CN1626228A - 六味地黄汤提取物,其药物组合物及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
六味地黄汤提取物,其包括以六味地黄汤提取物重量计,11.4-17重量%的多糖,和/或1.85-2.27%重量%的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)和/或23.5-35.5重量%的甘露三糖,其中六味地黄汤由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
Description
技术领域
本发明涉及六味地黄汤提取物(简称LW-ABC)、其提取方法、含有该提取物的药物组合物及其医药用途,所述医药用途包括治疗或辅助治疗疾病的用途,所涉及的疾病包括肿瘤、肿瘤化学或放射治疗的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染等;自身免疫病如系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力,及老年性疾病等患者所表现的免疫功能紊乱;以及伴有肾阴虚证生殖内分泌功能低下或紊乱疾病包括更年期综合征、卵巢功能低下、不孕症、习惯性流产、植物神经紊乱、黄褐斑、男性乳房发育、老年性性功能衰退、更年期骨质疏松,老年骨质疏松等。
技术背景
六味地黄汤是由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成,主要用于治疗腰膝酸软,头晕目眩,耳鸣耳聋,遗精,消渴,盗汗,骨蒸潮热,牙齿动摇,小便淋沥等肾阴不足之证,在中医临床中广为应用,并在长期的临床实践中得到不断发展,应用范围不断扩大。在现代临床医疗中仍被广泛应用于具有肾阴虚证表现的上百种疾病的治疗或辅助治疗,包括肿瘤、自身免疫病如系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎白细胞减少症支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血血小板减少性紫癜、重症肌无力,更年期综合征,前列腺肥大、不孕症、妊娠中毒症神经衰弱、帕金森氏综合征、高血压、冠心病、心率失常、肾盂肾炎、糖尿病等,获得了良好的治疗效果。但目前该方在实际应用中,无论作为汤剂、丸剂、胶囊剂或其它剂型,都存在明显不足,主要表现在以下几个方面:一是剂量大,用药不方便,难以作成方便使用的药物剂型;二是有效成分不明确,没有以有效成分作为质量控制指标,难以保证产品质量的稳定和可控;三是当各种原因导致药材中有效成分含量出现大的变化时,没有有效的手段保证产品中有效成分含量的稳定,从而无法保证临床用药的有效性。因此,改进传统的六味地黄汤,确定其有效成分及含量范围,从而制成有效成分稳定的六味地黄汤具有重要的现实意义。
发明内容
本发明人经研究,现已发现通过对传统六味地黄汤进行科学地处理,在保持原六味地黄汤各种药效的同时,可大大降低六味地黄汤使用时的体积,明显提高六味地黄汤中有效成分含量,确定六味地黄汤中有效成分的分布及含量,从而有效地保证六味地黄汤安全而有效地使用。本发明六味地黄汤提取物有良好的使用性,在常温下水中溶解度为≥1.5g/ml。
因此,本发明第一方面涉及六味地黄汤提取物,其包括以六味地黄汤提取物重量计,11.4-17重量%的多糖,和/或1.85-2.27%重量%的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)和/或23.5-35.5重量%的甘露三糖,其中六味地黄汤由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
本发明另一方面涉及药物组合物,其包括含有11.4-17重量%的多糖,和/或1.85-2.27%重量%的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)和/或23.5-35.5重量%的甘露三糖的六味地黄汤提取物及药用载体,其中六味地黄汤由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
本发明再一方面涉及六味地黄提取物的制备方法,其包括:
i)将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3组成的混合物用沸水蒸煮两次,然后浓缩至浸膏;
ii)伴随搅拌往浸膏中加入乙醇至乙醇浓度30%(v/v)放置,离心,冲洗,将上清液与洗液合并为上清液;
iii)浓缩上清液,伴随搅拌往浓缩液中加95%乙醇至乙醇浓度60%(v/v),放置,分离得部位A和上清液;
iv)将iii)中上清液进行柱层析,用水和极性有机溶剂洗脱,有机溶剂洗脱液浓缩后得部位B;
v)iv)中水洗脱液浓缩后上活性炭柱,用乙醇洗脱,乙醇洗脱液浓缩后得部位C;
vi)将iii)中部位A,iv)中部位B和v)中部位C混合。
根据本发明,六味地黄汤提取物可按下面工艺流程得到:
具体讲,按经典六味地黄汤各单味药的配比,组成生药。加沸水煎煮,过滤,得提取液。提取液浓缩至适当体积,加醇至终浓度30%,搅拌,放置过夜。离心处理(2500转/分),沉淀弃。上清液合并浓缩至适量,将醇浓度调节为60%,搅拌,放置,同法离心处理。沉淀同法再进行二次醇沉淀处理。所得沉淀用水溶解浓缩除醇后,冷冻干燥为部位A。三次上清液合并,旋转薄膜蒸发,除去醇,进行大孔吸附树脂柱层析,用水和极性有机溶剂依次洗脱,极性有机溶剂洗脱部位浓缩除去溶剂后冻干,为部位B。水洗脱部位浓缩后进行活性炭柱层析,用水和乙醇依次洗脱,醇洗脱部位浓缩除醇后冻干,为部位C。将A、B和C三个部位合并,即为六味地黄汤提取物LW-ABC。
