CN1726962A - 一种柘木及其制剂的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种柘木及其制剂的质量控制方法，包括其层析鉴别及显色方法、柘木中7－葡萄糖－山柰素的HPLC含量测定方法以及将样品中黄酮苷酸水解成苷元山柰素进而用HPLC法测定山柰素的含量方法。本质量控制方法不仅用于柘木药材，还适用于由单味柘木原料制成的中药制剂，包括柘木糖浆、柘木颗粒、柘木片、柘木胶囊及柘木注射剂等剂型，也可以是含柘木的中药复方制剂或中西药复方制剂。
Description
〔技术领域〕
本发明涉及一种柘木及其制剂的质量控制方法，该质量控制方法是针对柘木成份而制定的含量测定方法及其专属性较强的层析鉴别方法，适用于柘木药材的质量控制，也用于由单味柘木制成的糖浆剂、颗粒剂、片剂、胶囊、注射剂等剂型的质量控制，还可用于含柘木药材的复方制剂的质量控制，属中药领域。
〔背景技术〕
癌症是一种严重危害人类健康的疾病。在全球，癌症每年大约夺去600万人的生命，并有1000万人处于死亡的边缘。世界卫生组织预测：21世纪癌症将成为人类的“第一杀手”。自上世纪70年代以来，我国的癌症死亡率也一直呈持续增长趋势，环境污染、吸烟、过量饮酒、不良的饮食习惯、社会竞争激烈导致的心理负担加重及缺乏防癌的医疗常识，是导致癌症高发的主要原因。近年来，人类生存环境的恶化，臭氧层的破坏，水源、食品的污染更促使癌症发病率上升。
现代化学抗癌药物主要是抑制肿瘤生长的细胞毒类药物，多为对症治疗且副作用很大，大部分严重影响免疫和消化系统，目前还没有既能抑制肿瘤生长而对人体消化、免疫系统无副作用的安全性高、疗效高、可供长期服用的药物。而在中医理论指导下，发扬中医药传统优势，研究制剂稳定、用药安全、质量可控、疗效可靠、价格低廉的中药抗癌药具有重要意义。但是目前大多数中药的质量控制方法较落后，很多药材还没有定性、定量的质控方法，从而这些药物制成制剂的疗效难以控制而很不稳定。
中药柘木为桑科植物柘木的干燥根及茎枝，其制剂如糖浆剂、注射剂等具有抗肿瘤的功效，可用于食管癌、胃癌、贲门癌、肠癌等的治疗。现代研究表明，柘木的化学成分主要为黄酮类、杂氧蒽酮，其中黄酮类化合物被认为是具有抗肿瘤作用的成分【宋耐宝，杨学东等.柘木化学成分及药理活性研究现状.清华大学药物研究所，2005，27(3)：335～337】。但是对柘木药材及其制剂，至今没有很好的质量控制方法，其疗效也难以得到保证。因此通过建立其含量测定方法及其定性鉴别方法，使柘木从药材到制剂的质量得到控制，从而保证用药原料及制剂的均一性与有效性，确保制剂的药效。
〔发明内容〕
本发明的目的之一是提供一种柘木的质量控制方法，保证其临床用原料药材及饮片的质量；本发明的目的之二是提供一种或多种检测方法用于由单味柘木制成的柘木糖浆、柘木颗粒、柘木片、柘木胶囊、柘木注射剂等剂型的质量控制，该方法也可用于其复方制剂中柘木成分的质量控制。
本发明公开的柘木药材的质量控制方法为：(1)柘木的层析鉴别；(2)对其中含有的黄酮类成分7-葡萄糖-山柰素HPLC法测定了其含量；(3)针对其含有的黄酮苷类成分可酸水解生成苷元山柰素的原理，将样品水解后用HPLC法测定了山柰素的含量。
本发明公开的由柘木制成的制剂的质量控制方法为：(1)对柘木进行了专属性强的层析鉴别；(2)对其中含有的黄酮类成分7-葡萄糖-山柰素用HPLC法测定了其含量；(3)对其中含有的黄酮类成分水解生成山柰素再用HPLC法测定了山柰素的含量。
本发明提供了柘木药材及其制剂的含量测定，提高了药物的质量控制水平，保证了制剂均一性及有效性。
本发明所述柘木药材的质量控制方法如下：
(1)柘木中7-葡萄糖-山柰素的HPLC法测定：
对照品溶液的制备：精密称取7-葡萄糖-山柰素对照品适量，加甲醇制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取柘木药材粉末5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入80％乙醇50ml，称重，回流提取2小时，冷却，补足失重，摇匀，过滤，取续滤液，过膜，即得；
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
流动相为
甲醇 18体积
乙腈 12体积
0.05％三氟乙酸水溶液 70体积
检测波长为265nm；
理论板数按7-葡萄糖-山柰素峰计算应不低于3000。
流动相还可以为
甲醇 18体积
乙腈 12体积
0.1％冰醋酸水溶液 70体积
酸还可以是其它有机酸或弱无机酸如磷酸及其缓冲液。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
(2)柘木中山柰素的HPLC法测定：
对照品溶液的制备：精密称取于60℃减压干燥至恒重的山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取粉碎后的柘木药材5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入80％的乙醇50ml，称重，回流提取2小时，快速冷却，补足失重，摇匀，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％乙醇定容至刻度，摇匀，过膜，即得。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速1.0ml/min；
柱温30℃；
流动相为
甲醇 58体积
0.05％三氟乙酸水溶液 42体积
检测波长360nm；
理论板数按山柰素计算应不低于3000。
流动相还可以为
乙腈 35体积
0.05％三氟乙酸水溶液 65体积
流动相还可以为
甲醇 30体积
乙腈 18体积
0.05％三氟乙酸水溶液 52体积
酸还可以是其它有机酸或弱无机酸如磷酸及其缓冲液。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本发明所述的由柘木制成制剂的质量控制方法如下：
(1)柘木制剂的鉴别方法：
取柘木制剂6g或6ml，加热水50ml搅拌溶解，放冷，滤过，滤液置分液漏斗中，加乙醚振摇萃取2次，每次40ml，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；另取柘木对照药材粉末10g，加入40％乙醇30ml，加热回流30min，滤过，滤液置分液漏斗中，加乙醚20ml，振摇萃取，取乙醚液水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VI B)试验，吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以环己烷∶氯仿∶乙酸乙酯(4∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯为(365nm)下检视。供试品色谱中，二个荧光斑点中，其中一个与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)柘木制剂中山柰素的HPLC法测定：
