发明内容
本发明的目的在于:提供一种杏丹注射剂的质量控制方法,这种方法针对如下产品向相关的生产、检测机构提供检测的指标、检测的手段、技术方法等,以便更好的控制该制剂的质量,保证用药的安全性,能够更好的指导生产,使生产工艺控制更加严格合理,使消费者能全面认识产品质地,所针对的产品为:
1)由银杏叶药材∶丹参药材=20-80∶80-20组方,分别或合并采用水或乙醇溶液提取,然后用沉淀法、柱层析法、溶剂萃取法和超临界萃取法中的一种或几种进行适当精制、混匀,然后制成注射剂,包括直接用于注射给药的注射液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液、直接供静脉滴注的葡萄糖静脉输液和氯化钠静脉输液以及用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得的注射用无菌粉末和无菌块状物;
2)由银杏叶提取物∶丹参提取物=20-80∶80-20组方制成的注射剂,包括直接用于注射给药的注射液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液、直接供静脉滴注的葡萄糖静脉输液和氯化钠静脉输液以及用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得的注射用无菌粉末和无菌块状物,所述的提取物可以来源于市售,也可以采用水或乙醇溶液提取,然后用沉淀法、柱层析法、溶剂萃取法和超临界萃取法中的一种或几种进行适当精制之后得到。
或者是专利申请号为:200410022288.9,名称为:“一种治疗心脑血管疾病的中药及其制备方法”提供的制备方法制备的注射制剂。
本发明是这样构成的:
杏丹注射剂的质量控制方法,包括以下全部或部分内容:
(1)杏丹注射剂的指纹图谱测试,包括以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种;
(2)银杏叶药材、银杏叶提取物、银杏叶总黄酮醇苷、银杏叶总萜类内酯、槲皮素、山奈素、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、丹参药材、丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、丹参酮IIA中全部或部分成分的鉴别测试方法;
(3)丹参素或其钠盐、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、丹参酮IIA、槲皮素、山奈素、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果酸、总银杏酸、总黄酮醇苷、总萜类内酯、总酚中全部或部分成分的含量测试方法。
其中,指纹图谱检测方法包括如下的一种或两种:
a、采用液相色谱法测试以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:取待测杏丹注射制剂适量,加水或甲醇或乙醇溶解或稀释,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:取适量丹参和银杏叶药材中的主要活性成分对照品,包括丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B或其镁盐、槲皮素、山奈素、异鼠李素中的一种,用水或甲醇或乙醇溶解,定容至合适浓度,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料:流动相为乙腈或甲醇-0.01mol/L~2mol/L磷酸二氢钠水溶液或0.01mol/L~2mol/L磷酸二氢钾水溶液或0.01mol/L~2mol/L磷酸氢二钠水溶液或水或0.1%~5%冰醋酸溶液或0.1%~5%甲酸溶液或0.02%~5%磷酸溶液,梯度洗脱,流速为0.5~2.0ml/min、检测波长为190~410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测,柱温在20~60℃范围内;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有3~50个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,应符合下列要求中的部分或全部:
I.计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,应为0.80~1.00;
II.待测杏丹注射剂指纹图谱中,非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;
III.待测杏丹注射剂指纹图谱中有5%~60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较,其差值不得大于±50%;
b、采用液相色谱法测试以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:取待测杏丹注射制剂适量,加水溶解,加0.2%~30%盐酸溶液,用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷萃取,合并萃取液,用0.5%~20%醋酸钠溶液洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤,合并醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷提取液及洗液,用水洗涤,合并水洗液,用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤,合并醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷液,回收醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷至干,残渣加丙酮或甲醇或乙醇使溶解,摇匀,滤过,滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:取白果内酯或银杏内酯A或银杏内酯B或银杏内酯C中的一种,用甲醇或乙醇溶解,定容至合适浓度,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料:流动相A为乙腈或乙腈-四氢呋喃(5~95∶95~5)或甲醇或甲醇-四氢呋喃(5~95∶95~5),流动相B为水或0.1%~5%冰醋酸或0.1%~5%甲酸或0.005%~5%磷酸溶液,梯度洗脱,流速为0.5~2.0ml/min、检测波长为190~410nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测,柱温在20~60℃范围内;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有3~30个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,应符合下列要求中的部分或全部:
I.计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,应为0.80~1.00;
II.待测杏丹注射剂指纹图谱中,非共有峰面积不得超过总峰面积的10%;
III.待测杏丹注射剂指纹图谱中有20%~80%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较,其差值不得大于±50%。
优选为:
a、采用液相色谱法测试以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:精密称取待测杏丹注射制剂适量,加水制成每1ml含10mg的溶液,用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:精密称取丹参素钠对照品适量,加甲醇制成每1ml含15μg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料;流动相A为0.026%磷酸溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至30分钟,流动相B的比例由2%升至22%,从30分钟至60分钟,流动相B的比例由22%升至26%;流速为1.0ml/min,检测波长为280±2nm,柱温为30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有3~30个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,应符合下列要求中的部分或全部:
I.计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,应为0.90~1.00;
II.待测杏丹注射剂指纹图谱中,非共有峰面积不得超过总峰面积的5%;
III.待测杏丹注射剂指纹图谱中有10%~40%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较,其差值不得大于±30%;
b、采用液相色谱法测试以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:取待测杏丹注射制剂1.5g,加水40ml溶解,加2%盐酸溶液5滴,用醋酸乙酯提取4次,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次20ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加丙酮适量使溶解并定量转移至5ml量瓶中,加丙酮至刻度,摇匀,滤过,滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:取银杏内酯A对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料:流动相A为甲醇-四氢呋喃(25∶10),流动相B为水,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至25分钟,流动相B的比例为65%,从25分钟至60分钟,流动相B的比例由65%降至35%,流速为0.8ml/min、蒸发光散射检测器检测,柱温30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有3~20个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,应符合下列要求中的部分或全部:
I.计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,应为0.90~1.00;
II.待测杏丹注射剂指纹图谱中,非共有峰面积不得超过总峰面积的5%;
III.待测杏丹注射剂指纹图谱中有30%~60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较,其差值不得大于±30%。
所述注射剂的鉴别方法包括以下全部或部分内容:
a、注射剂中丹参药材、丹参酮IIA中一种或两种的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,用乙醚或石油醚或二氯甲烷或三氯甲烷或醋酸乙酯提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯或三氯甲烷或二氯甲烷溶解,作为供试品溶液;另取丹参对照药材,丹参酮IIA对照品中的一种或两种,制备对照溶液;丹参对照药材溶液的制备:取丹参对照药材,同法制成对照药材溶液;对照品溶液的制备:取丹参酮IIA对照品,加醋酸乙酯或甲醇或乙醇溶解并稀释至合适浓度,作为对照品溶液;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各1~30μl,分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上,以苯或甲苯或二甲苯-醋酸乙酯或三氯甲烷或二氯甲烷2~40∶0.2~5为展开剂,展开,取出,晾干,供试品色谱中,在与对照药材及对照品中一种或两种的色谱相应位置上,应显相同颜色的斑点;
b、注射剂中丹参酮IIA的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水或甲醇或乙醇或流动相至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇或乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-水或0.0596~5%冰醋酸水溶液或0.02%~0.5%磷酸水溶液或0.05%~5%甲酸水溶液20~90∶80~10为流动相,流速为0.5~2ml/min,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;供试品色谱中,应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰;
c、注射剂中丹酚酸B或其镁盐的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加甲醇或乙醇或三氯甲烷或二氯甲烷提取,滤过,滤液浓缩,作为供试品溶液;以丹酚酸B或其镁盐对照品的醋酸乙酯或10%~无水甲醇或10%~无水乙醇溶液为对照;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各1~30μl,分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上,以苯或甲苯或二甲苯-三氯甲烷或二氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇或乙醇或丙酮-甲酸或乙酸0.2~6∶0.5~8∶0.5~10∶0.1~3∶0.5~5为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯365nm或254nm或日光下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,应显相同颜色的斑点;
d、注射剂中丹酚酸B或其镁盐的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水或甲醇或乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹酚酸B或其镁盐对照品的水或10%~无水甲醇或10%~无水乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-水或0.2%~5%冰醋酸水溶液或0.005%~5%磷酸水溶液或0.2%~5%甲酸水溶液10~50∶2~30∶93~20为流动相,流速为0.5~2.0ml/min,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;供试品色谱中,应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰;
e、注射剂中丹参素或其钠盐、原儿茶醛中一种或两种的薄层色色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水或甲醇或乙醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液;以丹参素或其钠盐、原儿茶醛对照品中一种或两种的甲醇或乙醇溶液为对照;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各1~30μl,分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上,以三氯甲烷或二氯甲烷或醋酸乙酯或甲酸乙酯-丙酮或甲醇或乙醇-甲酸或冰醋酸1~25∶0.2~5∶0.2~5或苯或甲苯或二甲苯-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲酸或冰醋酸2~25∶1~22∶0.2~10为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯365nm或254nm或日光下检视或喷以三氯化铁与铁氰化钾的混合溶液后日光下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,应显相同颜色的斑点;
f、注射剂中丹参素或其钠盐、原儿茶醛中一种或两种的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水或甲醇或乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素或其钠盐、原儿茶醛中一种或两种对照品的水或甲醇或乙醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇或乙腈-水或0.05%~5%冰醋酸水溶液或0.005%~5%磷酸水溶液或0.05%~5%甲酸水溶液5~40∶95~60为流动相,流速为0.5~2.0ml/min,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;供试品色谱中,应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰;
g、注射剂中银杏叶提取物的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加正丁醇或醋酸乙酯提取,提取液蒸干,残渣加甲醇或乙醇溶解,作为供试品溶液;另取银杏叶对照提取物,同法制成对照提取物溶液;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各1~30μl,分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜或以含0.1%~8%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯或甲酸乙酯-丁酮或丙酮-甲醇或乙醇-水1~20∶0.5~10∶0.1~5∶0.1~5为展开剂,展开,取出,晾干,喷以0.5%~10%三氯化铝乙醇溶液,分别置日光及紫外光灯365nm或254nm下检视,供试品色谱中,在与对照提取物相应的位置上,日光下应显相同颜色的斑点,紫外灯下应显相同颜色的荧光斑点。
h、注射剂中黄酮醇苷类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加甲醇-5%~35%盐酸或乙醇-5%~35%盐酸的混合溶液,加热回流10分钟~120分钟,迅速冷却至室温,用甲醇或乙醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;另取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品中的一种或几种,分别或和并加甲醇或乙醇溶解并稀释至合适浓度;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-水或0.05%~10%冰醋酸水溶液或0.05%~10%甲酸水溶液或0.01%~5%磷酸水溶液20~80∶80~20为流动相,流速为0.5~2.0ml/min,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;供试品色谱中,应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
i、注射剂中萜类内酯类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加水溶解,加0.2%~30%盐酸溶液,用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷萃取,合并萃取液,用0.5%~20%醋酸钠溶液洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤,合并醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷提取液及洗液,用水洗涤,合并水洗液,用醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷洗涤,合并醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷液,回收醋酸乙酯或正丁醇或三氯甲烷或二氯甲烷至干,残渣加丙酮或甲醇或乙醇使溶解,作为供试品溶液;另白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的一种或几种,分别或合并加甲醇或乙醇制成每1ml含0.2mg~5mg的溶液;采用薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液和白果内酯对照品溶液、银杏内酯A对照品溶液、银杏内酯B对照品溶液、银杏内酯C对照品溶液的一种或几种的混合对照品溶液各1~30μl,分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或以含0.1%~8%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上,以苯或甲苯-醋酸乙酯或甲酸乙酯-丙酮或丁酮-甲醇或乙醇1~30∶0.5~15∶0.5~15∶0.1~5为展开剂,展开,取出,晾干,用醋酐蒸汽熏蒸后在80℃~180℃加热5~60分钟,取出,放冷,置日光或紫外光灯365nm或254nm下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,应显相同颜色斑点;
j、注射剂中萜类内酯类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加水溶解后加0.2~30%盐酸溶液,用醋酸乙酯或正丁醇振摇提取,合并提取液,用0.5%~20%醋酸钠溶液洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯或正丁醇洗涤。合并醋酸乙酯或正丁醇提取液及洗液,用水洗涤,合并水洗液,用醋酸乙酯或正丁醇洗涤,合并醋酸乙酯或正丁醇液,回收醋酸乙酯或正丁醇至干,残渣加丙酮或甲醇或乙醇使溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-四氢呋喃-水或0.05%~10%冰醋酸水溶液或0.05%~10%甲酸水溶液或0.01%~5%磷酸水溶液10~50∶5~20∶85~30为流动相,流速为0.5~2.0ml/min,蒸发光散射检测器检测,柱温在20~60℃范围内;供试品色谱中,应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