上述LW-ABC制备方法中所用大孔吸附树脂为所有型号的弱极性大孔吸附树脂;两次醇沉淀所用醇为C1-4低级烷基醇(如:甲醇、乙醇等),浓度范围分别为10%-40%和50%-95%;大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为所有大孔树脂所能允许使用的极性有机溶剂(如:甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等),浓度范围为10%-95%。活性炭层析洗脱所用醇为甲醇和乙醇,洗脱浓度为20%-95%。
本发明还涉及六味地黄汤提取物在制备用于预防或治疗肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱的产品中用途,其中六味地黄汤提取物包括以六味地黄汤提取物重量计,11.4-17重量%的多糖,和/或1.85-2.27%重量%的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)和/或23.5-35.5重量%的甘露三糖,其中六味地黄汤由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
根据本发明,本发明六味地黄汤中总苷的含量是莫诺苷含量,马钱素含量和芍药苷的含量之和。
根据本发明,提取物A(部位A)是以含多糖为特征的六味地黄汤提取物。
根据本发明,提取物B(部位B)是以含苷类为特征的六味地黄汤提取物。
根据本发明,提取物C(部位C)是以含甘露三糖为特征的六味地黄汤提取物。
附图说明
图1-1为六味地黄汤提取物的总离子流批纹图谱
图1-2为六味地黄汤提取物的HPLC-DAD指纹图谱
图2为莫诺苷对照品色谱
图3为马钱素对照品色谱
图4为芍药苷对照品
图5为样品高效液相色谱
图6为样品总离子流色谱
图7为样品中莫诺苷负离子质谱图
图8为样品中马铁素负离子质谱图
图9为样品中芍药苷负离子质谱图
图10为苷露三糖标准品色谱图
图11为寡糖部分样品色谱图
图12为LW-ABC对SAMP8动情周期的影响
图13为LW-ABC对SAMP8血清雌二醇水平的影响
图14为LW-ABC对SAMP8垂体LH含量的影响
图15为LW-ABC对SAMP8下丘脑GnRH含量的影响
图16为LW-ABC对皮质酮处理(肾阴虚)小鼠卵巢重量的影响
图17为LW-ABC对皮质处理(肾阴虚)小鼠血清二醇水平的影响
图18为LW-ABC对皮质处理(肾阴虚)小鼠垂体LH含量的影响
根据本发明,本发明的六味地黄汤提取物按如下方法定性鉴别:
(1)α-萘酚反应(Molish反应)
六味地黄汤提取物以适量水溶解,加10%α-萘酚乙醇溶液三滴,然后沿试管壁缓缓加入浓硫酸,使形成上下两层,稍后在两层界面处可见紫色环,表示有寡糖、苷类和多糖类成分存在。
(2)以马钱素为代表的环烯醚萜甙的定性检查
六味地黄汤提取物以适量95%乙醇浸取,浸出液为待测液。以马钱素和莫诺甙的乙醇溶液作为对照品。待测液和对照液分别点样于硅胶G薄层板和硅胶G-0.3%CMC-Na薄层板上,分别以展开剂A(正丁醇/乙醇/水,15∶3∶3)和展开剂B(氯仿/甲醇,16∶4)展开,分别用10%香草醛溶液(后再喷72%的硫酸)和Godin试剂显色,分别在105℃和80-90℃烘5分钟,待测液和对照液具有相同的显色斑点。
(3)六味地黄汤提取物的HPLC指纹图谱:
液相色谱条件
Zorbax Eclipse XDB C-8柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相流速1.00ml/min,检测波长254nm,柱温7℃,CH3CN-H2O二元梯度洗脱(0min:2:98;50min:24:76,60min:56:44),进样量20μl,所有组分60min内洗脱完毕。
结果如图1-1,图1-2所示:
根据本发明,本发明的六味地黄汤提取物按如下方法定量鉴别:
一、提取物中苷类成分的含量测定
仪器与试剂
Agilent 1100高效液相系统,含四元梯度泵、DAD检测器、柱温箱和化学工作站。美国ABI公司API 3000液相色谱-质谱联用仪,配有Turbo Ionspray离子化源以及Analyst 1.1数据处理系统。
莫诺苷、马钱素对照品为本室自制,经光谱确定结构,HPLC面积归一化法测得纯度在98.0%以上。芍药苷对照品购自中国药品生物制品检定所。熟地、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮均购自北京同仁堂药材批发站。甲醇为色谱纯,水为去离子水。
实验方法
1.色谱条件:Diamonsil C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-水(33∶67),流速1.0mL.min-1,柱温30℃,DAD检测波长236nm,进样量20μL。理论塔板数按马钱素峰计算大于3000,在此条件下,莫诺苷、马钱素、芍药苷均能与其他组分达到良好的基线分离。
2.质谱条件:负离子检测,喷射电压为-4000V,DP电压-70V,FP电压-290V,TEM 300℃,NEB为8,CUR为11。
3.对照品溶液的制备:精密称取莫诺苷、马钱素、芍药苷对照品各10mg,置于10mL容量瓶内,用甲醇定容至刻度,摇匀。分别从中吸取75,100,150,300,600μL,加水稀释成10mL,制备成5份对照品溶液。