对照品溶液的制备取于60℃减压干燥至恒重的山柰素对照品适量，精密称定，甲醇配置成每1ml含10μg的溶液；
供试品溶液的制备取柘木制剂细粉或溶液适量，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀，过滤，精密量取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％甲醇定容至刻度，摇匀，取样过膜，即得；
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速1.0ml/min；
柱温30℃；
流动相为
甲醇 58体积
0.05％三氟乙酸水溶液 42体积
检测波长360nm；
理论板数按山柰素计算应不低于3000。
流动相还可以为
乙腈 35体积
0.05％三氟乙酸水溶液 65体积
流动相还可以为
甲醇 30体积
乙腈 18体积
0.05％三氟乙酸水溶液 52体积
酸还可以是其它有机酸或弱无机酸如磷酸及其缓冲液。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
(3)柘木制剂中7-葡萄糖-山柰素的HPLC法测定：
对照品溶液的制备：精密称取7-葡萄糖-山柰素对照品适量，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取柘木制剂细粉或溶液适量，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得；
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
流动相为
甲醇 18体积
乙腈 12体积
0.05％三氟乙酸水溶液 70体积
检测波长为265nm；
理论板数按7-葡萄糖-山柰素峰计算应不低于3000。
流动相还可以为
甲醇 18体积
乙腈 12体积
0.1％冰醋酸水溶液 70体积
酸还可以是其它有机酸或弱无机酸如磷酸及其缓冲液。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
〔具体实施方式〕
实施例一 柘木糖浆的制备
取柘木4kg，切成小块，洗净，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮5小时，第二次加水7倍量，煎煮5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05(80-90℃)，静置24小时，取上清液减压浓缩至相对密度1.12(80-90℃)，加入蔗糖及苯甲酸钠0.3％，搅拌溶解，过滤，制成约1000ml，灭菌，分装，即得。
实施例二 柘木颗粒的制备
取柘木8kg，切成小块，洗净，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮5小时，第二次加水7倍量，煎煮5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05(80-90℃)，静置沉淀24小时，取上清液减压浓缩至相对密度为1.26-1.28(50℃)的稠膏，加入720g糊精及5g阿司帕坦，混匀，制粒，干燥，整粒，分装(12.5克/袋)，即得。
实施例三 柘木片的制备
取柘木8kg，切成小块，洗净，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮5小时，第二次加水7倍量，煎煮5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05(80-90℃)，静置沉淀24小时，取上清液减压浓缩至相对密度为1.08-1.10(50℃)的清膏，喷雾干燥，喷干粉加入微晶纤维素40g，羧甲基纤维素钠10g，搅匀，制粒，干燥(60℃)，压片，即得。
实施例四 柘木胶囊的制备
取柘木10kg，切成小块，洗净，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮5小时，第二次加水7倍量，煎煮5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05(80-90℃)，静置沉淀24小时，取上清液减压浓缩至相对密度为1.10-1.12(50℃)，喷雾干燥，得喷干粉，制粒，装入胶囊，即得。
实施例五 柘木注射液的制备
取柘木3kg，切成小块，洗净，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮5小时，第二次加水7倍量，煎煮5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05(80-90℃)，用乙醇沉淀3次，含醇量分别为65％、75％、85％，每次均滤过，滤液蒸去乙醇，加水稀释至每1ml相当于原生药3g，调节PH值至7，冷藏，滤取上清液，加活性炭煮沸，滤过，灌封，灭菌，即得。
实施例六 柘木的鉴别
【性状鉴别】本品呈不规则的块片状，大小厚薄不一。外皮橙黄色或橙红色，具多数纵皱纹，有的密布细小白色点状或横长的疤痕，栓皮菲薄，多成层状，极易脱落，脱落处显灰黄色或棕褐色。质坚硬，不易折断，切面淡黄色或淡黄棕色，皮部薄，纤维性；木部宽广，有小孔。气微，味淡。
【薄层鉴别】a.取柘木细粉5g加水50ml加热回流5小时，放冷，滤过，滤液加入5N盐酸液调节pH值至2，用乙酸乙酯25ml分2次抽提，合并提取液，置水浴上挥发，浓缩至体积2ml左右，在滤纸上点样，用醋酸∶水(15∶85)展开2小时，取出晾干，分别作如下试验：
在紫外灯下观察有黄色，蓝灰色，天蓝色三个明显斑点；
氨蒸气熏，在紫外灯下可见蓝灰色斑点转亮蓝绿色，黄色、天蓝色斑点增强；
喷1％三氯化铝乙醇溶液，在紫外灯下可见黄色斑点转亮黄绿色，蓝灰色斑点转黄绿色；
喷溴甲酚绿，出现黄色斑点，前缘变蓝；
喷1％盐酸香草醛试液可见红色斑点。
b.取药材粉末10g，加40％乙醇30ml，加热回流30min，滤过，滤液置分液漏斗中，加乙醚40ml，振摇萃取，取乙醚液水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液。另取柘木对照药材粉末10g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI B)试验，吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯(4∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯为(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例七 柘木中山柰素的含量测定
【含量测定】照高效液相色谱法(《中国药典》2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇：0.05％三氟乙酸水溶液(58∶42)(v/v)为流动相；检测波长为360nm。