优选为:
a、注射剂中丹参药材、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加乙醚提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为供试品溶液;另取丹参对照药材,丹参酮IIA对照品中的一种或两种,制备对照溶液;丹参对照药材溶液的制备:取丹参对照药材,加乙醚提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为对照药材溶液;对照品溶液的制备:取丹参酮IIA对照品,加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液,作为对照品溶液;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯19∶1为展开剂,展开,取出,晾干,供试品色谱中,在与对照药材及对照品中一种或两种的色谱相应位置上,显相同颜色的斑点;
b、注射剂中丹参酮IIA的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液75∶25为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰;
c、注射剂中丹酚酸B的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加75%甲醇溶液溶解,作为供试品溶液;以丹酚酸B对照品的75%甲醇溶液为对照;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸2∶3∶4∶0.5∶2为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯254nm检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
d、注射剂中丹酚酸B的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;取丹酚酸B对照品的75%甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.7%甲酸水溶液30∶10∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰;
e、注射剂中丹参素、原儿茶醛中一种或两种的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另取丹参素钠和原儿茶醛对照品中的一种或两种,分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以苯-醋酸乙酯-甲酸8∶7∶2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以新鲜配制的2%三氯化铁与1%铁氰化钾等体积的混合液,在日光下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
f、注射剂中丹参素、原儿茶醛中一种或两种的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液13∶87为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,柱温30℃,供试品色谱中,与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰;
g、注射剂中银杏叶提取物的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加正丁醇提取,提取液蒸干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;另取银杏叶对照提取物,同法制成对照提取物溶液;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各3μl,分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水5∶3∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝乙醇溶液,置紫外光灯365nm检视,供试品色谱中,在与对照提取物相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
h、注射剂中黄酮醇苷类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加甲醇-25%盐酸=4∶1的混合溶液,加热回流30分钟,迅速冷却至室温,用甲醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,55∶45甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
i、注射剂中萜类内酯类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加水溶解,加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次,每次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的甲醇溶液为对照;采用薄层色谱法试验,吸取上述溶液各15μl,分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇10∶5∶5∶0.6为展开剂,10℃以下展开,取出,晾干,用醋酐蒸汽熏蒸15分钟,在140℃~160℃加热30分钟,取出,放冷,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点;
j、注射剂中萜类内酯类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射制剂适量,加水溶解后加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,25∶10∶65甲醇-四氢呋喃-水为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
所述注射剂的含量测试方法包括以下全部或部分内容:
a、注射剂中丹参素或其钠盐、原儿茶醛中一种或两种的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水或甲醇或乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素或其钠盐、原儿茶醛对照品中一种或两种的水或甲醇或乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-水或0.05%~5%冰醋酸水溶液或0.005%~5%磷酸水溶液或0.05%~5%甲酸溶液5~40∶95~60为流动相,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;以外标一点法或标准曲线法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,含量限度应为以下一项或几项:
(1)每单位量含丹参素或其钠盐的限度不得少于1.5mg;
(2)每单位量含原儿茶醛的限度不得少于0.65mg;
(3)每单位量含丹参素或其钠盐和原儿茶醛的总和的限度不得少于2.15mg;
b.注射剂中总酚的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加水配制至合适浓度,摇匀,精密量取适量,置量瓶中,加50%甲醇或水1~25ml,加5%亚硝酸钠溶液0.3ml~5ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液0.3ml~5ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液4~25ml,再加50%甲醇或水至刻度,摇匀,作为供试品溶液;以芦丁或原儿茶醛或丹参素钠或丹酚酸B作为对照品,同法制得对照品溶液;以随行溶剂为空白,采用分光光度法,在500±100nm处测定吸收度,以外标一点法或标准曲线法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总酚的限度以芦丁或原儿茶醛或丹参素钠或丹酚酸B计,不得少于8.5mg;
c.注射剂中丹酚酸B或其镁盐含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水或甲醇或乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹酚酸B或其镁盐对照品的水或10%~无水甲醇或10%~无水乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-水或0.5%~5%冰醋酸水溶液或0.02%~0.5%磷酸水溶液或0.5%~5%甲酸水溶液10~50∶2~30∶93~20为流动相,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;以外标一点法或标准曲线法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹酚酸B或其镁盐的限度不得少于0.8mg;
d、注射剂中丹参酮IIA的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水或甲醇或乙醇或流动相至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇或乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-水或0.05%~5%冰醋酸水溶液或0.02%~0.5%磷酸水溶液或0.05%~5%甲酸水溶液20~90∶80~10为流动相,流速为0.5~2ml/min,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;以外标一点法或标准曲线法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.05mg;
e、注射剂中总黄酮醇苷的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加甲醇或乙醇-5%~35%盐酸的混合溶液,加热回流10分钟~120分钟,迅速冷却至室温,用甲醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-水或0.05%~10%冰醋酸水溶液或0.05%~10%甲酸水溶液或0.01%~5%磷酸水溶液20~80∶80~20为流动相,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;以外标一点法或标准曲线法进行计算含量后再由公式黄酮醇苷的含量%=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51,计算黄酮醇苷的含量,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含黄酮醇苷的限度不得少于2.0mg;
f、注射剂中萜类内酯类成分的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加水溶解后加0.2%~30%盐酸溶液,用醋酸乙酯或正丁醇振摇提取,合并提取液,用0.5%~20%醋酸钠溶液洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯或正丁醇洗涤。合并醋酸乙酯或正丁醇提取液及洗液,用水洗涤,合并水洗液,用醋酸乙酯或正丁醇洗涤,合并醋酸乙酯或正丁醇液,回收醋酸乙酯或正丁醇至干,残渣加丙酮或甲醇或乙醇使溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的甲醇或乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-四氢呋喃-水或0.05%~10%冰醋酸水溶液或0.05%~10%甲酸水溶液或0.01%~5%磷酸水溶液10~50∶5~20∶85~30为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在20~60℃范围内;以外标两点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含萜类内酯的量以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C合计的限度不得少于0.5mg;
g、注射剂中白果酸的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加石油醚或乙醚或三氯甲烷或醋酸乙酯提取,滤过,回收溶媒后用甲醇溶解,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果酸对照品的甲醇或乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-水或0.05%~5%冰醋酸水溶液或0.02%~0.5%磷酸水溶液或0.05%~5%甲酸水溶液5~99∶95~1为流动相,流速为0.5~2ml/min,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;以外标一点法或标准曲线法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含白果酸的限度不得高于百万分之十;
h:注射剂中总银杏酸的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加石油醚或乙醚或三氯甲烷或醋酸乙酯提取,滤过,回收溶媒后用甲醇溶解,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果新酸对照品的甲醇或乙醇溶液为对照;以总银杏酸对照品的甲醇或乙醇溶液为定位用对照溶液;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇或乙腈-水或0.05%~5%冰醋酸水溶液或0.02%~0.5%磷酸水溶液或0.05%~5%甲酸水溶液5~99∶95~1为流动相,流速为0.5~2ml/min,检测波长为190~410nm范围内的一个或几个,柱温在20~60℃范围内;供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积,以白果新酸对照品以外标一点法或标准曲线法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总银杏酸的限度不得高于百万分之二十。
优选为:
a.注射剂中丹参素、原儿茶醛中一种或两种的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。以丹参素钠、原儿茶醛中一种或两种对照品的水溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液13∶87为流动相,检测波长为280nm,柱温30℃,以外标一点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,含量限度应为以下一项或几项:
(1)每单位量含丹参素的限度不得少于3.0mg;
(2)每单位量含原儿茶醛的限度不得少于1.3mg;
(3)每单位量含丹参素和原儿茶醛的总和的限度不得少于4.3mg;
b.注射剂中总酚含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加水制成每1ml含2.5mg的溶液,摇匀,精密量取1ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,作为供试品溶液;以原儿茶醛作为对照品,同法制得对照品溶液;以随行溶剂为空白,照分光光度法,在518nm处测定吸收度,以外标一点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总酚的限度以原儿茶醛计,不得少于17.0mg;
c、注射剂中丹酚酸B含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹酚酸B或其镁盐对照品的75%甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.7%甲酸水溶液30∶10∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹酚酸B的限度不得少于1.6mg;
d、注射剂中丹参酮IIA的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液75∶25为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.1mg;
e、注射剂中总黄酮醇苷的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加甲醇-25%盐酸=4∶1的混合溶液,加热回流30分钟,迅速冷却至室温,用甲醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,55%∶45%甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;以外标一点法进行计算含量后再由公式黄酮醇苷的含量%=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51,计算黄酮醇苷的含量,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总黄酮醇苷的限度不得少于4.0mg;
f、注射剂中萜类内酯类成分的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加水溶解,加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,25%∶10%∶65%甲醇-四氢呋喃-水为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;以外标两点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含萜类内酯的限度的量以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C合计不得少于1.0mg;
g、注射剂中白果酸的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,置索氏提取器中,加石油醚提取6小时,滤过,回收溶媒,浸膏用甲醇溶解,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果酸对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%磷酸水溶液90∶10为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温40℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含白果酸的限度不得高于百万分之二;
h:注射剂中总银杏酸的含量测定:
取待测杏丹注射制剂适量,加60~90℃的石油醚回流提取2小时,滤过,滤液回收至干,残渣用甲醇溶解,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果新酸对照品的甲醇溶液为对照;以总银杏酸对照品的甲醇溶液为定位用对照溶液;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液90∶10为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温30℃;供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积,以白果新酸对照品以外标一点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总银杏酸的限度不得高于百万分之十。所述注射剂中的酚类、黄酮类、内酯类及其它所有可测成分的总含量占制剂中扣除辅料量和水分量的总固体量的25%以上。(总固体量是指:注射剂内容物的重量,如为注射液或大输液,则是指将其水浴蒸干,105℃干燥、冷却后称得的重量)。
与现有技术相比,本发明能更加完善的控制以银杏叶和丹参的药材或其提取物制成的杏丹注射剂产品质量。该产品成分复杂,如果只用其中一、两种成分来说明其内在质量,具有一定的片面性,更无法判断其药效的指标成分,最好在专属性较强的定性、定量检测基础上增加以银杏叶成分特征为主的指纹图谱和以丹参成分特征为主的指纹图谱来全面控制注射剂的质量;由于杏丹注射剂中两种药材所含成分相互之间的干扰影响,导致该制剂较单独的银杏叶制剂、丹参制剂的指纹图谱特征峰有很大的不同,采用常规的检测银杏叶或丹参的液相色谱条件,各成分特征峰的分离效果很难满足要求,只有采用本发明的条件,选用适宜的参数进行梯度洗脱,才能得到专属、准确、稳定、可操作性强的理想的指纹图谱。通过实验证明,本发明质量控制方法对以银杏叶、丹参制成的中药注射剂产品的质量控制更为有效,方法精密度、稳定性均较高。
实验例1 以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的制备
a、实验仪器、试剂及样品:
对照品:丹参素钠:中国药品生物制品检定所
b、色谱条件与系统适应性实验:
1.色谱柱的选择:
研究过程中,选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱,分别试用了Zorbax、Inertsil ODS-3、Diamonsil ODS(均为C18,4.6mm×200mm,5μm)三种牌号的色谱柱,结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果,其中Inertsil ODS-3色谱柱分离效果最好,柱效最高。故最终选用Diamonsil ODS色谱柱(4.6mm×200mm,5μm)为实验研究柱。