4.样品溶液的制备:取该提取物8.92g,加60%乙醇80毫升,充分搅拌,放置,离心处理(2500转/分,25min),沉淀再用60%乙醇沉淀,沉淀弃。合并两次上清液,经旋转薄膜蒸发,除去乙醇,进行大孔吸附树脂柱层析,用水和30%乙醇依次洗脱,30%乙醇洗脱部位浓缩除醇后冻干,为甙类部位。取适量加加水配成浓度为40mg/mL,共3份,过滤(0.45μm的滤膜)后按上述色谱条件进样,计算莫诺苷、马钱素、芍药苷的含量。
结果
在上述色谱条件下,分别对3个对照品进行HPLC-DAD和HPLC-MS分析。莫诺苷、马钱素、芍药苷保留时间分别为6.0,11.0,12.0min,电喷雾质谱检测确证质量数与计算值相符;再对样品进行HPLC-DAD和HPLC-MS分析,主要成分的色谱保留时间和质谱数据均与对照品相符,结果见图2-9。
结果莫落苷的标准曲线方程为A=2772.8C-13.28,r=0.9998,线性范围7.4~60mg.L-1;马钱素的标准曲线方程为A=2676.3C-4.14,r=0.9996,线性范围7.7~62mg.L-1;芍药苷的标准曲线方程为A=2541.3C-42.49,r=0.9991,线性范围8.5~68mg.L-1。
表1 六味地黄水煎液中莫诺苷、马钱素、芍药苷加样回收率试验结果
称样量 加入量 测得量 回收率 平均回收率
对照品
(g) (mg) (mg) (%) (%)
莫诺苷 0.2512 2.5 4.53 100.8 98.8
0.2508 2.6 4.68 102.8
0.2510 2.3 4.22 96.2
0.2506 2.2 4.10 95.2
0.2509 2.2 4.18 98.8
马钱素 0.2512 1.6 2.64 102.2 98.3
0.2508 1.3 2.26 96.7
0.2510 1.4 2.39 99.0
0.2506 1.2 2.15 95.7
0.2509 1.2 2.18 98.0
芍药苷 0.2512 1.5 2.69 98.9 99.6
0.2508 1.6 2.85 102.9
0.2510 1.4 2.56 96.7
0.2506 1.5 2.72 101.1
0.2509 1.4 2.58 98.3
RP-HPLC分析结果表明,提取物中主要成分莫诺苷(a)、马钱素(b)、芍药苷(c)的相对保留时间分别为1.0,1.75~1.85,1.90~2.10。HPLC-MS分析表明,样品中的主要成分a、b和c在(-)ESI-MS二级质谱中分别具有[M-H]的准分子离子和[M-glc]碎片峰(a为:405和243;b为:389和227;c为:479和317),见图6~图9。
样品含量测定:样品中莫诺苷、马钱素、芍药苷含量分别为6.2-7.6%、3.3-4.1%、3.0-3.6%,三部分加和为12.5-15.3%。折算为在六味地黄汤提取物中三部分加和为1.85-2.27%。
二、提取物中寡糖(甘露三糖)的含量测定
仪器及试剂
甘露三糖为本实验室制备,经过光谱、HPLC-MS确定为甘露三糖,通过面积归一化法测定其纯度达到98%以上;乙腈为色谱纯;水为去离子水。
仪器:Waters 600泵,Waters 410示差检测器。
实验方法
1、色谱条件 Intersil氨基柱(4.6mm×250mm);柱温为室温;流动相为乙腈-水(67∶33,v/v);流速为1.0mL/mL;20uL进样阀;示差检测器。
2、标准曲线的制备 称取甘露三糖对照品0.0170g,加水配成5mL溶液,摇匀后过0.45μm的滤膜,然后分别从中吸取3,2.5,1.5,1.25mL加水配成5mL水溶液,摇匀,共是5份对照品溶液。按上述色谱条件进样分析,将色谱峰积分面积与对照品浓度做回归分析,考察线性范围。
3、精密度实验 按上述色谱条件,将同一对照品溶液连续进样6次,计算RSD值,考察仪器的精密程度。
4、稳定性实验 按上述色谱条件,将同一样品溶液进样,在0,30min,1h,2h,4h,8h测定,考察样品溶液的稳定性。
5、样品测定 取该提取物8.92g,加60%乙醇80毫升,充分搅拌,放置。离心处理(2500转/分,25min),沉淀再用60%乙醇沉淀,沉淀弃。合并两次上清液,经旋转薄膜蒸发,除去乙醇,进行大孔吸附树脂柱层析,水洗脱部位浓缩后进行活性炭柱层析,用水和30%乙醇依次洗脱,30%乙醇洗脱部位浓缩除醇后冻干,为寡糖部位。称取按寡糖样品3份0.0757g,0.0755g,0.0835g,置于25mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀,过滤后按上述色谱条件进样,根据测得的峰面积计算寡糖的含量。
6、重复性实验 按工艺,在同样的条件下同时制备3份样品,称取一定量配成浓度为3mg/mL的水溶液,在上述色谱条件进样分析。
结果
在上述色谱条件下,甘露三糖对照品水溶液在0.85mg/mL~3.5mg/mL浓度范围内呈良好的线性,标准曲线方程为Y=6.53×10-8A-0.023[Y为浓度mg/mL,A为峰面积]。精密度实验结果表明,本实验所用仪器精密度良好;样品水溶液室温下8小时内测定,结果十分稳定,;重复性实验结果(见表2)表明,利用水煎醇沉后醇溶部分过大孔树脂得到水洗脱部分,再经活性碳柱层析得到活性寡糖的提取分离工艺重复性好。
分析结果显示,样品中的寡糖部分中主要成分是甘露三糖,还有少量的水苏糖和二糖。二糖、甘露三糖和水苏糖的相对保留时间分别为1,1.40~1.53,1.55~1.70(见图10,11)。在部位C中,甘露三糖平均占36.8-56.8%,折算为在六味地黄汤提取物中甘露三糖平均占23.5-35.5%。