对照品溶液的制备 取于60℃减压干燥至恒重的山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含2ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取粉碎后的柘木药材5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入80％的乙醇50ml，称重，回流提取2小时，快速冷却，补足失重，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％乙醇定容至刻度，取样，过膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品按干燥品计算，含山柰素(C15H10O6)计不得少于0.004％。
实施例八 药材样品液制备方法的优选
为了尽可能的提出柘木中以山柰素为苷元的黄酮苷类成分，对样品的提取方法进行了考察，此外还对提取液的酸水解方法进行了优选。
①提取溶剂的选择：
由于柘木为茎木类药材，不宜于超声提取，因此选用回流提取法进行提取。
柘木药材中主要含有黄酮类化合物的苷和苷元，该类成分具有中等的极性，能被一定浓度的醇溶液很好的提取出来，分别选择了40％、60％、80％、100％乙醇溶液进行回流提取，以提取液水解后的山柰素的峰面积和样品称重的比值(S/W)作为考察指标，优选较佳的提取溶剂。
取粉碎后的柘木药材四份，每份5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，按下表加入不同浓度的乙醇50ml，分别称重，回流提取2小时，快速冷却，补足失重，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表1 样品提取溶剂的实验结果
| 样品号 | 乙醇浓度(％) | 药材重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 1234 | 406080100 | 4.8525.0345.0155.026 | 73.581.382.577.3 | 15.1516.1516.4515.38 |
由上表可知，用80％乙醇提取的提取液酸水解后山柰素的含量较高，故选用80％乙醇溶液作为提取溶剂。
②提取体积的优选
取粉碎后的柘木药材三份，每份5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加入80％的乙醇30ml、50ml、70ml，分别称重，回流提取2小时，快速冷却，补足失重，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表2 样品提取体积的实验结果
| 样品号 | 提取体积(ml) | 药材重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 123 | 305070 | 5.0285.0784.812 | 74.185.581.1 | 14.7416.8416.85 |
由上表可知，提取体积为30ml时提取液水解后山柰素的含量较低，而提取体积大于50ml时，提取液水解后山柰素的含量较高且趋于稳定，提示50ml的提取体积已能将以山柰素为苷元的苷类成分提取完全，故提取体积选用50ml。
③回流提取时间的选择
取粉碎后的柘木药材三份，每份5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加入80％的乙醇50ml，称重，分别回流提取1小时、2小时、3小时，快速冷却，补足失重，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表3 样品回流提取时间的实验结果
| 样品号 | 提取时间(h) | 药材重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 123 | 123 | 5.0255.0475.016 | 79.785.384.7 | 15.8616.9016.89 |
由上表可知，提取时达到2小时以后，延长时间的提取液水解后山柰素的含量非常接近，因此，可认为回流提取2小时已能将药材中以山柰素为苷元的苷类成分较为完全地提取，故提取时间选用2小时。
小结：以上结果显示，5g的柘木药材加80％乙醇50ml，回流提取2小时即能将药材中以山柰素为苷元的黄酮苷类成分提取完全。
④酸水解中酸用量的优选
由于药材中含有的成分是以山柰素为苷元的苷类成分，因此，提取液需水解后，进行HPLC测定。选用了酸水解的方法，对酸用量及酸水解时间进行了考察。
取粉碎后的柘木药材，按优选的提取条件得提取液400ml，精密移取续滤液四份，每份25ml，分别加入25％盐酸8.0ml、9.0ml、10.0ml、11.0ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表4 酸用量的选择实验结果
| 样品号 | 加酸量(ml) | 峰面积(S) |
| 1234 | 8.09.010.011.0 | 73.682.485.384.5 |
由上表所测峰面积可知，在25ml续滤液中加酸量＜10.0ml，并未能使以山柰素为苷元的黄酮苷水解完全，而加酸量≥10.0ml时，所测的水解液中山柰素的峰面积趋于一致，说明加酸量≥10.0ml即能使山柰素为苷元的黄酮苷水解完全，因此，选择了加酸量为10.0ml进行酸水解。
⑤酸水解时间的选择
对水浴回流酸水解的时间进行了考察。精密移取续滤液25ml四份，分别加入25％盐酸10ml，水浴回流水解20min、30min、40min、50min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表5 酸水解时间选择的实验结果
| 样品号 | 水解时间(min) | 峰面积(S) |
| 1234 | 20304050 | 74.778.284.684.5 |
由上表所测峰面积可知，水浴回流酸水解40min，即能使以山柰素为苷元的黄酮苷水解完全，故水解时间选择40min。
小结：以上结果显示，用25ml提取液加入10ml 25％盐酸水浴回流水解40min能使柘木中以山柰素为苷元的黄酮苷水解完全。
⑥调整样品液酸浓度
由于酸水解后的样品液酸浓度较高，所以加入一定量的NaOH溶液调整样品液盐酸浓度，经考察，加入25％氢氧化钠8ml不仅能使样品液盐酸浓度大幅度降低，而且对山柰素的峰面积没有产生影响，因此，选择在酸水解后的样品液中加入25％氢氧化钠8ml以调节样品液盐酸浓度，以更好地保护仪器及色谱柱。
药材样品的制备方法为：取粉碎后的柘木药材5.0g，[同时另取粉碎后的柘木药材测定水分(《中国药典》2000年版一部附录IXH一法)]，精密称定，置圆底烧瓶中，加入80％的乙醇50ml，称重，回流提取2小时，快速冷却，补足失重，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，用80％乙醇定容至刻度，取样，过膜，即得。
实施例九 HPLC法测定柘木中山柰素的色谱条件优选
①仪器和试剂