2.流动相的选择:
研究过程中分别考察了(1)甲醇查?0∶90),(2)甲醇?.1%冰醋酸(5∶95),(3)甲醇?.0596磷酸(5∶995)(4)乙腈-0.02696磷酸水溶液(梯度洗脱)四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下,峰形较差,分离不好;流动相(2)条件下,峰形较好,但1小时内出峰较少,仍有不少组分滞留在后出峰;流动相(3)条件下,峰形较好,出峰不完全;流动相(4)条件下,峰形较好,出峰完全且分布均匀,故而最终被选用。
3.检测波长的确定:
研究中在乙腈-0.026%磷酸(梯度洗脱)流动相条件下,分别考察了在不同波段典型波长205、230、254、280、360nm下的色谱峰情况,结果显示,在205、230、360nm下色谱峰较少,205、230nm下基线漂移严重,254、288nm下基线良好,其中288nm下色谱峰较多,故最终选用280nm作为检测波长。
4.仪器、色谱柱及积分参数:
4.1仪器参数:选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Agilent 1100系列高效液相色谱仪,Chemstation色谱工作站。色谱柱为Diamonsil ODS(200mm×4.6mm,5μm);柱温30℃,流速1.0ml/min。
4.2积分参数:Slope Sensitivity:1,peak width:0.05,最小峰面积为参照物(S)峰峰面积的5%,最小峰高为S峰峰高的5%。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5%)的计算,同时保证与参照物的相关性。
5.供试品溶液的制备:
取本品约0.1g,精密称定,置10ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。用0.45靘的微孔滤膜过滤,取续滤液即得。
6.参照物溶液的制备:
丹参素钠为丹参主要水溶性活性成分之一,其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且相对较稳定,同时兼顾中间体和原料药的研究,因此选定丹参素钠作为参照物,并用水作溶剂,测定结果显示该方法可行。
7.指纹图谱及技术参数:
根据10批样品制定标准指纹图谱,将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较,相似度均在0.90~1.00之间。
实验例2 以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱的制备
a、实验仪器、试剂及样品:
对照品:银杏内酯A:中国药品生物制品检定所。
b、色谱条件与系统适应性实验:
1.色谱柱的选择:
研究过程中,选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱,分别试用了Zorbax(C18,4.6mm×200mm,5um)、Inertsil ODS-3(C18,4.6mm×200mm,5um)、PlatinumC18(5μm 4.6×250mm)三种牌号的色谱柱,结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果,其中Platinum C18(5μm 4.6×250mm)色谱柱分离效果最好,柱效最高,可以达到5000以上(以参照物银杏内酯A计算)。故最终选用Platinum C18(5μm 4.6×250mm)为实验研究柱。
2.流动相的选择:
研究过程中分别考察了(1)甲醇查?0∶80),(2)乙腈查?0∶80),(3)乙腈?%冰醋酸水溶液(梯度洗脱)(4)A为甲醇-四氢呋喃(25∶10),B为水(梯度洗脱)四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下,峰形较差,1小时内出峰较少,仍有不少组分滞留在后出峰;流动相(2)流动相条件下,峰形较差,分离不好;(3)条件下,峰拖尾严重,出峰不完全;流动相(4)条件下,峰形较好,出峰完全且分布均匀,故而最终被选用。
3.检测波长的确定:
研究中在A为甲醇-四氢呋喃(25∶10),B为水(梯度洗脱)流动相条件下,分别考察了漂移管温度(105℃、110℃、115℃)及气流速度(2.4ml/min、2.7ml/min、3.0ml/min)条件下的色谱峰及基线噪音的情况,结果显示,在漂移管温度110℃、气流速度2.7ml/min基线平稳,噪音较小,色谱峰分离及保留时间适中且稳定,故最终选用漂移管温度110℃、气流速度2.7ml/min作为检测条件。
4.仪器、色谱柱及积分参数:
4.1仪器参数:选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Alltech高效液相色谱仪,AlltechStation色谱工作站,Alltech ELSD 2000ES。色谱柱为Platinum C18(5μm 4.6×250mm);柱温30℃,流速0.8ml/min。
4.2积分参数:Slope Sensitivity:500,peak width:0.2,最小峰面积为参照物(S)峰峰面积的5%,最小峰高为S峰峰高的5%。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5%)的计算,同时保证与参照物的相关性。
5.供试品溶液的制备:
精密称取本品粉末约1.5g,加水40ml溶解,加2%盐酸溶液5滴,用醋酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml),合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次20ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加丙酮使溶解并转移至5ml量瓶中,加丙酮至刻度,摇匀,即得。
6.参照物溶液的制备:
银杏内酯A为丹参中主要活性成分之一,其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳定,同时兼顾中间体和药材的研究,因此选定银杏内酯A作为参照物。
7.指纹图谱及技术参数:
根据10批样品制定标准指纹图谱,将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较,相似度均在0.90~1.00之间。
实验例3杏丹注射剂中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别方法:
为了突出丹参的特征,选择了丹参、丹参酮II
A作为其特征斑点,但是由于药材中存在较多与丹参酮II
A结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对丹参酮II
A进行了展开:
条件 |
问题 |
甲苯-正己烷-甲醇-水(15∶5∶5∶1)硅胶H薄层板 |
对照品展开至前沿 |
苯-环己烷-乙醇-甲酸(15∶10∶1∶1)硅胶H薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
环己烷-甲酸乙酯-甲醇(10∶5∶6)硅胶G薄层板 |
对照品展开至前沿 |
正己烷-醋酸乙酯-甲醇(15∶5∶1)硅胶GF254薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
甲苯-甲醇(10-0.8)硅胶H薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
苯-甲醇(15-0.8)硅胶G薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
苯-醋酸乙酯(19∶1)硅胶G薄层板 |
分离清晰,Rf值适中阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以硅胶G薄层板为固定相,以苯-醋酸乙酯(19∶1)硅胶G薄层板为展开剂,在此条件下,丹参酮IIA的Rf值适中,和其它斑点分离清晰,阴性无干扰。
实验例4杏丹注射剂中丹参酮IIA的液相色谱鉴别方法:
为了突出丹参的特征,除了薄层鉴别方法以外,选择了丹参酮II
A作为其特征成分,但是由于药材中存在较多与丹参酮II
A结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对丹参酮II
A进行了分离:
条件 |
问题 |
甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钠(80∶20)十八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠(40∶60)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
甲醇-0.05mol/L磷酸氢二钠(75∶25)八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
乙腈-0.05mol/L磷酸氢二钠(70∶30)十八烷基硅烷键合硅胶 |
峰形不太对称 |
乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾(70∶30)十八烷基硅烷键合硅胶 |
峰形不太对称 |
甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾(80∶20)八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
甲醇-1%冰醋酸水溶液(75∶25)十八烷基硅烷键合硅胶 |
保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,甲醇-1%冰醋酸水溶液(75∶25)为流动相,在此条件下,丹参酮IIA保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰。
实验例5杏丹注射剂中丹酚酸B或其镁盐的薄层色谱鉴别方法:
为了突出丹参的特征,选择了丹酚酸B或其镁盐作为其特征斑点,但是由于药材中存在较多与丹酚酸B或其镁盐结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对丹酚酸B或其镁盐进行了展开:
条件 |
问题 |
苯-甲醇-醋酸乙酯(50∶10∶3)硅胶GF254薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
甲苯-甲醇-醋酸甲酯(50∶10∶3)硅胶H薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
氯仿-正己烷-甲酸(50∶20∶5)硅胶G薄层板 |
对照品展开至前沿 |
二氯甲烷-甲醇(5∶2)硅胶G薄层板 |
对照品展开至前沿 |
醋酸乙酯-正己烷-丙酮(5∶3∶5)硅胶H薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
苯-甲酸乙酯-甲酸(60∶10∶2)硅胶G薄层板 |
对照品未分开,阴性有干扰 |
甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)硅胶GF254薄层板 |
分离清晰,Rf值适中阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以硅胶GF254薄层板为固定相,以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂,在此条件下,丹酚酸B或其镁盐的Rf值适中,和其它斑点分离清晰,阴性无干扰。
实验例6杏丹注射剂中丹酚酸B或其镁盐的液相色谱鉴别方法:
为了突出丹参的特征,除了薄层鉴别方法以外,选择了丹酚酸B或其镁盐作为其特征成分,但是由于药材中存在较多与丹酚酸B或其镁盐结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对丹酚酸B或其镁盐进行了分离:
条件 |
问题 |
甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钠(40∶60)十八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠(30∶70)十八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
甲醇-0.05mol/L磷酸氢二钠(25∶75)八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾(30∶70)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
乙腈-0.005mol/L磷酸氢二钠(20∶80)八烷基硅烷键合硅胶 |
峰有分叉, |
乙腈-四氢呋喃-1%冰醋酸(25∶10∶65)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
甲醇:5%冰醋酸水溶液(35∶65)十八烷基硅烷键合硅胶 |
保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,甲醇∶5%冰醋酸水溶液(35∶65)为流动相,在此条件下,丹酚酸B或其镁盐保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰。
实验例7杏丹注射剂中丹参素钠、原儿茶醛的薄层色谱鉴别方法:
为了突出丹参的特征,选择了丹参素钠、原儿茶醛作为其特征斑点,但是由于药材中存在较多与丹参素钠、原儿茶醛结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对麦冬进行了展开:
条件 |
问题 |
环己烷-氯仿-甲醇(5∶3∶5)硅胶G薄层板 |
对照品展开至前沿 |
正己烷-醋酸乙酯-甲醇(5∶3∶4)硅胶H薄层板 |
对照品展开至前沿 |
二甲苯-甲酸乙酯(3∶2)硅胶GF254薄层板 |
阴性有干扰 |
正己烷-醋酸乙酯-甲酸(2∶1∶1)硅胶G薄层板 |
阴性有干扰 |
甲苯-醋酸乙酯-丙酮(6∶4∶1)硅胶H薄层板 |
阴性有干扰 |
苯-甲酸乙酯(10∶9)硅胶H薄层板 |
阴性有干扰 |
苯-醋酸乙酯-甲酸(8∶7∶2)硅胶GF254薄层板 |
分离清晰,Rf值适中阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以硅胶GF254薄层板为固定相,以苯-醋酸乙酯-甲酸(8∶7∶2)为展开剂,在此条件下,丹参素钠、原儿茶醛的Rf值适中,和其它斑点分离清晰,阴性无干扰。
实验例8杏丹注射剂中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别方法
为了突出丹参的特征,除了薄层鉴别方法以外,选择了丹参素、原儿茶醛作为其特征成分,但是由于药材中存在较多与丹参素、原儿茶醛结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对丹参素、原儿茶醛进行了分离:
条件 |
问题 |
甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(20∶80)十八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠(15∶85)十八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
甲醇-0.05mol/L磷酸氢二钠(17∶83)八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
甲醇-0.05mol/L磷酸氢二钠(14∶86)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
乙腈-四氢呋喃-1%冰醋酸水溶液(12∶4∶84)八烷基硅烷键合硅胶 |
峰有分叉 |
乙腈-四氢呋喃-0.5%磷酸酸水溶液(15∶5∶80)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
甲醇-1%冰醋酸水溶液(13∶87)十八烷基硅烷键合硅胶 |
保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,甲醇-1%冰醋酸水溶液(13∶87)为流动相,在此条件下,丹参素、原儿茶醛保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰。
实验例9杏丹注射剂中银杏叶提取物的薄层色谱鉴别方法:
为了突出黄酮醇苷的特征,选择了银杏叶对照提取物作为其特征斑点,但是由于杏丹注射剂中存在较多与黄酮醇苷类成分结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下薄层板和展开条件针对黄酮醇苷类成分进行了展开:
条件 |
问题 |
三氯甲烷-丙酮-甲醇(7-6-5)硅胶G薄层板 |
对照品展开至前沿 |
甲酸乙酯-丁酮-甲醇(7-6-5)硅胶GF254薄层板 |
对照品展开至前沿 |
甲酸乙酯-丁酮-甲酸(7-2-2)硅胶H薄层板 |
阴性有干扰 |
醋酸乙酯-丁酮-甲醇(7-1-2)硅胶G薄层板 |
阴性有干扰 |
醋酸乙酯-丁酮-甲酸(7-1-2)硅胶H薄层板 |
阴性有干扰 |
醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5-3-4-0.5))硅胶GF254薄层板 |
对照品展开至前沿 |
醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5-3-1-1)含0.4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板 |
分离清晰,Rf值适中阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以含0.4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板为固定相,以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(6-1.5-1.5-0.5)为展开剂,在此条件下,黄酮醇苷类成分的Rf值适中,和其它斑点分离清晰,阴性无干扰。
实验例10杏丹注射剂中黄酮醇苷的液相色谱鉴别方法:
为了突出银杏叶的特征,除了薄层鉴别方法以外,选择了槲皮素、山奈素、异鼠李素作为其特征成分,但是由于杏丹注射剂水解后中存在较多与槲皮素、山奈素、异鼠李素结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对槲皮素、山奈素、异鼠李素进行了分离:
条件 |
问题 |
甲醇-水(90∶10)八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠(50∶50)十八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
乙腈-甲醇-0.005mol/L磷酸氢二钠(25∶15∶60)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
乙腈-甲醇-2%甲酸水溶液(20∶10∶70)十八烷基硅烷键合硅胶 |
峰形不太对称 |
甲醇-四氢呋喃-1%冰醋酸水溶液(25∶10∶65)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
乙腈-四氢呋喃-1%甲酸水溶液(30∶10∶60)十八烷基硅烷键合硅胶 |
峰形不太对称 |
甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45)十八烷基硅烷键合硅胶 |
保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45)为流动相,在此条件下,槲皮素、山奈素、异鼠李素保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰。
实验例11杏丹注射剂中萜类内酯的薄层色谱鉴别方法:
为了突出萜类内酯的特征,选择了白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C作为其特征斑点,但是由于杏丹注射剂中存在较多与白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下薄层板和展开条件针对白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C类成分进行了展开:
条件 |
问题 |
甲苯-甲酸乙酯-甲醇(8-4-7)硅胶G薄层板 |
对照品展开至前沿 |
苯-内酮-甲醇(5-2-5)硅胶GF254薄层板 |
对照品展开至前沿 |
甲苯-醋酸乙酯-甲酸(2-5-5)硅胶H薄层板 |
阴性有干扰 |
苯-丁酮-甲醇(6-3-4)硅胶G薄层板 |
阴性有干扰 |
醋酸乙酯-丙酮-甲酸(8-2-1)硅胶H薄层板 |
阴性有干扰 |
醋酸乙酯-丙酮-甲醇-水(4-2-8-0.5)硅胶GF254薄层板 |
对照品展开至前沿 |
甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10-5-5-0.6)含0.4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板 |
分离清晰,Rf值适中阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以含0.4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板为固定相,以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10-5-5-0.6)为展开剂,在此条件下,白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的Rf值适中,和其它斑点分离清晰,阴性无干扰。
实验例12杏丹注射剂中萜类内酯的液相色谱鉴别方法:
为了突出银杏叶的特征,除了薄层鉴别方法以外,选择了白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C作为其特征成分,但是由于杏丹注射剂后中存在较多与白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C结构相近、极性相似的成分,普通条件难以达到质量控制的要求,因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C进行了分离:
条件 |
问题 |
乙腈-0.2%磷酸水溶液(50∶50)八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
乙腈-0.02mol/L磷酸氢二钠(50∶50)十八烷基硅烷键合硅胶 |
出峰时间过快 |
乙腈-甲醇-0.002mol/L磷酸氢二钠(25∶15∶60)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
乙腈-甲醇-0.5%甲酸水溶液(30∶5∶65)十八烷基硅烷键合硅胶 |
峰形不太对称 |
甲醇-0.5%冰醋酸水溶液(25∶75)十八烷基硅烷键合硅胶 |
阴性有干扰 |
乙腈-0.5%甲酸水溶液(30∶70)十八烷基硅烷键合硅胶 |
峰形不太对称 |
甲醇-四氢呋喃-水(25∶10-65)十八烷基硅烷键合硅胶 |
保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰 |
经过筛选,确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45)为流动相,在此条件下,白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C保留时间适中,峰行尖锐,对称,阴性无干扰。
实验例13杏丹注射剂中黄酮醇苷的含量测定方法
仪器与试药
(1)主要仪器:
高效液相色谱仪 P-426 Alltech
蒸发光散射检测器 2000ES Alltech
高效液相色谱仪 1100series Agilent
超声波清洗机 KQ250B 昆山市超声仪器有限公司
电热真空干燥箱 ZK-30ABX 北京中兴伟业仪器公司
电子分析天平 AE240 Mettler
(2)试药:槲皮素:中国药品生物制品检定所
山奈素:中国药品生物制品检定所
异鼠李素:中国药品生物制品检定所
所用甲醇、乙腈均为色谱纯,均购于天津四友生物医学技术开发公司
水为重蒸水,其它试剂均为分析纯。
1检测波长的选择 经对槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品溶液(流动相为溶媒)分别在200~600nm范围内作扫描曲线,得到三者在360nm附近有最大吸收波长,故选用360nm作为本品的检测波长。
2色谱条件
色谱柱:Dikma C18 5μm,4.6×250mm
流动相:甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)
检测波长:360nm
流速:1.0ml/min
柱温:35℃
根据上述条件得到槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品、混合对照品、供试品、阴性色谱图;槲皮素、山奈素、异鼠李素峰均达到基线分离,与相近峰分离清晰完全,保留时间适中,峰形尖锐,对称,山奈素峰与异鼠李素峰的分离度大于1.5,理论板数按槲皮素峰计算大于2500,阴性无干扰。
4对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥器减压干燥过夜的槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量,分别加甲醇制成每1ml分别含0.03mg、0.03mg、0.02mg的溶液,即得。
5供试品溶液的制备 取装量差异项下本品5瓶,取内容物,研细,从中精密称取约1.0g,加甲醇-25%盐酸=4∶1的混合溶液25ml,置水浴中加热回流30分钟,迅速冷却至室温,转移至50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
6测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,分别计算槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量,按下式换算成总黄酮醇苷的含量。
总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51
7线性关系考察 精密量取槲皮素(0.3544mg/ml)、山奈素(0.2544mg/ml)、异鼠李素(0.0756mg/ml)对照品溶液0.00ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.00ml,分置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别从中精密吸取10μl,注入液相色谱仪,以对照品量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标做图,分别绘制标准曲线。
槲皮素线性关系考察结果
编号 |
槲皮素(μg) |
峰面积 |
1 |
0 |
0 |
2 |
0.14176 |
452 |
3 |
0.28352 |
869.6 |
4 |
0.42528 |
1303.45 |
5 |
0.56704 |
1746.1 |
6 |
0.7088 |
2222.3 |
槲皮素回归方程:Y=3109.4X-3.0667;
槲皮素相关系数:γ=0.9996;
槲皮素在0.00000~0.7088μg范围内线性良好。
经计算,槲皮素的标准曲线过原点,因此选用外标一点法测定槲皮素的含量。
山奈素线性关系考察结果
编号 |
山奈素(μg) |
峰面积 |
1 |
0 |
0 |
2 |
0.10176 |
393.5 |
3 |
0.20352 |
732.2 |
4 |
0.30528 |
1105.5 |
5 |
0.40704 |
1486.5 |
6 |
0.5088 |
1882.25 |
山奈素回归方程:Y=3667.9X-0.2143;
山奈素相关系数:γ=0.9995;
山奈素在0.00000~0.5088μg范围内线性良好。
经计算,山奈素的标准曲线过原点,因此选用外标一点法测定山奈素的含量。
异鼠李素线性关系考察结果
编号 |
异鼠李素(μg) |
峰面积 |
1 |
0 |
0 |
2 |
0.03024 |
108.15 |
3 |
0.06048 |
204.3 |
4 |
0.09072 |
306.3 |
5 |
0.12096 |
415.65 |
6 |
0.15120 |
524.15 |
异鼠李素回归方程:Y=3444.1.7X-0.6167;
异鼠李素相关系数:γ=0.9996;
异鼠李素在0.00000~0.15120μg范围内线性良好
经计算,异鼠李素的标准曲线过原点,因此选用外标一点法测定异鼠李素的含量。
8精密度试验 精密吸取槲皮素、山奈素、异鼠李素混合对照品溶液(每1ml分别含槲皮素0.03084mg、山奈素0.03196mg、异鼠李素0.02204mg)10μl,注入液相色谱仪,重复进样5次,记录峰面积积分值。
槲皮素、山奈素、异鼠李素混合对照品精密度试验
试验次数 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
均值 |
RSD(%) |
槲皮素 |
930.657 |
964.639 |
937.014 |
934.643 |
920.105 |
937.412 |
1.76 |
山奈素 |
1101.522 |
1093.249 |
1092.055 |
1090.325 |
1077.400 |
1090.91 |
0.80 |
异鼠李素 |
751.215 |
748.816 |
751.111 |
748.810 |
742.353 |
748.461 |
0.48 |
结果表明,精密度良好。
9稳定性试验
9.1对照品溶液稳定性试验 精密吸取上述槲皮素、山奈素、异鼠李素混合对照品溶液(每1ml分别含槲皮素0.03084mg、山奈素0.03196mg、异鼠李素0.02204mg)10μl,分别于0、6、12、24、48小时注入液相色谱仪,测定,记录峰面积积分值。
槲皮素、山奈素、异鼠李素混合对照品稳定性试验
时间(h) |
0 |
6 |
12 |
24 |
48 |
均值 |
RSD(%) |
槲皮素 |
925.258 |
934.215 |
917.264 |
939.653 |
901.165 |
923.511 |
1.64 |
山奈素 |
1045.531 |
1035.249 |
1059.025 |
1058.325 |
1029.365 |
1045.499 |
1.28 |
异鼠李素 |
761.259 |
744.839 |
751.491 |
768.82 |
782.259 |
761.734 |
1.93 |
结果表明,对照品溶液在48小时内稳定性良好。
9.2供试品溶液稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μl,分别在0、6、12、24、48小时进样,测定,记录峰面积积分值。
供试品溶液稳定性试验
时间(h) |
0 |
6 |
12 |
24 |
48 |
均值 |
RSD(%) |
槲皮素(mg/瓶) |
1.165 |
1.177 |
1.186 |
1.166 |
1.160 |
1.171 |
0.90 |
山奈素(mg/瓶) |
0.7842 |
0.7917 |
0.7883 |
0.7764 |
0.7596 |
0.7804 |
1.64 |
异鼠李素(mg/瓶) |
0.2714 |
0.2781 |
0.2732 |
0.2701 |
0.2754 |
0.2736 |
1.17 |
总黄酮醇苷(mg/瓶) |
5.574 |
5.640 |
5.641 |
5.554 |
5.509 |
5.584 |
1.02 |
结果表明,供试品溶液在48小时内稳定性良好。
10重复性试验 取装量差异项下本品5瓶,取内容物,研细,从中精密称取约0.5g,按正文供试品溶液的制备和测定方法进行处理,分别从中精密吸取10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
重现性试验
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
均值 |
RSD(%) |
槲皮素(mg/瓶) |
1.159 |
1.201 |
1.184 |
1.173 |
1.165 |
1.176 |
1.41 |
山奈素(mg/瓶) |
0.7739 |
0.7811 |
0.7695 |
0.7712 |
0.7748 |
0.7741 |
0.57 |
异鼠李素(mg/瓶) |
0.2715 |
0.2781 |
0.2764 |
0.2735 |
0.2748 |
0.2749 |
0.93 |
总黄酮醇苷(mg/瓶) |
5.533 |
5.673 |
5.597 |
5.566 |
5.559 |
5.586 |
0.97 |
结果表明,重复性良好。
11加样回收率试验 取装量差异项下本品5瓶,取内容物,研细,从中精密称取约0.25g(共5份),分置具塞锥形瓶中,分别精密加入对照品溶液(每1ml各含槲皮素0.6104mg、山奈素0.3892mg、异鼠李素0.1396mg)1.00ml(各两份),加甲醇-25%盐酸=4∶1的混合溶液25ml,置水浴中加热回流30分钟,迅速冷却至室温,转移至50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
经测定已知药物组合物中槲皮素、山奈素及异鼠李素的含量分别是2.3748mg/g、1.5632mg/g、0.5551mg/g。
槲皮素加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
0.24935 |
0.5922 |
0.6104 |
1.188 |
97.59 |
2 |
0.25018 |
0.5941 |
0.6104 |
1.185 |
96.84 |
3 |
0.24887 |
0.5910 |
0.6104 |
1.191 |
98.31 |
4 |
0.25035 |
0.5945 |
0.6104 |
1.199 |
99.05 |
5 |
0.24471 |
0.5811 |
0.6104 |
1.169 |
96.28 |
槲皮素平均回收率=97.61%;RSD=1.14%
山奈素加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
0.24935 |
0.3898 |
0.3892 |
0.7745 |
98.85 |
2 |
0.25018 |
0.3911 |
0.3892 |
0.7711 |
97.64 |
3 |
0.24887 |
0.3890 |
0.3892 |
0.7744 |
99.01 |
4 |
0.25035 |
0.3913 |
0.3892 |
0.7707 |
97.46 |
5 |
0.24471 |
0.3825 |
0.3892 |
0.7640 |
98.01 |
山奈素平均回收率=98.19%;RSD=0.72%
异鼠李素加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
0.24935 |
0.1384 |
0.1396 |
0.2773 |
99.52 |
2 |
0.25018 |
0.1389 |
0.1396 |
0.2757 |
98.03 |
3 |
0.24887 |
0.1381 |
0.1396 |
0.2767 |
99.27 |
4 |
0.25035 |
0.1390 |
0.1396 |
0.2734 |
96.33 |
5 |
0.24471 |
0.1358 |
0.1396 |
0.2719 |
97.45 |
异鼠李素平均回收率=98.12%;RSD=1.34%
12样品中总黄酮醇苷测定 取中试样品三批,按正文所述方法处理。
三批中试样品总黄酮醇苷含量测定结果
批号 |
总黄酮醇苷含量(mg/瓶) |
1批 |
5.458 |
2批 |
5.122 |
3批 |
5.703 |
根据三批含量测定结果暂定,本品每瓶含总黄酮醇苷不得少于1.0mg(即每单位量不得少于2.0mg)。
实验例14杏丹注射剂中萜类内酯的含量测定方法
仪器与试药
(1)主要仪器:
高效液相色谱仪 P-426 Alltech
蒸发光散射检测器 2000ES Alltech
高效液相色谱仪 1100series Agilent
超声波清洗机 KQ250B 昆山市超声仪器有限公司
电热真空干燥箱 ZK-30ABX 北京中兴伟业仪器公司
电子分析天平 AE240 Mettler
(2)试药:白果内酯:中国药品生物制品检定所
银杏内酯A:中国药品生物制品检定所
银杏内酯B:中国药品生物制品检定所
银杏内酯C:中国药品生物制品检定所
所用甲醇、乙腈均为色谱纯,均购于天津四友生物医学技术开发公司
水为重蒸水,其它试剂均为分析纯。
1色谱条件
色谱柱:Platinum C18 4.6×250mm 5μm;
流动相:甲醇-四氢呋喃-水(25∶10∶65);
流速:1.0ml/min;
蒸发光检测器检测:漂移管温度:99℃,气流量:2.7L/min;
柱温:室温。
根据上述条件得到白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、混合对照品、供试品、阴性色谱图;白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C均达到基线分离,与相近峰分离清晰完全,保留时间适中,峰形尖锐,对称,理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。
2对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥器减压干燥24小时的白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品适量,加甲醇制成每1ml各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液,即得。
3供试品溶液的制备 取装量差异项下本品,取内容物,研细,从中精密称取约5g,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,精密称定重量,超声处理(功率250W,频率33KHz)20分钟,取出,放至室温,再精密称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液10ml,回收甲醇,残渣加水10ml,置水浴中温热使溶散,加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml),合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,再用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次20ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,挥干醋酸乙酯,残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。
4测定法 分别精密吸取对照品溶液4μl、8μl,供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量,即得。
5线性关系考察
银杏内酯C 精密吸取银杏内酯C(1.028mg/ml)对照品溶液2、4、8、12、16μl,注入液相色谱仪,以银杏内酯C的量(μg)的常用对数值为横坐标,峰面积的常用对数值为纵坐标做图,绘制标准曲线。
银杏内酯C线性关系
编号 |
银杏内酯C(μg) |
银杏内酯C常用对数值 |
峰面积 |
峰面积常用对数值 |
1 |
2.056 |
0.3130 |
2309474 |
6.3635 |
2 |
4.112 |
0.6141 |
4855023 |
6.6862 |
3 |
8.224 |
0.9151 |
10113402 |
7.0049 |
4 |
12.336 |
1.0912 |
15556342 |
7.1919 |
5 |
16.448 |
1.2161 |
21561218 |
7.3337 |
银杏内酯C回归方程:Y=1.0701X+6.028;
银杏内酯C相关系数:γ=0.9999;
银杏内酯C在0.2.056~16.448μg范围内线性良好。
白果内酯 精密吸取白果内酯(1.206mg/ml)对照品溶液2、4、8、12、16μl,注入液相色谱仪,以白果内酯的量(μg)的常用对数值为横坐标,峰面积的常用对数值为纵坐标做图,绘制标准曲线。
编号 |
白果内酯(μg) |
白果内酯常用对数值 |
峰面积 |
峰面积常用对数值 |
1 |
2.412 |
0.3824 |
2561533 |
6.4085 |
2 |
4.824 |
0.6834 |
6835284 |
6.8348 |
3 |
9.648 |
0.9844 |
16826740 |
7.2260 |
4 |
14.472 |
1.1605 |
29281950 |
7.4666 |
5 |
19.296 |
1.2855 |
43743655 |
7.6409 |
白果内酯回归方程:Y=1.356X+5.896;
白果内酯相关系数:γ=0.9998;
白果内酯在2.412~19.262μg范围内线性良好。
银杏内酯A 精密吸取银杏内酯A(0.971mg/ml)对照品溶液2、4、8、16、20μl,注入液相色谱仪,以银杏内酯A的量(μg)的常用对数值为横坐标,峰面积的常用对数值为纵坐标做图,绘制标准曲线。
银杏内酯A线性关系考察
编号 |
银杏内酯A(μg) |
银杏内酯A常用对数值 |
峰面积 |
峰面积常用对数值 |
1 |
1.942 |
0.2882 |
2156751 |
6.3338 |
2 |
3.884 |
0.5893 |
4557216 |
6.6587 |
3 |
7.768 |
0.8903 |
11324004 |
7.0540 |
4 |
15.536 |
1.1913 |
26557300 |
7.4242 |
5 |
19.420 |
1.2882 |
33436593 |
7.5242 |
银杏内酯A回归方程:Y=1.2107X+5.9708;
银杏内酯相关系数:γ=0.999;
银杏内酯在1.942~19.420μg范围内线性良好。
银杏内酯B 精密吸取银杏内酯B(0.772mg/ml)对照品溶液2、4、8、16、20μl,注入液相色谱仪,以银杏内酯B的量(μg)的常用对数值为横坐标,峰面积的常用对数值为纵坐标做图,绘制标准曲线。
银杏内酯B线性关系考察
编号 |
银杏内酯B(μg) |
银杏内酯B常用对数值 |
峰面积 |
峰面积常用对数值 |
1 |
1.544 |
0.1886 |
948782 |
5.9772 |
2 |
3.088 |
0.4897 |
1904570 |
6.2798 |
3 |
6.176 |
0.7907 |
5120472 |
6.7093 |
4 |
12.352 |
1.0917 |
12574768 |
7.0995 |
5 |
15.440 |
1.1886 |
16434849 |
7.2158 |
银杏内酯B回归方程:Y=1.266X+5.707;
相关系数:γ=0.999;
银杏内酯B在1.544~15.440μg范围内线性良好。
6精密度试验 精密吸取银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B混合对照品溶液(每1ml溶液分别含银杏内酯C0.32076mg、白果内酯0.67353mg、银杏内酯A0.51480mg、银杏内酯B0.59433mg)5μl,注入液相色谱仪,记录峰面积,连续进样5次。
对照品溶液精密度试验
试验次数 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
均值 |
RSD(%) |
银杏内酯C |
878895 |
877957 |
878682 |
879312 |
877787 |
878527 |
0.07 |
白果内酯峰 |
3981068 |
3990365 |
3979365 |
3986986 |
3986638 |
3984884 |
0.11 |
银杏内酯A |
1606964 |
1589254 |
1593375 |
1585086 |
1590904 |
1593117 |
0.52 |