表2 HPLC测定寡糖样品重复性实验
样品代号 1 2 3
样品质量(g) 0.0726 0.0752 0.0765
峰面积 20348086 22157259 23037208
含量 44.96% 47.3% 48.4%
平均含量 46.8%
RSD 3.7%
三、提取物中多糖的含量测定:
仪器与试剂:
试剂:间羟基联苯(AR.):以0.5%氢氧化钠配置成质量比为0.15%,冰箱保存一月内有效;四硼酸钠(AR.)-硫酸试液:0.0125mol/mL四硼酸钠的浓硫酸溶液;半乳糖醛酸(Sigma)标准液:80℃干燥至恒重后配置成60μg/mL,冰箱保存备用。硫酸为分析纯;苯酚为分析纯,重蒸后冰箱保存,用前加水配置成5%的水溶液;葡萄糖为分析纯,105℃干燥至恒重。
仪器:cintra-20(澳大利亚)紫外分光光度仪
实验方法
1.间羟基联苯法
1.1标准曲线的制备 精密吸取Gala A标准液0,0.3,0.6,0.9,1.2,1.5mL分别置于6个25mL的容量瓶中,各补加水至1.5mL,摇匀,冰浴冷却,加入四硼酸钠-浓硫酸9.0mL摇匀,沸水浴5min,取出冰浴冷却,加入间羟联苯溶液0.15mL,摇匀,放置半小时后,于525nm下测定吸收值。
1.2精密度实验 精密吸取GalaA标准溶液0.9mL6份,余操作同上,在同样条件下考察仪器的精密度。
1.3样品的制备:取该提取物8.83g,加60%乙醇80毫升,充分搅拌,放置,离心处理(2500转/分,25min),沉淀再用60%乙醇沉淀一次,弃去上清。沉淀水溶解后,冷冻干燥备用。
1.4稳定性实验 称取样品配置一定浓度的溶液,吸取1.0mL,余按第一项下操作,在0,20min,40min,1h,3h,5h,8h测定吸光度值,考察样品及与反应试剂生成有色物的稳定性。
1.5样品重复性实验 按工艺处理方法在同样条件下同时制备样品3份,按样品测定项下配置溶液,吸取1.0mL,同上操作,测定吸光度,考察此分离方法的稳定性。
1.6样品测定 称取同一样品6份,配置成浓度为0.4mg/mL,吸取1.0mL,将其分为两组,按第一项操作,第一组加显色剂,第二组加同等量的0.5%氢氧化钠溶液,第一组测得吸光度值扣除第二组后,计算60%醇沉酸性多糖的含量。
1.7加样回收率 精密称取样品五份,每份精密依次加入半乳糖醛酸标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL,加水定容,摇匀后,吸取1.0mL按第一项下操作,测定吸光度值,计算回收率,考察此定量方法的稳定性。
2.苯酚-硫酸法
2.1标准曲线的制备 精密称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品,配成浓度为0.3mg/mL备用液。分别吸取备用液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0置于50mL的容量瓶中,加水定容至刻度摇匀,配成标准液。分别吸取标准溶液各2.0mL置于25mL量瓶中,加入5%(g/v)苯酚溶液1.8mL,混匀,迅速加入浓硫酸7.5mL(10~20s),混匀,置沸水浴中加热20min,取出后冷水浴中冷却30min,另以2.0mL蒸馏水同上平行操作为空白对照,于490nm下测定吸光度值。
2.2校正曲线的制备 精密称取80℃烘干的半乳糖醛酸0.0595g,加水配成100mL溶液,摇匀后,从中取出1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL于6个50mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀后,从中取2.0mL,置于25mL容量瓶中,余操作同第一项。
2.3精密度实验 精密吸取同一标准溶液2.0mL共6份,按第一项下操作,测定吸收值A,在同样条件下考察仪器的精密度。
2.4稳定性实验 精密吸取样品溶液2.0mL,按第一项下操作,在0,10min,30min,1.0h,1.5h,2.5h,4.0h时间点测吸收值,考察样品的稳定性。
2.5样品测定 称取同一样品3份,配置成浓度为0.04mg/mL,吸取样品溶液2.0mL,置于25mL容量瓶,余操作按第一项,测定吸光度值,计算60%醇沉中性多糖的含量。
2.6样品重复性实验 按工艺处理方法在同样条件下同时制备样品3份,按样品测定项下配置溶液,吸取2.0mL置于25mL容量瓶,余同上操作,测定吸光度,考察此分离方法的重复性。
2.7加样回收率实验 精密称取样品5份,每份依次精密加入葡萄糖标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL,加水定容,摇匀后,吸取2.0mL按第一项下操作,测定吸光度值,计算回收率,考察此定量方法的稳定性。
实验结果:
采间羟基联苯法与苯酚-硫酸法联用,测定样品经处理后的大分子部位中的多糖的含量。先用间羟基联苯法测定糖醛酸的含量,可靠准确;然后用苯酚-硫酸法测定糖的含量,同时将糖醛酸做对照品,按此法做校正曲线,将第一步测得的糖醛酸含量带入校正曲线进行校正,得到计算吸光度值。从该法测得的吸光度值中扣除计算值后,带入该法标准曲线中计算得到中性糖的含量,中性糖与酸性糖醛酸加和即得总多糖的量,再根据原样品的重量折算出总多糖在样品中的含量。测定结果表明,提取物中总多糖的含量在11.4-17%范围之间。
表3.间羟基联苯法重复性实验结果
样品NO. 1 2 3
质量(g) 0.0213 0.0212 0.0213
吸收度 0.7877 0.7780 0.8209