Agilent1100液相色谱仪，VWD紫外检测器，甲醇、乙腈均为色谱纯(淮阴汉邦科技有限公司)，三氟乙酸为色谱纯(Tedia company)，水为亚沸蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
山柰素对照品由中国药品生物制品检定所提供(供含量测定用，批号为0861-200002)。
色谱柱：选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：淮阴汉邦科技有限公司，反相C18柱：Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)；中科院大连化学物理所，反相C18柱：KromasilC18(4.6×250mm，5μm)。结果显示，两根不同厂家的色谱柱均能达到良好分离，但以Lichrospher色谱柱更好。测定波长：根据紫外光谱，山柰素的最大吸收波长为360nm，故测定波长确定为360nm。
②流动相条件的选择
对HPLC法测定柘木中山柰素的流动相系统进行了选择，选择了以(1)甲醇∶水、(2)甲醇∶酸水、(3)乙腈∶酸水、(4)甲醇∶乙腈∶酸水系统，进行试验。
在(1)甲醇∶水系统试验时，进样前样品液为酸性时色谱峰稳定，分离度尚可，但如样品液近中性山柰素峰形较差。
在(2)甲醇∶酸水系统中，甲醇∶酸水的比例为58∶42至45∶55之间时能将样品中山柰素峰很好地分离，但甲醇∶酸水(58∶42)时出峰时间为10分钟左右，分析时间短且分离良好。
在(3)乙腈∶酸水系统中，乙腈∶酸水比例为35∶65至25∶75之间时能将样品中山柰素峰很好地分离，但乙腈∶酸水(35∶65)时出峰时间为10分钟左右，分析时间短且分离良好。
在(4)甲醇∶乙腈∶酸水系统中，甲醇∶乙腈∶酸水的比例为(30∶18∶52)时，山柰素峰很好地分离。
对不同的酸进行比较，选用了三氟乙酸、冰醋酸、磷酸及磷酸、磷酸二氢钠缓冲液进行了试验，结果表明，流动相控制其酸性pH值为2-5，如0.05％三氟乙酸水溶液、0.1％冰醋酸水溶液、0.05％磷酸水溶液以及0.05％磷酸加0.02％磷酸二氢钠水溶液均可将山柰素峰很好地分离。故酸可选用三氟乙酸、冰醋酸及其它有机酸或弱无机酸如磷酸及其缓冲液。
实施例十 药材样品检测色谱方法学研究
①线性关系的考察
山柰素的标准曲线绘制：精密称取于60℃干燥至恒重的山柰素对照品适量，制成山柰素标准贮备液(11.6μg/ml)。采用逐级稀释法再分别配成5.8μg/ml、2.9μg/ml、1.45μg/ml、0.725μg/ml的系列对照品液，分别吸取上述溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度(μg/ml)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：
y＝39.352x-4.775(R＝0.9999)
山柰素浓度在11.6-0.725μg/ml之间呈良好的线性关系。结果见表6。
表6 山柰素标准曲线
| 序号 | 山柰素(μg/ml) | 峰面积 | 峰面积平均值 |
| 12 | 0.725 | 24.624.3 | 24.5 |
| 34 | 1.45 | 51.652.2 | 51.9 |
| 56 | 2.9 | 106.7107.3 | 107.0 |
| 78 | 5.8 | 221.9230.8 | 226.4 |
| 910 | 11.6 | 450.0451.7 | 450.9 |
②重复性试验
同一批药材，按供试品溶液制备方法制备样品3份，依法测定，重复性结果山柰素的平均含量为0.00447％，RSD＝1.18％，见表7
表7 药材中山柰素的重复性试验结果
| 序号 | 称重(g) | 峰面积值 | 山柰素(％) | 平均含量(％) | RSD％ |
| 123456 | 4.5874.3854.984 | 76.875.872.873.181.481.8 | 0.004520.004460.004500.004510.004390.00441 | 0.00447 | 1.18 |
③加样回收率试验
精密称取已测定含量的药材各2.5g共6份，2份一组，各组分别加入了山柰素对照液(0.135mg/ml)0.8ml，1.0ml，1.2ml。依法测定，并计算山柰素平均回收率为100.8％，RSD＝1.66％。结果见下表8。
表8 制剂中的加样回收率试验结果
| 序号样品重g | 峰面积 | 平均面积 | 检出量mg | 样品含量mg | 加标量mg | 回收率％ | 平均值％ | RSD％ |
| 1 2.510 | 81.481.7 | 81.55 | 0.2194 | 0.1121 | 0.108 | 99.31 | 100.8 | 1.66 |
| 2 2.652 | 85.685.6 | 85.6 | 0.2297 | 0.1185 | 0.108 | 102.97 | ||
| 3 2.495 | 92.191.9 | 92.0 | 0.2459 | 0.1114 | 0.135 | 99.62 | ||
| 4 2.598 | 95.295.1 | 95.15 | 0.2539 | 0.1160 | 0.135 | 102.14 | ||
| 5 2.612 | 106106 | 106.0 | 0.2815 | 0.1167 | 0.162 | 101.75 | ||
| 6 2.504 | 102.3102.5 | 102.4 | 0.2723 | 0.1118 | 0.162 | 99.08 |
④药材含量测定
三批号(批号041101、041102、041103)药材，如法测定。测定结果见表9。
表9 柘木药材中山柰素的含量测定结果
| 批号 | 重量(g) | 峰面积(A) | 含量(％) | 平均含量(％) | 含水量(％) | 干燥品含量(％) |
| 041101041102041103 | 5.0235.0455.0125.0285.0365.004 | 82.486.099.0101.8104.8100.4 | 0.00440.00460.00540.00550.00560.0054 | 0.00450.00540.0055 | 8.737.638.38 | 0.00490.00580.0060 |
含量限度：本品按干燥品计算，含山柰素(C15H10O6)计不得少于0.004％。
实施例十一柘木中7-葡萄糖-山柰素的含量测定
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水溶液(18∶12∶70)(v/v)为流动相；检测波长为265nm。理论板数按7-葡萄糖-山柰素峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备取于60℃减压干燥至恒重的7-葡萄糖-山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含5ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备取粉碎后的柘木药材5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入80％的乙醇50ml，称重，回流提取2小时，快速冷却，补足失重，过滤，取续滤液，过膜，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品按干燥品计算，含7-葡萄糖-山柰素(C21H20O11)计不得少于0.006％。