银杏内酯B |
2609865 |
2618452 |
2619529 |
2613064 |
2620743 |
2616331 |
0.18 |
结果表明,精密度良好。
7稳定性试验
7.1对照品稳定性试验 精密吸取银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B混合对照品溶液(每1ml溶液分别含银杏内酯C0.32076mg、白果内酯0.67353mg、银杏内酯A0.51480mg、银杏内酯B0.59433mg)5μl,注入液相色谱仪,分别于0、6、12、24、48小时重复测定1次,记录峰面积积分值。
对照品溶液稳定性试验
时间(h) |
0 |
6 |
12 |
24 |
48 |
均值 |
RSD(%) |
银杏内酯C |
877895 |
878126 |
878549 |
878896 |
886954 |
880084 |
0.44 |
白果内酯 |
3969256 |
3998756 |
4109336 |
3995646 |
3959538 |
4006506 |
1.49 |
银杏内酯A |
1602364 |
1575962 |
1593026 |
1565987 |
1589521 |
1585372 |
0.91 |
银杏内酯B |
2605984 |
2652451 |
2599500 |
2603369 |
2620658 |
2616392 |
0.83 |
结果表明,对照品溶液在48小时内稳定性良好。
7.2供试品稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,分别在0、6、12、24、48小时重复测定1次,记录峰面积积分值。
供试品溶液稳定性试验结果表明,供试品溶液在48小时内稳定性良好。
编号 |
银杏内酯C(mg/瓶) |
白果内酯(mg/瓶) |
银杏内酯A(mg/瓶) |
银杏内酯B(mg/瓶) |
萜类内酯(mg/瓶)) |
1 |
0.3772 |
0.4991 |
0.3071 |
0.1266 |
1.310 |
2 |
0.3715 |
0.4947 |
0.3128 |
0.1258 |
1.305 |
3 |
0.3781 |
0.4958 |
0.3094 |
0.1261 |
1.309 |
4 |
0.3754 |
0.4963 |
0.3066 |
0.1257 |
1.304 |
5 |
0.3748 |
0.4885 |
0.3157 |
0.1263 |
1.305 |
均值 |
0.3754 |
0.4949 |
0.3103 |
0.1261 |
1.307 |
RSD(%) |
0.68 |
0.79 |
1.25 |
0.29 |
0.21 |
8重复性试验 取装量差异项下本品,取内容物,研细,从中精密称取约5g(共5份),按正文供试品溶液的制备和测定项下的方法进行处理,分别从中精密吸取10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
供试品重复性试验结果
编号 |
银杏内酯C(mg/瓶) |
白果内酯(mg/瓶) |
银杏内酯A(mg/瓶) |
银杏内酯B(mg/瓶) |
萜类内酯(mg/瓶)) |
1 |
0.3712 |
0.4964 |
0.3097 |
0.1237 |
1.301 |
2 |
0.3669 |
0.4876 |
0.3122 |
0.1252 |
1.292 |
3 |
0.3723 |
0.4908 |
0.3184 |
0.1229 |
1.304 |
4 |
0.3718 |
0.4853 |
0.3059 |
0.1231 |
1.286 |
5 |
0.3705 |
0.4921 |
0.3073 |
0.1228 |
1.293 |
均值 |
0.3705 |
0.4904 |
0.3107 |
0.1235 |
1.295 |
RSD(%) |
0.58 |
0.67 |
1.59 |
0.80 |
0.57 |
结果表明,重现性良好。
9加样回收率试验 取装量差异项下本品,取内容物,研细,从中精密称取约2.5g(共5份),分置具塞锥形瓶中,分别精密加入对照品溶液(每1ml各含银杏内酯C 1.762mg、白果内酯2.411mg、银杏内酯A1.346mg、银杏内酯B0.628mg)1ml(共5份),共置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,精密称定重量,超声处理(功率250W,频率33KHz)使溶解,取出,放至室温,再精密称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液10ml,回收甲醇,残渣加水10ml,置水浴中温热使溶散,加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml),合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,再用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次20ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,挥干醋酸乙酯,残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
经测定已知药物组合物中银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B的含量分别是0.7482mg/g、0.9903mg/g、0.6274mg/g、0.2494mg/g。
银杏内酯C加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
2.51184 |
1.879 |
1.762 |
3.5929 |
97.25 |
2 |
2.50473 |
1.874 |
1.762 |
3.6013 |
98.03 |
3 |
2.45277 |
1.835 |
1.762 |
3.5824 |
99.16 |
4 |
2.48506 |
1.859 |
1.762 |
3.5780 |
97.54 |
5 |
2.49513 |
1.867 |
1.762 |
3.6082 |
98.83 |
银杏内酯C平均回收率=98.16%;RSD=0.83%
白果内酯加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
2.51184 |
2.487 |
2.411 |
4.7999 |
95.91 |
2 |
2.50473 |
2.480 |
2.411 |
4.8126 |
96.73 |
3 |
2.45277 |
2.429 |
2.411 |
4.8123 |
98.85 |
4 |
2.48506 |
2.461 |
2.411 |
4.7791 |
96.15 |
5 |
2.49513 |
2.471 |
2.411 |
4.7787 |
95.72 |
白果内酯回收率=96.67%;RSD=1.32%
银杏内酯A加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
2.51184 |
1.576 |
1.346 |
2.8978 |
98.21 |
2 |
2.50473 |
1.571 |
1.346 |
2.8835 |
97.48 |
3 |
2.45277 |
1.539 |
1.346 |
2.8363 |
96.39 |
4 |
2.48506 |
1.559 |
1.346 |
2.8891 |
98.81 |
5 |
2.49513 |
1.565 |
1.346 |
2.8771 |
97.45 |
银杏内酯A回收率=97.67%;RSD=0.93%。
银杏内酯B加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
2.51184 |
0.626 |
0.628 |
1.2432 |
98.21 |
2 |
2.50473 |
0.625 |
0.628 |
1.2313 |
96.59 |
3 |
2.45277 |
0.612 |
0.628 |
1.2235 |
97.42 |
4 |
2.48506 |
0.620 |
0.628 |
1.2403 |
98.81 |
5 |
2.49513 |
0.622 |
0.628 |
1.2341 |
97.42 |
银杏内酯B回收率=97.69%;RSD=0.87%。
9三批样品萜类内酯含量测定 取中试样品三批,按正文所述方法处理,精密吸取10μl进样测定。
三批中试样品萜类内酯含量测定结果
批号 |
萜类内酯含量(mg/瓶) |
1批 |
1.425 |
2批 |
1.218 |
3批 |
1.506 |
根据三批含量测定结果暂定,本品每瓶含萜类内酯不得少于0.25mg(即每单位量含萜类内酯不少于0.5mg)。
实验例15杏丹注射剂中丹参素、原儿茶醛的含量测定方法
1、仪器、试剂
仪器:
SHIMADZU 10A 高效液相色谱仪
普析通 TU-1810SPC 紫外/可见分光光度仪
SARTORIUS BP211D 电子分析天平
KQ250DB 超声波清洗机
试剂:
甲醇 分析纯 北京市通广精细化工公司
冰醋酸 分析纯 北京化学试剂公司
纯净水 娃哈哈
2、色谱分析条件
色谱仪:SHIMADZU 10A HPLC
固定相:Kromasil-C18 250mm×4.6mm 5μm
流动相:甲醇-1%冰醋酸水溶液(13∶87)
流速:1ml/min
柱温:25℃
进样量:10μl
检测波长:280nm
3、系统适用性试验 根据上述仪器条件得到的丹参素钠、原儿茶醛对照品、样品色谱图,其理论板数以丹参素钠计算大于2500。样品中丹参素钠、原儿茶醛与相近峰分离清晰完全,分离度大于1.5。
4、阴性干扰试验 为考察其它药材是否干扰丹参素、原儿茶醛的测定,取阴性对照品(缺丹参)与供试品溶液同法制成阴性对照品溶液并测定。结果表明,阴性样品对丹参素钠、原儿茶醛的含量测定无干扰。
5、测定波长的选择 精密称取丹参素钠2.03mg、原儿茶醛1.86mg,分置100ml棕色量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,在200nm~400nm的波长范围内进行扫描。结果表明,丹参素钠、原儿茶醛均在280nm处有最大吸收,因此选择280nm作为测定丹参素钠、原儿茶醛含量的检测波长。
6、线性关系的考察 精密称取丹参素钠8.65mg,原儿茶醛4.02mg,共置10ml棕色量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,精密量取0.25、0.75、1.25、1.75、2.25ml,分置10ml棕色量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,分别从中精密吸取10μl,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定。分别以的量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标作图,绘制标准曲线。
丹参素钠
回归方程Y=7910186.8208X-4661.7000
决定系数γ=0.9999
丹参素钠在0.21625~1.94625μg范围内线性良好。
丹参素钠线性关系
编号 |
丹参素钠量(μg) |
峰面积 |
1 |
0.21625 |
166983 |
2 |
0.64875 |
509520.5 |
3 |
1.08125 |
844328.5 |
4 |
1.51375 |
1194569.5 |
5 |
1.94625 |
1533237.5 |
原儿茶醛
回归方程Y=2426365.1741X+2949.9000
决定系数γ=0.9999
原儿茶醛在0.1005~0.9045μg范围内线性良好。
原儿茶醛线性关系
编号 |
原儿茶醛量(μg) |
峰面积 |
1 |
0.1005 |
243789 |
2 |
0.3015 |
732048 |
3 |
0.5025 |
1228843 |
4 |
0.7035 |
1716004 |
5 |
0.9045 |
2190308 |
7、精密度和对照品溶液试验 精密称取丹参素钠8.58mg,原儿茶醛4.07mg,共置100ml棕色量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,精密吸取10μl,注入液相色谱仪,分别在0、2、6、10、24小时重复测定一次。
精密度和对照品溶液试验
时间(h) |
0 |
2 |
6 |
10 |
24 |
平均值 |
RSD(%) |
丹参素钠 |
668979 |
668960 |
667139 |
669452 |
673633 |
669633 |
0.36 |
原儿茶醛 |
996402 |
994317 |
996085 |
995589 |
993032 |
995085 |
0.14 |
结果表明,对照品溶液精密度良好,在24小时内稳定。
8、供试品溶液的稳定性试验 取装量差异项下本品5瓶,取内容物,混匀,从中精密称取70.29mg,置10ml量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,分别在0、2、6、10、24小时重复测定。
供试品稳定性试验
时间(h) |
0 |
2 |
6 |
10 |
24 |
均值 |
RSD(%) |
丹参素钠(mg/瓶) |
5.422 |
5.318 |
5.408 |
5.389 |
5.296 |
5.367 |
1.05 |
原儿茶醛(mg/瓶) |
2.518 |
2.533 |
2.524 |
2.509 |
2.556 |
2.528 |
0.71 |
合剂(mg/瓶) |
7.940 |
7.851 |
7.932 |
7.898 |
7.852 |
7.894 |
0.54 |
结果表明,供试品溶液在24小时内稳定性良好。
9、重复性试验 取装量差异项下本品5瓶,取内容物,混匀,从中取约70mg(5份),精密称定,置10ml量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
重复性试验
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
均值 |
RSD(%) |
丹参素(mg/瓶) |
5.369 |
5.422 |
5.507 |
5.534 |
5.521 |
5.471 |
1.31 |
原儿茶醛(mg/瓶) |
2.508 |
2.487 |
2.466 |
2.452 |
2.471 |
2.478 |
0.86 |
合剂(mg/瓶) |
7.877 |
7.909 |
7.973 |
7.986 |
7.998 |
7.949 |
0.66 |
结果表明,供试品重复性良好。
10、加样回收率试验 采用加样回收法,取装量差异项下本品5瓶,取内容物,混匀,从中取约35mg(5份),精密称定,分置10ml量瓶中;精密称取丹参素钠对照品3.96mg,原儿茶醛对照品1.78mg,精密称定,置10ml量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,精密量取1.0ml,分置上述10ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
杏丹注射剂中丹参素含量为11.05mg/g;
杏丹注射剂中原儿茶醛含量为5.004mg/g。
丹参素回收率
编号 |
称量(mg) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
34.52 |
0.381 |
0.396 |
0.7635 |
96.47 |
2 |
38.07 |
0.421 |
0.396 |
0.8120 |
98.83 |
3 |
35.29 |
0.390 |
0.396 |
0.7721 |
96.49 |
4 |
37.46 |
0.414 |
0.396 |
0.8001 |
97.51 |
5 |
35.78 |
0.395 |
0.396 |
0.7853 |
98.46 |
丹参素钠平均回收率=97.55% RSD=1.1296
原儿茶醛回收率
编号 |
称量(mg) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
34.52 |
0.173 |
0.178 |
0.3470 |
97.88 |
2 |
38.07 |
0.191 |
0.178 |
0.3618 |
96.23 |
3 |
35.29 |
0.177 |
0.178 |
0.3495 |
97.14 |
4 |
37.46 |
0.187 |
0.178 |
0.3638 |
99.07 |
5 |
35.78 |
0.179 |
0.178 |
0.3539 |
98.21 |
原儿茶醛平均回收率=97.71% RSD=1.10%
12、三批中试样品含量测定
批号 |
丹参素(mg/瓶) |
原儿茶醛(mg/瓶) |
合计(mg/瓶) |
1批 |
5.427 |
2.348 |
7.775 |
2批 |
5.601 |
2.557 |
8.158 |
3批 |
5.033 |
2.492 |
7.525 |
根据三批含量测定结果暂定,本品每瓶含丹参素不得少于0.75mg,含原儿茶醛不得少于0.325mg,合计不得少于1.075mg(即每单位量含丹参素不得少于1.5mg,含原儿茶醛不得少于0.65mg,合计不得少于2.15mg)。
实验例16杏丹注射剂中总酚的含量测定方法
1、仪器、试药
(1)仪器
普析通 TU-1810SPC 紫外/可见分光光度仪
SARTORIUS BP211D 电子分析天平
(2)试药
亚硝酸钠 分析纯 天津市化学试剂三厂
硝酸铝 分析纯 天津市化学试剂三厂
氢氧化钠 分析纯 天津市化学试剂三厂
纯净水 娃哈哈
2、检测波长的选择 精密称取原儿茶醛对照品9.35mg,置100ml量瓶中,加水适量超声处理(功率250W,频率33KHz)使溶解,取出,放至室温,加水至刻度,摇匀,精密量取3.0ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,放置15分钟,在700~400nm波长范围内进行扫描,结果表明,原儿茶醛在518nm处有最大吸收,空白无干扰,因此选择518nm为分光光度法测定杏丹注射剂中总酚的检测波长。
3、线性关系的考察 精密称取原儿茶醛对照品10.85mg,置100ml量瓶中,加水适量超声处理(功率250W,频率33KHZ)使溶解,取出,放至室温,加水至刻度,摇匀,精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,分置25ml量瓶中,各加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,放置15分钟,以随行溶剂为空白,照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A),在518nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标,浓度(μg/ml)为横坐标,绘制标准曲线。
回归方程Y=0.0266X+0.0078;
决定系数γ=0.9999;
原儿茶醛在4.34~21.70μg/ml范围线性良好。
原儿茶醛标准曲线测定数据
编号 |
原儿茶醛(μg/ml) |
吸收度 |
1 |
4.34 |
0.121 |
2 |
8.68 |
0.241 |
3 |
13.02 |
0.354 |
4 |
17.36 |
0.471 |
5 |
21.70 |
0.583 |
4、精密度和对照品溶液稳定性试验 精密称取原儿茶醛对照品10.04mg,置100ml量瓶中,加水适量超声处理(功率250W,频率33KHZ)使溶解,取出,放至室温,加水至刻度,摇匀,精密量取3.0ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,放置15分钟,照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB),以随行溶剂为空白,在518nm的波长处测定吸收度,分别在0、5、10、20、30分钟时重复测定一次。
原儿茶醛精密度和稳定性实验
时间(min) |
0 |
5 |
10 |
20 |
30 |
X平均 |
RSD% |
吸光度 |
0.335 |
0.333 |
0.330 |
0.331 |
0.330 |
0.332 |
0.65 |
结果表明,对照品溶液精密度良好,在30分钟内稳定。
5、供试品溶液的稳定性实验 取装量差异项下本品5瓶,取内容物,混匀,从中精密称取72.3mg,置10ml量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,精密量取1.0ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,放置15分钟,照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB),以随行溶剂为空白,在518nm的波长处测定吸收度,计算,即得,分别在0、5、10、20、30分钟时测定。
供试品溶液稳定性实验
时间(min) |
0 |
5 |
10 |
20 |
30 |
X平均 |
RSD% |
总酚(mg/瓶) |
22.58 |
21.85 |
22.13 |
22.03 |
21.62 |
22.04 |
1.62 |
结果表明,供试品溶液在30分钟内稳定。
6、重复性试验 取装量差异项下本品5瓶,取内容物,混匀,从中取约70mg(5份),精密称定,置10ml量瓶中,加水适量使溶解并定至刻度,摇匀,精密量取1.0ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,放置15分钟,照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB),以随行溶剂为空白,在518nm的波长处测定吸收度,计算,即得。
重复性实验
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
X平均 |
RSD% |
总酚(mg/瓶) |
21.96 |
22.08 |
22.42 |
21.79 |
21.84 |
22.02 |
1.14 |