含量(%) 22.2 22.0 23.0
平均含量 22.5%
RSD 2.0%
表4 苯酚-硫酸法重复性实验结果
样品NO. 1 2 3
样品质量(g) 0.0213 0.0212 0.0213
吸光度值 0.2285 0.2408 0.2431
含量(%) 65.3 66.7 67.5
平均含量 66.5%
RSD 1.67%
进一步讲,六味地黄汤中的多糖活性部位主要由酸性杂多糖构成。多糖活性部位在酸性条件下水解后,将水解后样品以纤维素薄层层析板上展开,与单糖标准品对照,可清楚地检出鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸。
多糖酸水解分析糖组成:
取5mg多糖样品加入2M三氟乙酸3ml,封管,在100℃水解10小时,水解液40℃减压蒸馏除去大量的三氟乙酸后,分五次加入3ml甲醇,共沸蒸馏,除去残留的三氟乙酸,残渣溶于0.3ml水中得到待测样品。
将待测样品和标准单糖水溶液点样于水饱和的纤维素薄层层析板上,用乙酸乙酯∶吡啶∶冰醋酸∶水(5∶5∶1∶3)混合溶液为展开剂,展开八小时,约展开16厘米后,取出,吹干展开剂,喷以显色剂苯胺-邻苯二甲酸,100℃烘5分钟。将多糖样品显色斑点的Rf值及斑点颜色与标准单糖比较,可确定样品多糖的单糖组成。
按上述方法可得到六味地黄汤中的多糖活性部位的特征薄层层析图。分析结果显示,六味地黄多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸构成,并含有微量木糖和甘露糖。
根据本发明,本发明六味地黄汤提取物LW-ABC具有明显改善或调节免疫功能的活性,对伴有肾阴虚证并具有免疫功能低下的各种疾病以及生殖内分泌功能低下或紊乱的各种疾病,特别是肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱等疾病具有治疗或辅助治疗作用。
根据本发明,本发明的六味地黄汤提取物由多糖类部位,苷类部位和寡糖类部位三部分组成,可测定成分的含量范围为:总多糖11.4-17%,总苷类1.85-2.27%,寡糖23.5-35.5%。
根据本发明,本发明还涉及药物组合物,包括作为活性成分的本发明六味地黄汤提取物及一种或多种药用载体或赋形剂。
根据本发明,本发明还涉及六味地黄汤提取物用于制备治疗伴有肾阴虚证并具有免疫功能低下的各种疾病以及生殖内分泌功能低下或紊乱的各种疾病,如:肿瘤、肿瘤化学或放射治疗时的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱等病的药物的用途。
根据本发明,本发明六味地黄汤提取物可单独或以药物组合物形式使用,其给药方式可根据具体情况而定,可通过口服、非肠道或局部给药,给药剂型可以是例如片剂,丸剂、胶囊,膏剂,口服液等。
具体实施方式
实施例
下面的实施例和生物活性实验,是对本发明的进一步详细说明,但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1:六味地黄汤提取物LW-ABC的制备
按六味地黄汤各单味药的配比,即熟地黄∶山茱萸∶山药∶泽泻∶丹皮∶茯苓(8∶4∶4∶3∶3∶3)或对部分药味加、减量后,组成生药共1500克,加六倍生药重量的沸水煎煮两次,每次两小时,用纱布(六层)加脱脂棉过滤,减压浓缩至生药(重量)与浸膏(体积)比1∶1。
浸膏伴随搅拌加乙醇至乙醇终浓度30%(v/v),搅拌,放置过夜。离心处理(2500转/分,25min)。沉淀用30%乙醇冲洗4次,离心,沉淀弃。上清液合并浓缩至1000毫升,用95%乙醇将乙醇终浓度调节为60%,搅拌,放置过夜,同法离心处理。沉淀用60%乙醇再进行二次醇沉淀处理。所得沉淀用水溶解浓缩除醇后,冷冻干燥,得到灰白色粉末(部位A,51.92克)。三次上清液合并,旋转薄膜蒸发,除去乙醇,进行HP-20大孔吸附树脂柱层析,树脂柱床体积(毫升)与上样量(克)比为10∶1,然后用水和30%乙醇依次洗脱,30%乙醇洗脱部位浓缩除醇后冻干,得到棕黄色粉末(部位B,38.6克)。水洗脱部位浓缩后进行活性炭柱层析,活性炭柱床体积(毫升)与上样量(克)比(20∶1),用水和30%乙醇依次洗脱,30%乙醇洗脱部位浓缩除醇后冻干,得到白色粉末(部位C,151克)。将A、B和C三个部位合并,形成提取物。
其具有前述的定性反应特征。
以前述的定量方法测得所得提取物中:多糖14.2重量%,总苷类2.06重量%,寡糖29.5重量%。
实施例2:实施例1六味地黄汤提取物LW-ABC的生物活性实验
一、LW-ABC对免疫功能的作用
1.LW-ABC对“肾阴虚”小鼠免疫功能的影响
“肾阴虚”小鼠模型的制备按下述方法进行:给Balb/c小鼠皮下注射皮质酮混悬液,25mg/kg,2次/日,连续7天。于造摸当天开始灌胃给予六味地黄汤或六味地黄汤活性成分组方LW-ABC,1次/日,连续7天,于末次给药后4小时进行实验。小鼠称重后断头处死,分别取出胸腺和脾脏,称重,计算胸腺和脾指数。淋巴细胞增殖反应实验时将小鼠断头处死,无菌取脾脏,制备脾细胞悬液,用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度为5×106细胞/ml,取50μl不同浓度的受试药物、50μl Con A(终浓度为0.5ug/ml)和100μl细胞悬液依次加入96孔板内,对照组用1640培养液代替Con A或(和)药物,置37℃、5%CO2孵温箱孵育56小时,每孔加入20μl 3H-TdR(10μCi/ml),继续培养至72小时,以多道细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上,80℃烘干后,将玻璃纤维滤纸置于闪烁液内,用液体闪烁计数仪测cpm值。每样品4平行孔,结果用平均cpm值表示。结果表明,与对照组相比,模型小鼠胸腺和脾脏指数明显下降,脾细胞淋巴细胞增殖反应明显下降;口服给予LW-ABC对模型小鼠胸腺指数和脾细胞增殖反应能力的降低具有明显改善作用(表5)。