实施例十二 柘木颗粒的定性鉴别
【鉴别】
(1)取本品粉末6g，加热水50ml搅拌溶解，放冷，滤过，滤液置分液漏斗中，加乙醚振摇萃取2次，每次40ml，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液。另取柘木对照药材粉末10g，加入40％乙醇30ml，加热回流30min，滤过，滤液置分液漏斗中，加乙醚20ml，振摇萃取，取乙醚液水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VI B)试验，吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以环己烷∶氯仿∶乙酸乙酯(4∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯为(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，有一个显相同颜色的荧光斑点。
(2)取本品粉末2g，加热水20ml搅拌溶解，放冷，滤过，滤液加入5N盐酸液调节pH值至2，用乙酸乙酯20ml分2次抽提，合并提取液，置水浴上挥发，浓缩至体积1ml左右，在圆形滤纸上点样，用醋酸∶水(15∶85)展开2小时，取出晾干，分别作如下试验：
①在紫外灯下观察有黄色，蓝灰色，天蓝色三个明显斑点。
②氨蒸气熏后，在紫外灯下可见蓝灰色斑点转亮蓝绿色，黄色，天蓝色斑点增强。
③喷1％三氯化铝乙醇液，在紫外灯下可见黄色斑点转亮黄绿色，蓝灰色斑点转黄绿色。
④喷溴甲酚绿，出现黄色斑点，前缘变蓝。
⑤喷1％盐酸香草醛试液可见红色斑点。
实施例十三 柘木颗粒中山柰素的含量测定
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶0.05％三氟乙酸水溶液(58∶42)(v/v)为流动相；检测波长为360nm。
对照品溶液的制备 取于60℃减压干燥至恒重的山柰素对照品适量，精密称定，甲醇配成每1ml含10ug。
供试品溶液的制备 取本内容物，研细，取粉末4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，精密量取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％甲醇定容至刻度，摇匀，取样过膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品每袋含柘木以山柰素(C15H10O6)计，不得少于2.5mg。
实施例十四 柘木颗粒样品制备方法的优选
为了尽可能的提出制剂中的以山柰素为苷元的苷类成分，对样品液的提取方法进行了考察，此外还对提取液的酸水解方法进行了优选。
①提取溶剂的选择：
本制剂中主要含有黄酮类化合物的苷和苷元，该类成分具有中等的极性，能被一定浓度的醇溶液很好的提取出来，分别选择了40％、60％、80％、100％甲醇进行超声提取，以提取液水解后的山柰素的峰面积和样品称重的比值(S/W)作为考察指标，优选较佳的提取溶剂。
取本品粉末四份，每份4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按下表加入不同浓度的甲醇50ml，分别称重，超声30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表10 样品提取溶剂的实验结果
| 样品号 | 甲醇浓度(％) | 颗粒重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 1234 | 406080100 | 4.1354.2204.0154.086 | 176.4186.9181.4177.1 | 42.6644.2945.1843.34 |
由上表可知，用80％甲醇提取的提取液酸水解后山柰素的含量较高，故选用80％甲醇溶液作为提取溶剂。
②提取体积的优选
取本品粉末三份，每份4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入80％的甲醇30ml、50ml、70ml，分别称重，超声30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，过滤，分别精密移取续滤液15ml、25ml、35ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表11 样品提取体积的实验结果
| 样品号 | 提取体积(ml) | 颗粒重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 123 | 305070 | 4.0284.0054.083 | 170.4179.5183.1 | 42.3044.8244.84 |
由上表可知，提取体积为30ml时提取液水解后山柰素的含量较低，而提取体积为50ml和70ml时，山柰素的含量较高，且含量非常接近。说明50ml的提取体积已能将成分提取完全，故提取体积选用50ml。
③超声提取时间的选择
取本品粉末三份，每份4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入80％的甲醇50ml，超声20min、30min、40min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表12 样品提取时间的实验结果
| 样品号 | 提取时间(min) | 颗粒重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 123 | 203040 | 4.0854.0164.082 | 178.8180.1183.3 | 43.7744.8544.90 |
由上表可知，提取时间≥30min时，提取液水解后山柰素的含量非常接近，因此，制剂中以山柰素为苷元的苷类成分较为完全地提取，故提取时间选用30min。
小结：以上结果显示，4g的制剂加80％甲醇50ml，超声提取30min，即能将制剂中以山柰素为苷元的黄酮苷类成分提取完全。
④酸水解中酸用量的优选
由于制剂中含有的成分是以山柰素为苷元的苷类成分，因此，提取液需水解后，进行HPLC测定。参考了银杏叶片的含量测定方法，选用了酸水解的方法，对酸用量及酸水解时间进行了考察。
取本品粉末，按优选的提取条件得提取液300ml，精密移取续滤液五份，每份25ml，分别加入25％盐酸7.0ml、8.0ml、9.0ml、10.0ml、11.0ml水浴回流水解40min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表13 酸用量的选择实验结果
