40℃，检测波长为280nm，流动相流速为0.3mL/min。
4.根据权利要求3所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程如下：0～0.5min，25％A；0.5～10min，25％～35％A；10～12min，35％A；12～14min，35％～60％A。
5.根据权利要求1所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取溶剂为纯化水、乙醇或甲醇；提取时间为20～60min；超声条件为150～350W，50～100kHz。
6.根据权利要求5所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取溶剂为甲醇；提取时间为40min；超声条件为250W，100kHz。
7.根据权利要求1所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述待评价样品的供试品指纹图谱中至少包括根皮苷、三叶苷和根皮素在内的10个特征色谱峰，其保留时间与三叶苷色谱峰保留时间比较获得的相对保留时间分别为：特征峰1，0.22；特征峰2，0.28；特征峰3，0.46；特征峰4，0.62；特征峰5，0.79；特征峰6，1.00；特征峰7，1.58；特征峰8，1.82；特征峰9，1.93；特征峰10，2.09；各相对保留时间应在规定值的±10％以内。
8.根据权利要求1所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述三叶苷的相对保留时间为1.000，根皮苷的相对保留时间为0.795，根皮素的相对保留时间为2.085；各相对保留时间的相对变化幅度不大于10％。
9.根据权利要求1所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(8)中，所述三叶苷的相对校正因子为1.000，根皮苷的相对校正因子为3.017，根皮素的相对校正因子为3.048。
10.根据权利要求1所述的木姜叶柯质量控制检测方法，其特征在于，步骤(8)中，所述相对校正因子的计算采用校准曲线相对斜率法及浓度法，以三叶苷的色谱峰为对照，测定根皮苷和根皮素相对于三叶苷的校正因子；
斜率法相对校正因子的计算过程：
Figure FDA0003554038770000021
其中，fsx为参照物与待测成分x的相对校正因子，ksx为参照物s与待测成分x的相对斜率比值，kx为某待测成分x的标准曲线斜率，ks为参照物s的标准曲线斜率；
浓度法相对校正因子的计算过程：
Figure FDA0003554038770000031
其中，fsx为参照物与待测成分x的相对校正因子，As为参照物峰面积，Ws为参照物浓度，Ax为某待测成分x的峰面积，Wx为某待测成分x的浓度。
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