表5.LW-ABC对“肾阴虚”小鼠免疫功能的影响
剂量 脾脏 胸腺 淋巴细胞增殖(cpm)
分组
(g/kg) 重量(mg) 系数 重量(mg) 系数 Con A(-) Con A(+)
对照组 / 148.0±25.7 6.6±0.7 47.0±12.2 2.0±0.5 799±147 41683±7049
模型组 / 27.6±1.3** 1.4±0.0** 15.6±5.3** 0.8±0.3** 343±85** 8247±306**
模型+LW 10.0 34.4±6.4 1.3±0.8 28.5±7.8## 1.4±0.4## 549±69## 19199±1247##
模型+ 0.8 26.6±5.2 1.3±0.2 31.5±8.1## 1.5±0.4## 784±106## 34447±6419##
LW-ABC 1.6 25.8±2.8 1.3±0.1 36.9±4.8## 1.8±0.3## 419±85 15403±2395##
3.2 25.7±1.9 1.3±0.1 33.4±4.5## 1.7±0.2## 233±27 10012±1477
注:肾阴虚造摸方法:25mg/kg皮质酮混悬液sc,2/日;造摸当天开始灌胃给药,1次/日,连续7天,末次给药后4小时开始实验;LW:六味地黄汤全方。*p<0.05,**p<0.01与对照组比较;#p<0.05,##p<0.01与肾阴虚组比较;Mean±SD,n=10。
2.LW-ABC对环磷酰胺所致小鼠脾细胞抗体生成反应的影响
实验用Balb/c小鼠,灌胃给药7天,1次/日。于给药第3天时每只小鼠腹腔注射绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2ml(5×107个红细胞)/只,免疫当天,除正常对照组外,各组小鼠腹腔注射环磷酰胺,15mg/kg,次日以同剂量重复注射一次。以SRBC免疫后第4天进行实验,实验时小鼠断头处死,取脾脏,制备脾细胞悬液,调整细胞浓度为2.5×106/ml。取脾细胞悬液400μl与50%SRBC(50μl)及50%补体(按1∶1稀释的新鲜豚鼠血清50μl)混合,取100μl加入Cunningham氏小室中,石蜡封口后置于37℃孵箱中孵育1小时,记数小室内溶血空斑(PFC)形成数,结果以PFC/106个脾细胞表示。结果表明,环磷酰胺处理小鼠脾细胞抗体生成反应能力较对照组明显下降,口服给予六味地黄汤及LW-ABC均具有明显改善作用(表6)。
表6.LW-ABC对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠抗体生成反应的影响
组别 剂量(g/kg) PFC/106脾细胞
正常对照组 / 228±24
模型对照组 15mg 90±18**
模型+LW 10 157±30##
模型+LW-ABC 0.8 115±17
1.6 188±29##
3.2 333±42##
注:LW:六味地黄汤。**P<0.01,与正常对照组比较;#P<0.05,##P<0.01,与Cy模型组比较。
3.LW-ABC对荷瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响
移植瘤小鼠模型的制备按下述方法进行:取S180腹水传代小鼠,无菌取腹水,以生理盐水稀释,调整细胞浓度为2×105/ml。给Balb/c小鼠右前腋皮下注射S180细胞悬液,0.2ml/只小鼠。小鼠于移植肿瘤细胞后24小时口服给予六味地黄汤或LW-ABC,连续12天,进行实验,小鼠脾细胞增殖反应按前述方法进行。结果表明,口服给予六味地黄汤对Con A诱导的荷瘤小鼠脾细胞的增殖反应具有明显改善作用,但对LPS诱导的脾细胞增殖反应无明显作用;口服给予LW-ABC对Con A和LPS诱导的脾细胞增殖反应均具有明显改善作用(表7)。
表7.LW-ABC对荷S180肉瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响
剂量 3H-TdR(cpm)
组别
(g/kg) 1640 Con A LPS
荷瘤对照 / 236±72 1949±398 6801±930
荷瘤+Cy 15mg 147±6** 224±54** 1182±118**
荷瘤+LW 10 351±59 3675±607** 6124±620
荷瘤+LW-ABC 0.8 470±57** 5059±718** 8039±557
1.6 406±41 6209±852** 8369±1056
3.2 262±47 5207±572** 9473±634**
注:*P<0.05,**P<0.01,与荷瘤对照组比较。