| 样品号 | 加酸量(ml) | 峰面积(S) |
| 12345 | 7.08.09.010.011.0 | 137.9172.6177.9184.6185.0 |
由上表所测峰面积可知，在25ml续滤液中加酸量＜10.0ml，并未能使以山柰素为苷元的黄酮苷水解完全，而加酸量≥10.0ml时，所测的水解液中山柰素的峰面积趋于一致，说明加酸量≥10.0ml即能使山柰素为苷元的黄酮苷水解完全，因此，选择了加酸量为10.0ml进行酸水解。
⑤酸水解时间的选择
对水浴回流酸水解的时间进行了考察。精密移取续滤液25ml三份，分别加入25％盐酸10ml，水浴回流水解20min、40min、60min，快速冷却，定容至50ml，取样过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表14 酸水解时间选择的实验结果
| 样品号 | 水解时间(min) | 峰面积(S) |
| 123 | 204060 | 173.3184.6185.3 |
由上表所测峰面积可知，水浴回流酸水解40min，即能使以山柰素为苷元的黄酮苷水解完全。故水解时间选择40min。
小结：以上结果显示，用25ml提取液加入10ml 25％盐酸水浴回流水解40min能使制剂中以山柰素为苷元的黄酮苷水解完全。
⑥调整样品液酸浓度
由于酸水解后的样品液酸浓度较高，所以加入一定量的NaOH溶液调整样品液盐酸浓度，经考察，加入25％氢氧化钠8ml不仅能使样品液盐酸浓度大幅度降低，而且对山柰素的峰面积没有产生影响，因此，选择在酸水解后的样品液中加入25％氢氧化钠8ml以调节样品液盐酸浓度，以更好地保护仪器及色谱柱。
结论：柘木颗粒样品液的制备方法经优选后确定为：取本品装量差异项下内容物，研细，取粉末4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加80％甲醇50ml，称重，超声30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，精密量取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％甲醇定容至刻度，摇匀，取样过膜，即得。
实施例十五 柘木片中7-葡萄糖-山柰素的含量测定
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水溶液(18∶12∶70)(v/v)为流动相；检测波长为265nm。
对照品溶液的制备 取于60℃减压干燥至恒重的7-葡萄糖-山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取柘木片，研细，取粉末4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品每片含柘木以7-葡萄糖-山柰素(C21H20O11)计，不得少于0.8mg
实施例十六 HPLC法测定柘木片中7-葡萄糖-山柰素的色谱条件优选
①仪器和试剂
Agilent1100液相色谱仪，VWD紫外检测器，甲醇、乙腈均为色谱纯(淮阴汉邦科技有限公司)，三氟乙酸为色谱纯(Tedia company)，水为亚沸蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
7-葡萄糖-山柰素对照品由南京中医药大学植物药研究与新药开发中心自制。
色谱柱：选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：淮阴汉邦科技有限公司，反相C18柱：Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)；中科院大连化学物理所，反相C18柱：KromasilC18(4.6×250mm，5μm)。结果显示，两根不同厂家的色谱柱均能达到良好分离。
②流动相条件的选择
对HPLC法测定制剂中7-葡萄糖-山柰素的流动相系统进行了选择，选择了以(1)甲醇∶水、(2)甲醇∶酸水、(3)乙腈∶酸水、(4)甲醇∶乙腈：酸水系统，进行试验。
在(1)甲醇∶水、(2)甲醇∶酸系统、(3)乙腈∶酸水系统试验时，均不能将7-葡萄糖-山柰素的峰达到较好分离，前后有其它色谱峰干扰。
在(4)甲醇∶乙腈∶酸水系统中，甲醇∶乙腈∶酸水的比例为(18∶12∶70)时，可使7-葡萄糖-山柰素峰很好地分离，前后色谱峰没有干扰，见附图。
对不同的酸进行比较，选用了三氟乙酸、冰醋酸、磷酸及磷酸、磷酸二氢钠缓冲液进行了试验，结果表明，流动相控制其酸性pH值为2-5，如0.05％三氟乙酸水溶液、0.1％冰醋酸水溶液、0.05％磷酸水溶液以及0.05％磷酸加0.02％磷酸二氢钠水溶液均可将山柰素峰很好地分离。故酸可选用三氟乙酸、冰醋酸及其它有机酸或弱无机酸如磷酸及其缓冲液。
实施例十七 柘木片样品制备方法的优选
为了能够准确测定制剂中7-葡萄糖-山柰素的含量，对样品液的制备方法进行了考察。
①提取方式的选择：
对超声提取和回流提取进行了比较。以提取液中7-葡萄糖-山柰素的峰面积和样品称重的比值(S/W)作为考察指标，优选较佳的提取方式。
取本品，研细，称取二份，每份4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入60％甲醇50ml，分别称重，1#超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，2#回流提取30min，放冷，分别补足失重，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表13 提取溶剂的实验结果
| 样品号 | 提取方式 | 颗粒重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 12 | 超声提取回流提取 | 4.0184.042 | 304312 | 76.4177.19 |
由上表可知，回流提取与超声提取效果椄近，但超声提取较为方便，故选用超声提取。
②提取溶剂的选择：
本制剂中含有的7-葡萄糖-山柰素为黄酮苷类化合物，该类成分具有中等的极性，能被一定浓度的醇溶液很好的提取出来，选择了40％、60％、80％、100％甲醇进行超声提取，以提取液中7-葡萄糖-山柰素的峰面积和样品称重的比值(S/W)作为考察指标，优选较佳的提取溶剂。
取本品，研细，称取四份，每份4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，按下表加入不同浓度的甲醇50ml，分别称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表14 样品提取溶剂的实验结果
| 样品号 | 甲醇浓度(％) | 颗粒重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 1234 | 406080100 | 4.0254.1504.0724.138 | 298314315305 | 74.0475.6677.3673.71 |