7、回收率试验 采用加样回收法,取装量差异项下本品5瓶,取内容物,混匀,从中精密称取35mg(5份),精密称定,分置10ml量瓶中;精密量取原儿茶醛对照品溶液(1.533mg/ml)1ml(共5分),分置上述10ml量瓶中,加水适量超声处理(功率250W,频率33KHz)使溶解,取出,放至室温,加水定至刻度,摇匀,精密量取1.0ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,放置15分钟,照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB),以随行溶剂为空白,在518nm的波长处测定吸收度,计算,即得。
杏丹注射剂中总酚的含量:44.47mg/g
加样回收率实验
编号 |
供试品称量(mg) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测量值(mg) |
回收率(%) |
1 |
36.14 |
1.607 |
1.533 |
3.1250 |
99.01 |
2 |
37.08 |
1.649 |
1.533 |
3.1488 |
97.84 |
3 |
34.92 |
1.553 |
1.533 |
3.0683 |
98.85 |
4 |
36.67 |
1.631 |
1.533 |
3.1524 |
99.26 |
5 |
33.59 |
1.494 |
1.533 |
2.9729 |
96.49 |
平均回收率=98.29%RSD=1.16%
8、三批中试样品含量测定
批号 |
总酚(mg/瓶) |
1批 |
23.18 |
2批 |
22.43 |
3批 |
25.07 |
根据三批含量测定结果暂定,本品每瓶含总酚以原儿茶醛计不得少于4.25mg(即每单位量含总酚以原儿茶醛计不少于8.5mg)。
实验例17杏丹注射剂中丹酚酸B的含量测定方法
1仪器与试药
仪器:Agilent1100高效液相色谱仪,chemstationsys工作站;
TU-1800SPC紫外分光光度计。
试药:丹酚酸B:中国药品生物制品检定所;
试剂均为分析纯;
色谱用试剂为色谱纯。
2检测波长的选择 精密称取丹酚酸B对照品适量,加75%甲醇溶解,在190-400nm波长范围扫描。结果表明丹酚酸B在286nm处有最大吸收,因此选择286nm作为含量测定的检测波长。
3色谱条件
色谱柱:Dikma ODS(4.6mm×250mm,5μm);
流动相:甲醇-乙腈-1.7%甲酸水溶液30∶10∶60;
检测波长:286nm;
柱温:30℃;
流速:1.0ml/min。
4系统适用性试验
4.1对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量,加75%甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液,即得。
4.2供试品溶液的制备 取装量差异项下本品,取内容物,混匀,取约0.25g,精密称定,置10ml量瓶中,加水定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。
4.3阴性供试品溶液的制备 称取不含丹参的阴性样品,照供试品溶液的制备方法制备,作为阴性供试品溶液。
4.4测定法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,记录色谱图。
根据上述条件得到丹酚酸B对照品色谱图、供试品色谱图,其理论板数n均大于2000。供试品中丹酚酸B色谱峰与相近峰分离清晰完全,分离度均大于1.5,阴性无干扰。
5线性关系 精密称取丹酚酸B对照品适量,加75%甲醇制成每1ml中含2.688mg的对照品溶液,精密量取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分置10ml量瓶中,加75%甲醇至刻度,摇匀,配制成0.053760mg/ml、0.10752mg/ml、0.16128mg/ml、0.21504mg/ml、0.26880mg/ml的对照品溶液。分别从中精密吸取10μl,注入液相色谱仪,照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定,记录峰面积。以丹酚酸B的量(μg)为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
丹酚酸B线性关系
编号 |
峰面积 |
进样量(μg) |
1 |
648.56 |
0.5376 |
2 |
1256.16 |
1.0752 |
3 |
1880.45 |
1.6128 |
4 |
2545.65 |
2.1504 |
5 |
3183.45 |
2.6880 |
回归方程:Y=0.0008X+0.0046
相关系数:γ=0.9999
结果表明,丹酚酸B在0.5376μg~2.6880μg之间线性关系良好。
经过计算,丹酚酸B标准曲线为一过原点的直线,因此选择外标一点法测定杏丹注射剂中丹酚酸B的含量。
6精密度和对照品溶液稳定性试验 精密吸取丹酚酸B对照品溶液(0.1385mg/ml)10μl,注入液相色谱仪,记录峰面积,分别在0、2、4、6、10小时进样测定。
精密度和对照品溶液稳定性试验
时间(h) |
0 |
2 |
4 |
6 |
10 |
平均值 |
RSD(%) |
峰面积 |
1641.89 |
1648.19 |
1659.09 |
1672.85 |
1684.48 |
1661.30 |
1.05 |
结果表明,对照品溶液精密度良好,在10小时内稳定。
7供试品溶液稳定性试验 取装量差异项下本品,取内容物,混匀,精密称取0.25039g,置10ml量瓶中,按供试品溶液的制备和测定法项下操作,分别在0、1、2、3、4小时重复测定一次。
供试品溶液稳定性试验结果
时间(h) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
平均值 |
RSD(%) |
含量(mg/瓶) |
2.918 |
2.884 |
3.015 |
2.946 |
2.974 |
2.947 |
1.71 |
结果表明,供试品溶液在4小时内稳定性良好。
8重复性试验 取装量差异项下本品,取内容物,混匀,取约0.25g(共5份),精密称定,分置10ml量瓶中,按供试品溶液的制备和测定法项下操作,即得。
重现性试验
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均值 |
RSD(%) |
含量(mg/支) |
2.863 |
2.912 |
2.937 |
2.946 |
2.954 |
2.922 |
1.26 |
结果表明,重复性良好。
9加样回收率试验 取装量差异项下本品,取内容物,混匀,取约0.125g(共5份),分置10ml量瓶中;精密吸取丹酚酸B对照品溶液(1.193mg/ml)0.6ml(共6份),分置上述10ml量瓶中,加水定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,,注入液相色谱仪,测定,即得。
杏丹冻干粉针中丹酚酸B含量:5.901mg/g。
加样回收率试验
编号 |
供试品称量(g) |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测得量(mg) |
回收率(%) |
1 |
0.12287 |
0.7251 |
0.7158 |
1.4284 |
98.26 |
2 |
0.12093 |
0.7136 |
0.7158 |
1.4096 |
97.23 |
3 |
0.12556 |
0.7409 |
0.7158 |
1.4313 |
96.45 |
4 |
0.12395 |
0.7314 |
0.7158 |
1.4406 |
99.07 |
5 |
0.12814 |
0.7562 |
0.7158 |
1.4535 |
97.42 |
平均回收率=97.69%;RSD=1.03%
10样品含量测定
批号 |
丹酚酸B(mg/瓶) |
1批 |
2.843 |
2批 |
2.621 |
3批 |
2.905 |
根据三批样品含量测定结果暂定,本品每瓶含丹酚酸B不得少于0.4mg(即每单位量含丹酚酸B不少于0.8mg)。
实验例18杏丹注射剂中丹参酮IIA的含量测定方法
1仪器与试药
仪器:SHIMADZU LC-2010AHT;
TU-1800SPC紫外分光光度计。
试药:丹参酮IIA:中国药品生物制品检定所;
试剂均为分析纯;
色谱用试剂为色谱纯。
2检测波长的选择 精密称取丹参酮IIA对照品适量,加甲醇溶解,在190-400nm波长范围扫描。结果表明丹参酮IIA在270nm处有最大吸收,因此选择270nm作为含量测定的检测波长。
3色谱条件
色谱柱:Dikma ODS(4.6mm×250mm,5μm);
流动相:甲醇-1%冰醋酸水溶液75∶25;
检测波长:270nm;
柱温:30℃;
流速:1.0ml/min。
4系统适用性试验
4.1对照品溶液的制备 精密称取丹参酮IIA对照品适量,加甲醇制成每1ml含12.5μg的溶液,即得。
4.2供试品溶液的制备 精密吸取杏丹注射液5ml,置10ml量瓶中,加甲醇定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。
4.3阴性供试品溶液的制备 称取不含丹参的阴性样品,照供试品溶液的制备方法制备,作为阴性供试品溶液。
4.4测定法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各5μl,注入液相色谱仪,测定,记录色谱图。
根据上述条件得到丹参酮IIA对照品色谱图、供试品色谱图,其理论板数n均大于2000。供试品中丹参酮IIA色谱峰与相近峰分离清晰完全,分离度均大于1.5,阴性无干扰。
5线性关系 精密称取丹参酮IIA对照品适量,加甲醇制成每1ml中含0.4112mg的对照品溶液,精密量取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,配制成0.008224mg/ml、0.016448mg/ml、0.024672mg/ml、0.032896mg/ml、0.04112mg/ml的对照品溶液。分别从中精密吸取5μl,注入液相色谱仪,照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定,记录峰面积。以丹参酮IIA的量(μg)为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
丹参酮II
A线性关系
编号 |
峰面积 |
进样量(μg) |
1 |
292315 |
0.04112 |
2 |
589654 |
0.08225 |
3 |
874823 |
0.12336 |
4 |
1170013 |
0.16448 |
5 |
1465977 |
0.20560 |
回归方程:Y=0.000000-0.000025
相关系数:γ=0.9999
结果表明,丹参酮IIA在0.0411μg~0.2056μg之间线性关系良好。
6精密度和对照品溶液稳定性试验 精密吸取丹参酮IIA对照品溶液(0.02056mg/ml)5μl,注入液相色谱仪,记录峰面积,分别在0、2、4、10、24小时进样测定。
精密度和对照品溶液稳定性试验
时间(h) |
0 |
2 |
4 |
10 |
24 |
平均值 |
RSD(%) |
峰面积 |
792038 |
794412 |
790868 |
787546 |
784935 |
789959 |
0.47 |
结果表明,对照品溶液精密度良好,在10小时内稳定。
7供试品溶液稳定性试验 精密吸取杏丹注射液5ml,置10ml量瓶中,加甲醇定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得,分别在0、1、2、3、4小时重复测定一次。
供试品溶液稳定性试验结果
时间(h) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
平均值 |
RSD(%) |
含量(mg/支) |
0.2473 |
0.2461 |
0.2458 |
0.2442 |
0.2439 |
0.2455 |
0.57 |
结果表明,供试品溶液在4小时内稳定性良好。
8重复性试验 精密吸取杏丹注射液5ml(共5份),置10ml量瓶中,加甲醇定至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,精密吸取续滤液10μl,注入液相色谱仪,测定。
重现性试验
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均值 |
RSD(%) |
含量(mg/支) |
0.2457 |
0.2496 |
0.2473 |
0.2428 |
0.2404 |
0.2452 |
1.48 |
结果表明,重复性良好。
9加样回收率试验 精密量取本品2.5ml(共5份),分置10ml量瓶中;精密吸取丹参酮IIA对照品溶液(0.0632mg/ml)1ml(共6份),分置上述10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,测定,即得。
杏丹注射液中丹参酮IIA含量0.2452mg/支。
加样回收率试验
编号 |
供试品中纯品量(mg) |
纯品加入量(mg) |
测得量(mg) |
回收率(%) |
1 |
0.0613 |
0.0632 |
0.1229 |
97.42 |
2 |
0.0613 |
0.0632 |
0.1236 |
98.59 |
3 |
0.0613 |
0.0632 |
0.1228 |
97.37 |
4 |
0.0613 |
0.0632 |
0.1221 |
96.24 |
5 |
0.0613 |
0.0632 |
0.1233 |
98.15 |
平均回收率=97.55%;RSD=0.92%
10样品含量测定
批号 |
丹参酮IIA(mg/支) |
1批 |
0.2454 |
2批 |
0.2503 |
3批 |
0.2571 |
根据三批样品含量测定结果暂定,本品每瓶含丹参酮IIA不得少于0.025mg(即每单位量含丹参酮IIA不少于0.05mg)。
实验例19杏丹注射剂中白果酸限量的含量测定方法
1色谱条件 色谱柱:Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm ID,5μm)
流动相:甲醇-水-磷酸(900∶100∶2)
流速:1ml/min
检测波长:310nm
柱温:40℃
2对照品溶液制备 精密称取白果酸对照品适量,加甲醇溶解并稀释成不同浓度的对照品溶液:0.802μg/ml、3.208μg/ml、6.416μg/ml、9.624μg/ml、12.832μg/ml。
3供试品溶液制备
取装量差异项下本品,取内容物,混匀,取约3g,精密称定,于索氏提取器中,加石油醚提取6小时,石油醚提取液,回收溶媒,得石油醚浸膏。精密称取石油醚浸膏约10mg,甲醇溶解,定容至10ml,以0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
4标准曲线的制备 精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10μl,在上述HPLC条件下进样分析,记录AREA,并作直线回归处理得到回归方程为Y=0.0002X-0.3053,r=0.9998,表明在对照品质量8.02×10-3μg~128.32×10-3μg间与峰面积有良好的线性关系。
标准曲线制备
进样量(×10-3μg) |
8.02 |
32.08 |
64.16 |
96.24 |
128.32 |
峰面积 |
4597 |
13954 |
27541 |
40201 |
53251 |
5最低检出限量
将白果酸对照品溶液稀释成不同浓度的溶液,在上述HPLC条件下进样10μl,以S/N=3∶1为标准,测得最低检出限量为7.95×10-4μg。
6样品含量测定
批号 |
白果酸 |
1批 |
未检出 |
2批 |
未检出 |
3批 |
未检出 |
根据三批样品含量测定结果暂定,本品每瓶含白果酸不得高于百万分之五(即每单位量含白果酸不得高于百万分之十)。
具体实施方式
实施例1:采用液相色谱法测定杏丹冻干粉针中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:精密称取待测杏丹冻干粉针适量,加水制成每1ml含10mg的溶液,用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:精密称取丹参素钠对照品适量,加甲醇制成每1ml含15μg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料;流动相A为0.026%磷酸溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至30分钟,流动相B的比例由2%升至22%,从30分钟至60分钟,流动相B的比例由22%升至26%;流速为1.0ml/min,检测波长为280±2nm,柱温为30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有23个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,符合下列要求:
计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,为0.90~1.00。
实施例2:采用液相色谱法测定杏丹冻干粉针中以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:取待测杏丹冻干粉针1.5g,加水40ml溶解,加2%盐酸溶液5滴,用醋酸乙酯提取4次,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次20ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加丙酮适量使溶解并定量转移至5ml量瓶中,加丙酮至刻度,摇匀,滤过,滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:取银杏内酯A对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料:流动相A为甲醇-四氢呋喃(25∶10),流动相B为水,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至25分钟,流动相B的比例为65%,从25分钟至60分钟,流动相B的比例由65%降至35%,流速为0.8ml/min、蒸发光散射检测器检测,柱温30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有9个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,符合下列要求:
计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,为0.90~1.00。
实施例3:采用液相色谱法测定杏丹注射液中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:精密称取待测杏丹注射液适量,加水制成每1ml含10mg的溶液,用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:精密称取原儿茶醛适量,加水制成每1ml含15μg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料;流动相A为1%冰醋酸溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至30分钟,流动相B的比例由3%升至20%,从30分钟至75分钟,流动相B的比例由20%升至26%;流速为1.0ml/min,检测波长为280±2nm,柱温为30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有21个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,符合下列要求:
I.计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,为0.90~1.00;
II.待测杏丹注射剂指纹图谱中,非共有峰面积不超过总峰面积的5%;
III.待测杏丹注射剂指纹图谱中有10%~40%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较,其差值不大于±30%。
实施例4:采用液相色谱法测定杏丹注射液中以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:取待测杏丹注射液1.5g,加水40ml溶解,加5%盐酸溶液5滴,用正丁醇提取4次,合并提取液,用2%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用正丁醇10ml洗涤,合并正丁醇提取液及洗液,用水洗涤2次,每次20ml,合并水洗液,用正丁醇10ml洗涤,合并正丁醇液,回收正丁醇至干,残渣加甲醇适量使溶解并定量转移至5ml量瓶中,加丙酮至刻度,摇匀,滤过,滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:取白果内酯对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料:流动相A为乙腈-四氢呋喃(22∶13),流动相B为水,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至30分钟,流动相B的比例为68%,从30分钟至60分钟,流动相B的比例由68%降至36%,流速为0.9ml/min、蒸发光散射检测器检测,柱温30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有11个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射剂中以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,符合下列要求:
I.计算待测杏丹注射剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,为0.90~1.00;
II.待测杏丹注射剂指纹图谱中,非共有峰面积不超过总峰面积的5%;
III.待测杏丹注射剂指纹图谱中有30%~60%的共有峰面积的比值与标准指纹图谱中各共有峰面积的比值比较,其差值不大于±30%。