以动物肾上腺皮质功能改变模拟肾虚证的主要依据是临床肾阳虚患者表现为肾上腺皮质功能低下,肾阴虚患者临床表现有肾上腺皮质功能亢进的现象,肾上腺皮质激素在衰老过程中也明显增高。此外,临床因治疗需要长期大量使用肾上腺皮质激素病人表现为肾阴虚,激素停用后表现为肾阳虚。根据以上结果,设计了应用肾上腺皮质激素制备“肾虚证”动物模型的方法。动物给予肾上腺糖皮质激素制备肾虚证的造模方法是目前广泛使用的动物肾虚证的造模方法。在大量研究中,动物应用皮质激素期为“肾阴虚”,停用后为“肾阳虚”。本研究所采用的外源性皮质酮处理小鼠7天造“肾阴虚”模型的方法,已基本得到学者认可,并已被大量文献应用。上述实验结果表明,口服给予六味地黄汤提取物的配伍组合物LW-ABC对“肾阴虚”模型小鼠、环磷酰胺处理小鼠及荷瘤小鼠所表现的免疫功能低下均具有明显的改善作用,其作用强度不低于等剂量推算的六味地黄汤全方的作用,表明LW-ABC基本反应了六味地黄汤全方的药效,提示LW-ABC对于伴有肾阴虚证的多种原因所导致的免疫功能低下或平衡失调均具有明显改善或调节作用,临床可用于伴有肾阴虚证的各种原因所致免疫功能低下或平衡紊乱表现之疾病的治疗或辅助治疗。
二、LW-ABC对生殖内分泌系统的作用
1.LW-ABC对快速老化模型小鼠(SAM)下丘脑-垂体-性腺轴功能的作用
(1)LW-ABC对SAMP8动情周期的影响
动情周期的测定按下述方法进行:用消毒的棉签浸生理盐水插入小鼠阴道约0.5cm,轻轻转动后取出,将棉签上的阴道脱落细胞均匀涂于洁净的载玻片上,待涂片自然风干后用碱性美蓝溶液染色5min,然后用蒸馏水慢慢冲洗,自然风干后于显微镜下现察细胞形态,确定动情周期。
动情周期的判断方法
动情周期 持续时间 卵巢变化 涂片细胞变化
(h)
动情前期 18 卵泡加速生长 全为有核上皮细胞,偶有少量角化细胞
动情期 42 卵泡成熟,排卵 全为无核角化细胞,或间有少量上皮细胞
动情后期 12 黄体生成 白细胞、角化细胞、有核上皮细胞均有
动情间期 48-72 黄体退化 大量白细胞和少量上皮细胞或粘液
选用9-12月龄SAM快速老化亚系SAMP8用于实验,以同月龄抗快速老化亚系SAMR1为对照。实验时设立六味地黄汤全方对照组,剂量为10g/kg。结果表明,与同月龄SAMR1相比,SAMP8动情周期及动情间期明显延长,动情期有缩短,六味地黄汤能明显缩短模型小鼠动情周期及动情间期,延长其动情期;口服给予LW-ABC亦能明显缩短模型小鼠动情周期和动情间期,在剂量为3.2g/kg时能明显延长模型小鼠动情期(见图12)。
(2)LW-ABC对SAMP8血清E2水平的影响
应用放射免疫分析检测试剂盒(天津协和生物技术研究所产品)检测小鼠血清E2水平。具体操作过程按试剂盒说明进行,操作程序及加样量(μl)如下表所示,标准品、NSB、T均为双管。
小鼠血清E2检测操作程序
T T N N 0 0 S1-S6 质控品和待测样品
去激素标准血清 - - 20 20 20 20 - -
0 0 0 0
标准血清 - - - - - - 200 -
质控品和待测样品 - - - - - - - 200
抗E2血清 - - - - 10 10 100 100
0 0
混匀,37℃水浴温育2h
125I-E2 10 10 10 10 10 10 100 100
0 0 0 0 0 0
混匀,37℃水浴温育1h
分离剂(冷) - - 50 50 50 50 500 500
0 0 0 0
充分摇匀,离心3000g×20min,4℃
倾去上清液
沉淀物计数cpm值,根据标准曲线,用计算机计算E2浓度
实验结果表明,与同月龄SAMR1比较,SAMP8血清E2水平明显降低;口服给予六味地黄汤对SAMP8血清E2水平的下降具有明显改善作用,口服LW-ABC对SAMP8血清E2水平的降低亦有明显改善作用(图13)。
(3)LW-ABC对SAMP8垂体LH水平的影响
应用时间分辨免疫荧光分析法检测小鼠垂体LH含量。断头处死小鼠,取处垂体,迅速置于液氮中,检测时从液氮中取出垂体,待液氮挥发至稳定后称重,然后移至盛有400μl裂解液(Na3PO4 10mM、NaCl 0.14M、BSA 1%的水溶液)的离心管中,将离心管置于冰浴中,用超声法制备匀浆,4℃离心分离上清,用于LH水平的测定。测定前垂体样品按1∶29比例稀释。应用96孔测定板进行测定,加样前用洗涤液洗涤测试孔,然后依次加入50μl hLH标准品或血清样品和200μl示踪剂工作液。于振荡器上快速震荡2分钟,4-10℃静置过夜,然后于室温下缓震1小时,用洗涤液洗涤测定孔6次,每孔加入200μl增强液,于震荡器上缓慢震动5分钟,10-15分钟后用时间分辨荧光仪测定荧光。根据标准曲线,计算样品中LH的含量。结果表明,与同月龄SAMR1对照组相比,SAMP8垂体LH含量明显升高。口服给予六味地黄汤能明显降低SAMP8垂体LH的含量;口服给予LW-ABC对SAMP8垂体LH的水平升高亦具有明显降低的作用(见图14)。
(4)LW-ABC对SAMP8下丘脑GnRH含量的影响
小鼠下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的检测采用海军放射免疫技术研究所生产的放射免疫分析试剂盒进行检测。SAMP8断头处死,分离取出下丘脑,置于液氮中保存备用。测定时从液氮中取出下丘脑,待液氮挥发至稳定后,称重,置于盛有300μl煮沸生理盐水的离心管中,继续煮沸3min,然后加入150μl冰醋酸,置于冰浴中,超声法制备匀浆,加入150μl NaOH中和冰醋酸,然后加入25μl抑肽酶,混匀,4℃离心分离上清,分装后置于-70℃保存备用。测试时按试剂盒说明进行,操作程序及加样量(μl)如下表所示,T、NSB、标准品均为双管。
小鼠下丘脑GnRH含量测定操作程序
T T N N 0 0 S1-S8 待测样品
标准品 - - - - - - 100 -
待测样品 - - - - - - - 200
抗GnRH血 - - - - 100 100 100 100
清
缓冲液 - - 300 300 200 200 100 -