由上表可知，用80％甲醇提取的提取液中7-葡萄糖-山柰素的含量较高，故选用80％甲醇溶液作为提取溶剂。
②提取体积的优选
取本品粉末三份，每份4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入80％的甲醇30ml、50ml、70ml，分别称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表11 样品提取体积的实验结果
| 样品号 | 提取体积(ml) | 颗粒重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 123 | 305070 | 4.1184.0544.106 | 304320322 | 73.8278.9378.42 |
由上表可知，提取体积为30ml时提取液水解后7-葡萄糖-山柰素的含量较低，而提取体积为50ml和70ml时，7-葡萄糖-山柰素的含量较高，且含量非常接近。说明50ml的提取体积已能将成分提取完全，故提取体积选用50ml。
③超声提取时间的选择
取本品粉末三份，每份4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入80％的甲醇50ml，超声20min、30min、40min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得。样品液HPLC分析，计算，结果见下表。
表12 样品提取时间的实验结果
| 样品号 | 提取时间(min) | 颗粒重量(g) | 峰面积(S) | S/W |
| 123 | 203040 | 4.1184.0544.106 | 304320324 | 73.8278.9378.91 |
由上表可知，提取时间≥30min时，提取液水解后7-葡萄糖-山柰素的含量非常接近，因此制剂中以7-葡萄糖-山柰素为苷元的苷类成分较为完全地提取，故提取时间选用30min。
小结：以上结果显示，4g的制剂加80％甲醇50ml，超声提取30min，即能将制剂中7-葡萄糖-山柰素成分提取完全。
实施例十八 柘木胶囊中山柰素的含量测定
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈∶0.1％冰醋酸水溶液(35∶65)(v/v)为流动相；检测波长为360nm。
对照品溶液的制备 取于60℃减压干燥至恒重的山柰素对照品适量，精密称定，甲醇配置成每1ml含10ug。
供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，取粉末4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，精密量取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％甲醇定容至刻度，摇匀，取样过膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品每粒含柘木以山柰素(C15H10O6)计，不得少于0.5mg。
实施例十九 柘木注射液中7-葡萄糖-山柰素的含量测定
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水溶液(18∶12∶70)(v/v)为流动相；检测波长为265nm。理论板数按7-葡萄糖-山柰素峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 取于60℃减压干燥至恒重的7-葡萄糖-山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备：精密量取柘木注射液10ml，置50ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品每10ml含柘木以7-葡萄糖-山柰素(C21H20O11)计，不得少于1.2mg。
实施例二十 柘木注射液中山柰素的含量测定
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水溶液(30∶18∶52)(v/v)为流动相；检测波长为360nm。
对照品溶液的制备 取于60℃减压干燥至恒重的7-葡萄糖-山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10ug的溶液，即得。
供试品溶液的制备：精密量取柘木注射液10ml，置50ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品每10ml含柘木以7-葡萄糖-山柰素(C21H20O11)计，不得少于0.8mg。
实施例二十一 复方人参柘木颗粒中山柰素的含量测定
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶0.05％三氟乙酸水溶液(58∶42)(v/v)为流动相；检测波长为360nm。
对照品溶液的制备 取于60℃减压干燥至恒重的山柰素对照品适量，精密称定，甲醇配置成每1ml中含山柰素10ug。
供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，取粉末6.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，精密量取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％甲醇定容至刻度，摇匀，取样过膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
本品每袋含柘木以山柰素(C15H10O6)计，不得少于2.5mg。
说明书附图说明
图1 山柰素对照品对照品图，流动相为甲醇∶0.05％三氟乙酸水(58∶42)
图2 柘木药材山柰素含测图，流动相为甲醇∶0.05％三氟乙酸水(58∶42)
图3 柘木颗粒山柰素含测图，流动相为甲醇∶0.05％三氟乙酸水(58∶42)
图4 复方人参柘木颗粒山柰素含测图，流动相为甲醇∶0.05％三氟乙酸水(58∶42)
图5 7-葡萄糖-山柰素对照品图，流动相为甲醇∶水(40∶60)
图6 柘木药材中7-葡萄糖-山柰素含测图，流动相为甲醇∶水(40∶60)
图7 7-葡萄糖-山柰素对照品图，流动相为甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水(18∶12∶70)
图8 柘木片7-葡萄糖-山柰素含测图，流动相为甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水(18∶12∶70)
图9 柘木药材7-葡萄糖-山柰素含测图，流动相为甲醇∶乙腈∶0.05％三氟乙酸水(18∶12∶70)
Claims (11)
1.本发明涉及“一种柘木及其制剂的质量控制方法”，该质量控制方法的特征是针对柘木成份制定的柘木药材及其制剂的含量测定及层析鉴别。