实施例5:采用液相色谱法测定杏丹葡萄糖输液剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:精密量取杏丹输液剂10ml,用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:精密称取丹酚酸B适量,加75%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料;流动相A为0.05%磷酸溶液,流动相B为甲醇,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至25分钟,流动相B的比例由5%升至30%,从25分钟至60分钟,流动相B的比例由25%升至35%;流速为1.0ml/min,检测波长为280±2nm,柱温为30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有20个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹输液剂中以丹参和银杏叶黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹输液剂指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,符合下列要求:
I.计算待测杏丹输液剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,为0.90~1.00;
II.待测杏丹输液剂指纹图谱中,非共有峰面积不超过总峰面积的5%。
实施例6:采用液相色谱法测定杏丹注射液中以银杏叶萜类内酯成分特征为主的指纹图谱:
(1)供试品溶液的制备:精密量取杏丹注射液30ml,加5%盐酸溶液5滴,用三氯甲烷提取4次,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用三氯甲烷提10ml洗涤,合并三氯甲烷提提取液及洗液,用水洗涤2次,每次20ml,合并水洗液,用三氯甲烷提10ml洗涤,合并三氯甲烷提液,回收三氯甲烷提至干,残渣加乙醇适量使溶解并定量转移至5ml量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀,滤过,滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(2)参照物溶液的制备:取银杏内酯B对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为参照物溶液;
(3)色谱条件:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料:流动相A为甲醇-四氢呋喃(25∶10),流动相B为水,梯度洗脱,溶剂比例为从0分钟至25分钟,流动相B的比例为65%,从25分钟至60分钟,流动相B的比例由65%降至35%,流速为0.8ml/min、蒸发光散射检测器检测,柱温30℃;
(4)标准指纹图谱的制定:以上述方法作为制定以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段;依据10批或10批以上供试品所测得的图谱,制定标准指纹图谱,以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准,计算其它共有色谱峰的相对保留时间,所述标准指纹图谱中,共有峰有7个;
(5)以(1)~(3)所述方法作为待测杏丹注射液中以银杏叶萜类内酯类成分特征为主的指纹图谱的测试手段,制备待测样品的指纹图谱;
(6)将待测杏丹注射液的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,符合下列要求:
I.计算待测杏丹注射液的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度,为0.90~1.00;
II.待测杏丹注射液指纹图谱中,非共有峰面积不超过总峰面积的5%。
实施例7:杏丹冻干粉针中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,加乙醚提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为供试品溶液;丹参对照药材溶液的制备:取丹参对照药材,加乙醚提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为对照药材溶液;对照品溶液的制备:取丹参酮IIA对照品,加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液,作为对照品溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯19∶1为展开剂,展开,取出,晾干,供试品色谱中,在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
实施例8:杏丹冻干粉针中丹参酮IIA的液相色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液75∶25为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例9:杏丹冻干粉针中丹酚酸B的薄层色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,加75%甲醇溶液溶解,作为供试品溶液;以丹酚酸B对照品的75%甲醇溶液为对照;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸2∶3∶4∶0.5∶2为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯254nm检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
实施例10:杏丹冻干粉针中丹酚酸B镁盐的液相色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;取丹酚酸B镁盐对照品的75%甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.7%甲酸水溶液30∶10∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例11:杏丹冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的薄层色色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另取丹参素钠和原儿茶醛对照品中,分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以苯-醋酸乙酯-甲酸8∶7∶2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以新鲜配制的2%三氯化铁与1%铁氰化钾等体积的混合液,在日光下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例12:杏丹冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液13∶87为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,柱温30℃,供试品色谱中,与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例13:杏丹冻干粉针中黄酮醇苷类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加正丁醇提取,提取液蒸干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;另取银杏叶对照提取物,同法制成对照提取物溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各3μl,分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水5∶3∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝乙醇溶液,置紫外光灯365nm检视,供试品色谱中,在与对照提取物相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例14:杏丹冻干粉针中黄酮醇苷类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加甲醇-25%盐酸=4∶1的混合溶液,加热回流30分钟,迅速冷却至室温,用甲醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,55%∶45%甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例15:杏丹冻干粉针中萜类内酯类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水溶解,加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的甲醇溶液为对照;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各15μl,分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上上,以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇10∶5∶5∶0.6为展开剂,10℃以下展开,取出,晾干,用醋酐蒸汽熏蒸15分钟,在140℃~160℃加热30分钟,取出,放冷,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点。
实施例16:杏丹冻干粉针中萜类内酯类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水溶解后加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,25%∶10%∶65%甲醇-四氢呋喃-水为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例17:杏丹注射液中丹参的薄层色谱鉴别:
取待测注射液适量,加三氯甲烷提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为供试品溶液;取丹参对照药材,加三氯甲烷提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为对照药材溶液,采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯19∶1为展开剂,展开,取出,晾干,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
实施例18:杏丹冻干粉针中丹参酮IIA的液相色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液70∶30为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例19:杏丹冻干粉针中丹酚酸B的薄层色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,加80%甲醇溶液溶解,作为供试品溶液;以丹酚酸B对照品的80%甲醇溶液为对照;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以苯-二氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸2∶3∶4∶0.5∶2为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯254nm检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
实施例20:杏丹注射液中丹酚酸B镁盐的液相色谱鉴别:
取待测注射液适量,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;取丹酚酸B镁盐对照品的80%甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.5%甲酸水溶液25∶15∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例21:杏丹冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的薄层色色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液;另取丹参素钠和原儿茶醛对照品,分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-甲酸乙酯-甲酸9∶6∶2.5为展开剂,展开,取出,晾干,喷以新鲜配制的2%三氯化铁与1%铁氰化钾等体积的混合液,在日光下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例22:杏丹冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液10∶90为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,柱温30℃,供试品色谱中,与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例23:杏丹冻干粉针中黄酮醇苷类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加醋酸乙酯提取,提取液蒸干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;另取银杏叶对照提取物,同法制成对照提取物溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各3μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以甲酸乙酯-丙酮-甲醇-水5∶5∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铝乙醇溶液,置紫外光灯365nm检视,供试品色谱中,在与对照提取物相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例24:杏丹冻干粉针中黄酮醇苷类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加甲醇-25%盐酸(4∶2)的混合溶液,加热回流20分钟,迅速冷却至室温,用甲醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的乙溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,50%∶50%乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例25:杏丹冻干粉针中萜类内酯类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水溶解,加5%盐酸溶液2滴,用正丁醇振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用正丁醇10ml洗涤。合并正丁醇提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋正丁醇10ml洗涤,合并正丁醇液,回收正丁醇至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的乙醇溶液为对照;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各15μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以苯-醋酸乙酯-丁酮-甲醇10∶5∶5∶2为展开剂,10℃以下展开,取出,晾干,用醋酐蒸汽熏蒸15分钟,在140℃~160℃加热30分钟,取出,放冷,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点。
实施例26:杏丹冻干粉针中萜类内酯类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水溶解,加5%盐酸溶液2滴,用正丁醇振摇提取4次,每次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用正丁醇10ml洗涤。合并正丁醇提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋正丁醇10ml洗涤,合并正丁醇液,回收正丁醇至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,20%∶13%∶67%乙腈-四氢呋喃-水为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例27:杏丹注射液中丹参、丹参酮IIA的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射液适量,加醋酸乙酯提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为供试品溶液;丹参对照药材溶液的制备:取丹参对照药材,加醋酸乙酯提取,滤过,滤液挥干,残渣加醋酸乙酯溶解,作为对照药材溶液;对照品溶液的制备:取丹参酮IIA对照品,加醋酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液,作为对照品溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以二甲苯-三氯甲烷19∶2为展开剂,展开,取出,晾干,供试品色谱中,在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
实施例28:杏丹注射液中丹参酮IIA的液相色谱鉴别:
取待测杏丹注射液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-0.1%磷酸水溶液75∶25为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例29:杏丹注射液中丹酚酸B镁盐的薄层色谱鉴别:
取待测杏丹注射液适量,挥干,残渣加甲醇溶液溶解,作为供试品溶液;以丹酚酸B镁盐对照品的甲醇溶液为对照;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以二甲苯一三氯甲烷-甲酸乙酯-丙酮-乙酸3∶3∶5∶4∶2为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯254nm检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
实施例30:杏丹注射液中丹酚酸B的液相色谱鉴别:
取待测杏丹注射液适量,置量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;取丹酚酸B对照品的乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.8%冰醋酸水溶液30∶10∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例31:杏丹注射液中丹参素、原儿茶醛的薄层色色谱鉴别:
取待测杏丹注射液适量,挥干,残渣用乙醇溶解并定至合适浓度,摇匀,作为供试品溶液;另取丹参素钠和原儿茶醛对照品,分别加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各5μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以甲苯-甲酸乙酯-甲酸9∶6∶2.5为展开剂,展开,取出,晾干,喷以新鲜配制的2%三氯化铁与1%铁氰化钾等体积的混合液,在日光下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例32:杏丹注射液中丹参素、原儿茶醛的液相色谱鉴别:
取待测杏丹注射液适量,置量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素钠、原儿茶醛对照品的乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-0.5%冰醋酸水溶液13∶87为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,柱温30℃,供试品色谱中,与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例33:杏丹注射液中黄酮醇苷类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射液适量,加正丁醇提取,提取液蒸干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;另取银杏叶对照提取物,同法制成对照提取物溶液;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各3μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯-丙酮-乙醇-水5∶4∶2∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%三氯化铝乙醇溶液,置紫外光灯365nm检视,供试品色谱中,在与对照提取物相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例34:杏丹注射液中黄酮醇苷类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射液适量,加乙醇-25%盐酸(4∶1)的混合溶液,加热回流30分钟,迅速冷却至室温,用乙醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,40%∶60%甲醇-1%冰醋酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例35:杏丹注射液中萜类内酯类成分的薄层色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射液适量,加1096盐酸溶液1滴,用三氯甲烷振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用10%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用三氯甲烷10ml洗涤。合并三氯甲烷提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用三氯甲烷10ml洗涤,合并三氯甲烷液,回收三氯甲烷至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的甲醇溶液为对照;采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验,吸取上述溶液各15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上上,以甲苯-甲酸乙酯-丁酮-甲醇10∶7∶4∶1为展开剂,10℃以下展开,取出,晾干,用醋酐蒸汽熏蒸15分钟,在140℃~160℃加热30分钟,取出,放冷,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点。
实施例36:杏丹注射液中萜类内酯类成分的液相色谱鉴别方法:
取待测杏丹注射液适量,加10%盐酸溶液1滴,用三氯甲烷振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用10%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用三氯甲烷10ml洗涤。合并三氯甲烷提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用三氯甲烷10ml洗涤,合并三氯甲烷液,回收三氯甲烷至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,21%∶13%∶66%乙腈-四氢呋喃-0.5%冰醋酸水溶液为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;供试品色谱中,具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例37:杏丹冻干粉针中丹参素、原儿茶醛的含量测定
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。以丹参素钠、原儿茶醛对照品的水溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液13∶87为流动相,检测波长为280nm,柱温30℃,以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,含量限度应为以下几项:
(1)每单位量含丹参素钠的限度不得少于3.0mg;
(2)每单位量含原儿茶醛的限度不得少于1.3mg;
(3)每单位量含丹参素钠和原儿茶醛的总和的限度不得少于4.3mg。
实施例38:杏丹冻干粉针中总酚含量测定:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水制成每1ml含2.5mg的溶液,摇匀,精密量取1ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,作为供试品溶液;以原儿茶醛作为对照品,同法制得对照品溶液;以随行溶剂为空白,照分光光度法,在518nm处测定吸收度,以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总酚的限度以原儿茶醛计,不得少于17.0mg。
实施例39:杏丹冻干粉针中丹酚酸B含量测定:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹酚酸B对照品的75%甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.7%甲酸水溶液30∶10∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹酚酸B或其镁盐的限度不得少于1.6mg。
实施例40:杏丹冻干粉针中丹参酮IIA的含量测定:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液75∶25为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.1mg。
实施例41:杏丹冻干粉针中黄酮醇苷类成分的含量测定方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加甲醇-25%盐酸=4∶1的混合溶液,加热回流30分钟,迅速冷却至室温,用甲醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,55%∶45%甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;以外标一点法进行计算含量后再由公式黄酮醇苷的含量%=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51,计算黄酮醇苷的含量,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总黄酮醇苷的限度不得少于4.0mg。
实施例42:杏丹冻干粉针中萜类内酯类成分的含量测定方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水溶解后加2%盐酸溶液2滴,用醋酸乙酯振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋酸乙酯10ml洗涤,合并醋酸乙酯液,回收醋酸乙酯至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,25%∶10%∶65%甲醇-四氢呋喃-水为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;以外标两点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含萜类内酯的限度不得少于1.0mg。
实施例43:杏丹冻干粉针中丹参素的含量测定方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素钠对照品的水溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液10∶90为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,柱温30℃,以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,含量限度应为:
每单位量含丹参素的限度不得少于1.5mg;
实施例44:杏丹冻干粉针中总酚含量测定方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水制成每1ml含2.5mg的溶液,摇匀,精密量取1ml,置25ml量瓶中,加水至10ml,加10%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液2ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,作为供试品溶液;以芦丁作为对照品,同法制得对照品溶液;以随行溶剂为空白,照分光光度法,在518nm处测定吸收度,以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总酚的限度以芦丁计,不得少于8.5mg。
实施例45:杏丹冻干粉针中丹酚酸B镁盐含量测定:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加水至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;取丹酚酸B镁盐对照品的80%甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.5%甲酸水溶液25∶15∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹酚酸B镁盐的限度不得少于0.8mg。
实施例46:杏丹冻干粉针中丹参酮IIA的含量测定:
取待测杏丹冻干粉针适量,置量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液70∶30为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.05mg。
实施例47:杏丹冻干粉针中黄酮醇苷类成分的含量测定方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加甲醇-25%盐酸(4∶2)的混合溶液,加热回流20分钟,迅速冷却至室温,用甲醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的乙溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,50∶50乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;以外标一点法进行计算含量后再由公式黄酮醇苷的含量%=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51,计算黄酮醇苷的含量,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总黄酮醇苷的限度不得少于2.0mg。
实施例48:杏丹冻干粉针中萜类内酯类成分的含量测定方法:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水溶解,加5%盐酸溶液2滴,用正丁醇振摇提取4次,每次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用5%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用正丁醇10ml洗涤。合并正丁醇提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用醋正丁醇10ml洗涤,合并正丁醇液,回收正丁醇至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,20∶13∶67乙腈-四氢呋喃-水为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;以外标两点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含萜类内酯的限度不得少于0.5mg。
实施例49:杏丹注射液中丹参素、原儿茶醛的含量测定方法:
取待测杏丹注射液适量,置量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以丹参素钠、原儿茶醛对照品的乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-0.5%冰醋酸水溶液13∶87为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为280nm,柱温30℃,以外标一点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,含量限度应为:
(1)每单位量含丹参素的限度不得少于3.0mg;
(2)每单位量含原儿茶醛的限度不得少于1.3mg;
(3)每单位量含丹参素钠和原儿茶醛的总和的限度不得少于4.3mg。
实施例50:杏丹注射液中总酚含量测定:
取待测杏丹注射液1ml,置20ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,精密量取1ml,置25ml量瓶中,加水至5ml,加5%亚硝酸钠溶液2ml,摇匀,放置6分钟,加5%硝酸铝溶液5ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,作为供试品溶液;以丹参素钠作为对照品,同法制得对照品溶液;以随行溶剂为空白,照分光光度法,在518nm处测定吸收度,以外标一点法进行计算,待测杏丹注射液以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总酚的限度以丹参素钠计,不得少于15.0mg。
实施例51:杏丹注射液中丹酚酸B镁盐含量测定:
取待测杏丹注射液适量,置量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;取丹酚酸B镁盐对照品的乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-乙腈-1.8%冰醋酸水溶液30∶10∶60为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为286nm,柱温25℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹注射液以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹酚酸B镁盐的限度不得少于2.4mg。
实施例52:杏丹注射液中丹参酮IIA的含量测定:
取待测杏丹注射液作为供试品溶液;以丹参酮IIA对照品的甲醇溶液为对照;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-0.1%磷酸水溶液75∶25为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为270nm,柱温为30℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹注射液以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含丹参酮IIA的限度不得少于0.2mg。
实施例53:杏丹注射液中黄酮醇苷类成分的含量测定方法:
取待测杏丹注射液适量,加乙醇-25%盐酸(4∶1)的混合溶液,加热回流30分钟,迅速冷却至室温,用乙醇稀释至合适浓度,滤过,取续滤液作为供试品溶液;以槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品的乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,40%∶60%甲醇-1%冰醋酸水溶液为流动相,检测波长为360nm,柱温30℃;以外标一点法进行计算含量后再由公式黄酮醇苷的含量%=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51,计算黄酮醇苷的含量,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总黄酮醇苷的限度不得少于4.0mg。
实施例54:杏丹注射液中萜类内酯类成分的含量测定方法:
取待测杏丹注射液适量,加10%盐酸溶液1滴,用三氯甲烷振摇提取4次15ml、10ml、10ml、10ml,合并提取液,用10%醋酸钠溶液20ml洗涤,分取醋酸钠液,用三氯甲烷10ml洗涤。合并三氯甲烷提取液及洗液,用水洗涤2次,每次10ml,合并水洗液,用三氯甲烷10ml洗涤,合并三氯甲烷液,回收三氯甲烷至干,残渣加甲醇溶解,作为供试品溶液;以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品中的的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用二烷基硅烷键合硅胶为填充剂,21%∶13%∶66%乙腈-四氢呋喃-0.5%冰醋酸水溶液为流动相,蒸发光散射检测器检测,柱温在30℃;以外标两点法进行计算,待测杏丹注射制剂以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含萜类内酯的限度不得少于1.0mg。
实施例55:杏丹冻干粉针中总酚含量测定:
取待测杏丹冻干粉针适量,加水制成每1ml含2.5mg的溶液,摇匀,精密量取1ml,置25ml量瓶中,加水至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml,摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠试液10ml,再加水至刻度,摇匀,作为供试品溶液;以丹酚酸B作为对照品,同法制得对照品溶液;以随行溶剂为空白,照分光光度法,在518nm处测定吸收度,以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总酚的限度以丹酚酸B计,不得少于8.5mg。
实施例56:杏丹冻干粉针中白果酸的含量测定:
取待测杏丹冻干粉针3g,置索氏提取器中,加石油醚提取6小时,滤过,回收溶媒,取浸膏约10mg,精密称定,用甲醇溶解并定至10ml,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果酸对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%磷酸水溶液90∶10为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温40℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含白果酸的含量限度不得高于百万分之五;
实施例57:杏丹冻干粉针中总银杏酸的含量测定:
取待测杏丹冻干粉针3g,加石油醚60~90℃回流提取2小时,滤过,滤液回收至干,残渣用甲醇2ml溶解,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果新酸对照品的甲醇溶液为对照;以总银杏酸对照品的甲醇溶液为定位用对照溶液;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-1%冰醋酸水溶液90∶10为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温30℃;计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积,以白果新酸对照品用外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总银杏酸的限度不得高于百万分之十。
实施例58:杏丹冻干粉针中白果酸的含量测定:
取待测杏丹冻干粉针3g,置索氏提取器中,加乙醚提取6小时,滤过,回收溶媒,取浸膏约10mg,精密称定,用乙醇溶解并定至10ml,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果酸对照品的乙醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-0.5%磷酸水溶液70∶30为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温35℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含白果酸的限度不得高于百万分之十;
实施例59:杏丹冻干粉针中总银杏酸的含量测定:
取待测杏丹冻干粉针3g,加石油醚(30~60℃)回流提取3小时,滤过,滤液回收至干,残渣用甲醇2ml溶解,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果新酸对照品的乙醇溶液为对照;以总银杏酸对照品的乙醇溶液为定位用对照溶液;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液75∶25为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温30℃;计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积,以银杏酸白果新酸对照品以外标一点法进行计算,待测杏丹冻干粉针以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总银杏酸的限度不得高于百万分之二十。
实施例60:杏丹注射液中白果酸的含量测定:
取杏丹注射液60ml,置索氏提取器中,加三氯甲烷提取4小时,滤过,回收溶媒,取浸膏约10mg,精密称定,用乙醇溶解并定至10ml,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果酸对照品的甲醇溶液为对照,采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-0.5%甲酸水溶液92∶8为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温35℃;以外标一点法进行计算,待测杏丹注射液以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含白果酸的限度不得高于百万分之二;
实施例61:杏丹注射液中总银杏酸的含量测定:
取杏丹注射液60ml,加三氯甲烷回流提取1.5小时,滤过,滤液回收至干,残渣用甲醇2ml溶解,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;以白果新酸对照品的甲醇溶液为对照;以总银杏酸对照品的甲醇或乙醇溶液为定位用对照溶液;采用液相色谱法,色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-0.3%磷酸水溶液90∶10为流动相,流速为1ml/min,检测波长为310nm,柱温30℃;计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积,以白果新酸对照品以外标一点法进行计算,待测杏丹注射液以相当于每日用成品量为单位量,每单位量含总银杏酸的限度不得高于百万分之十。