2.权利要求1所述的柘木制剂，是由柘木单味原料制成的中药制剂，包括柘木糖浆、柘木颗粒、柘木片、柘木胶囊及柘木注射剂等剂型。
3.权利要求1所述的柘木制剂，是含柘木的中药复方制剂或中西药复方制剂，包括糖浆、颗粒、片、胶囊及注射剂等剂型。
4.根据权利要求1所述的柘木含量测定，其特征在于将样品中黄酮苷水解成苷元山柰素，再用HPLC法测定山柰素含量，方法是：
对照品溶液的制备：取干燥至恒重的山柰素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取粉碎后的柘木药材5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入80％的乙醇50ml，称重，回流提取2小时，快速冷却，补足失重，摇匀，过滤，精密移取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％乙醇定容至刻度，摇匀，取样，过膜，即得；
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：360nm；
以体积比为58∶42的甲醇-酸水为流动相；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
5.根据权利要求1所述的柘木的含量测定，其特征在于其中的7-葡萄糖-山柰素含量测定方法是：
对照品溶液的制备：精密称取7-葡萄糖-山柰素对照品适量，加甲醇制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取粉碎后的柘木药材5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入80％的乙醇50ml，称重，回流提取2小时，冷却，补足失重，过滤，取续滤液，过膜，即得；
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：265nm；
体积比为18∶12∶70的甲醇-乙腈-酸水为流动相；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
6.根据权利要求1所述的柘木制剂的含量测定，其特征在于其中的山柰素含量测定方法是：
对照品溶液的制备取干燥至恒重的山柰素对照品适量，精密称定，甲醇配成每1ml中含山柰素10μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取柘木制剂细粉或溶液适量，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，精密量取续滤液25ml，加入25％盐酸10ml水浴回流水解40min，快速冷却，转移至50ml量瓶中，加入25％氢氧化钠8ml，80％甲醇定容至刻度，摇匀，取样过膜，即得；
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：360nm；
以体积比为58∶42的甲醇-酸水为流动相；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
7.根据权利要求1所述的柘木制剂的含量测定，其特征在于其中的7-葡萄糖-山奈素含量测定方法是：
对照品溶液的制备：精密称取7-葡萄糖-山柰素对照品适量，加甲醇制成每1ml中含10μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取柘木制剂细粉或溶液适量，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入80％甲醇50ml，称重，超声提取30min(超声功率为250w，频率为50KHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，取续滤液，过膜，即得；
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：265nm；
以体积比为18∶12∶70的甲醇-乙腈-酸水为流动相；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算，即得。
8.根据权利要求4、6的所述的含量测定方法，其特征在于：流动相是以体积比为35∶65的乙腈-酸水或体积比30∶18∶52的甲醇-乙腈-酸水。
9.根据权利要求4-8的所述的含量测定方法，其特征在于：其酸水为冰醋酸水溶液、三氟乙酸水溶液或磷酸水溶液。
10.根据权利要求1所述的柘木的层析鉴别，其特征在于其鉴别方法是：
取柘木细粉5g，加水50ml加热回流5小时，放冷，滤过，滤液加入5N盐酸液调节pH值至2，用乙酸乙酯25ml分2次萃取，合并萃取液，置水浴上挥发，浓缩至体积2ml左右，在滤纸上点样，用醋酸∶水(15∶85)展开2小时，取出晾干，分别作如下试验：
在紫外灯下观察有黄色，蓝灰色，天蓝色三个明显斑点；
氨蒸气熏，在紫外灯下可见蓝灰色斑点转亮蓝绿色，黄色、天蓝色斑点增强；
喷1％三氯化铝乙醇溶液，在紫外灯下可见黄色斑点转亮黄绿色，蓝灰色斑点转黄绿色；
喷溴甲酚绿，出现黄色斑点，前缘变蓝；
喷1％盐酸香草醛试液可见红色斑点。
11.根据权利要求1所述的柘木制剂的层析鉴别，其特征在于其鉴别方法是：
a.柘木制剂的薄层层析鉴别
取柘木制剂6g或6ml，加热水50ml搅拌溶解，放冷，滤过，滤液置分液漏斗中，加乙醚振摇萃取2次，每次40ml，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；另取柘木对照药材粉末10g，加入40％乙醇30ml，加热回流30min，滤过，滤液置分液漏斗中，加乙醚20ml，振摇萃取，取乙醚液水浴蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VI B)试验，吸取上述二种溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以环己烷∶氯仿∶乙酸乙酯(4∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯为(365nm)下检视。供试品色谱的二个荧光斑点中，其中一个在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
b.柘木制剂的纸层析鉴别
取柘木制剂2g或2ml，加热水20ml搅拌溶解，放冷，滤过，滤液加入5N盐酸液调节pH值至2，用乙酸乙酯20ml分2次抽提，合并提取液，置水浴上挥发，浓缩至体积1ml左右，在圆形滤纸上点样，用醋酸∶水(15∶85)展开2小时，取出晾干，分别作如下试验：
在紫外灯下观察有黄色，蓝灰色，天蓝色三个明显斑点；
氨蒸气熏后，在紫外灯下可见蓝灰色斑点转亮蓝绿色，黄色，天蓝色斑点增强；
喷1％三氯化铝乙醇溶液，在紫外灯下可见黄色斑点转亮黄绿色，蓝灰色斑点转黄绿色；
喷溴甲酚绿，出现黄色斑点，前缘变蓝；
喷1％盐酸香草醛试液可见红色斑点。
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