混匀,4℃放置24h
125I-GnRH 100 100 100 100 100 100 100 100
混匀,37℃水浴温育1h
分离剂(冷) - - 500 500 500 500 500 500
充分摇匀,室温放置15min,4℃离心3000g×15min
倾去上清液
沉淀物计数cpm值,根据标准曲线,用计算机计算GnRH浓度
结果表明,与SAMR1对照组比较,SAMP8下丘脑GnRH含量明显升高。口服给予六味地黄汤能明显降低SAMP8下丘脑GnRH含量,口服给予LW-ABC对SAMP8下丘脑GnRH含量的升高亦具有明显降低作用(见图15)。
2.LW-ABC对“肾阴虚”小鼠下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱的作用
(1)LW-ABC对“肾阴虚”小鼠卵巢重量的影响
断头处死小鼠,取卵巢称重。结果表明,用皮质酮处理5天后小鼠卵巢重量较对照组明显下。口服给予LW对皮质酮所致小鼠卵巢重量降低具有明显改善作用,口服给予LW-ABC亦能明显提高模型小鼠的卵巢重量(图16)。
(2)LW-ABC对“肾阴虚”小鼠血清E2水平的影响
应用放射免疫分析方法(如前述)测定小鼠血清E2水平。结果表明,“肾阴虚”小鼠血清E2水平较对照组明显下降。口服给予六味地黄汤对模型小鼠血清E2水平的下降具有明显改善作用,口服给予LW-ABC对模型小鼠血清E2水平降低也具有明显改善作用(图17)。
(3)LW-ABC对“肾阴虚”小鼠垂体LH含量的影响
应用时间分辨免疫荧光分析法(如前述)检测小鼠垂体LH含量。结果表明,模型小鼠垂体LH的含量较正常对照组明显下降,口服六味地黄汤及LW-ABC均能明显提高模型小鼠垂体LH的含量(图18)。
3.LW-ABC对“肾阴虚”小鼠睾丸重量及血清睾酮水平的影响
“肾阴虚”模型小鼠制备方法同前述。小鼠称体重后断头处死,取睾丸称重,计算睾丸指数。血清睾酮应用贝克曼库尔特Access全自动微粒体化学发光免疫分析仪及配套试剂盒测定,该仪器的检测灵敏度为0.5ng/ml。测定时将待测血清分别置于0.2ml测定管中,放入仪器测试架中,设定仪器测定程序,由仪器自动进行测定,并计算血清睾酮含量。结果表明,模型小鼠血清睾酮水平较对照组明显降低,口服给予六味地黄汤对模型小鼠血清睾酮水平的下降无明显改善作用,口服给予LW-ABC对模型小鼠血清睾酮水平的下降具有明显改善作用(表8)。
表8.LW-ABC对“肾阴虚”小鼠睾丸重量及血清皮质酮水平的影响
睾丸
分组 剂量(g/kg) 睾酮(ng/ml)
重量(mg) 系数
对照组 / 169.4±9.8 7.4±0.6 8.2±3.4
模型组 / 164.5±11.6 7.4±2.8 4.4±1.6*
模型+LW 10.0 160.7±13.2 7.9±0.4 6.0±1.7
模型+LW-ABC 0.8 163.7±16.2 8.0±0.6 9.9±5.0##
1.6 161.8±13.2 8.0±0.8 8.7±4.2#
3.2 160.6±12.3 8.2±0.6 8.2±4.6#
注:*p<0.05,**p<0.01与对照组比较;#p<0.05,##p<0.01与肾阴虚组比较;Mean±SD,n=10。
快速老化模型小鼠(senescence-accelerated mouse,SAM)是由日本京都大学竹田教授于培育成功的一种快速老化的小鼠,包括快速老化的P系(senescence-accelerated mouse-prone,SAMP)和抗快速老化的R系(senescence-accelerated mouse-resistant,SAMR),P系的特点是随增龄出现快速、进行性全身各系统的老化,R系则具有正常小鼠的生理特征,为P系的对照。SAMP8是快速老化亚系之一,其特点是随增龄其中枢学习记忆功能及免疫功能快速进行性衰退。我室自1994年从日本京都大学竹田教授实验室引进了SAMR1和SAMP8亚系的种鼠,在我院实验动物实验室繁殖和饲养,并应用于实验研究。
我们以往研究表明,SAMP8随增龄快速出现下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)和性腺(HPG)轴功能的平衡失调,与人类衰老性HPA轴和HPG轴的变化十分相似,表现为在增龄过程中血清皮质激素水平进行性升高;雌性SAMP8动情期缩短,间期延长,血清E2水平下降,垂体LH水平和下丘脑GnRH水平升高,与人类肾阴虚证、衰老、妇女更年期以及HPG轴功能低下或平衡失调相关的许多疾病具有相似的表现。动情周期的延长或不规则是衰老过程中生殖内分泌功能低下的直接表现,因此,性功能的早期快速衰退也是SAMP8快速衰老的重要表现之一,其垂体LH水平的增龄性升高是卵巢功能低下,导致雌激素水平降低,从而使下丘脑-垂体负反馈抑制减弱所致。
本实验结果表明,口服给予LW-ABC对SAMP8所表现的HPG轴功能低下具有明显改善或调节作用,其作用与六味地黄汤全方相似,表明LW-ABC对衰老性HPG轴的功能低下或平衡紊乱具有明显改善或调节作用。LW-ABC对肾上腺皮质激素所致“肾阴虚”模型小鼠卵巢重量降低、血清E2和垂体LH水平的降低亦具有明显改善作用;对雄性“肾阴虚”小鼠血清睾酮水平的下降亦具有明显改善作用,表明LW-ABC对“肾阴虚”小鼠所表现的HPG轴功能低下或平衡失调具有明显改善或调节作用。上述结果提示,LW-ABC对衰老、肾阴虚所致HPG轴功能低下或平衡紊乱均具有改善或调节作用,临床可用于衰老和伴有肾阴虚证的HPG轴功能低下疾病如更年期综合症、卵巢功能低下、不孕症、习惯性流产、植物神经紊乱、黄褐斑、男性乳房发育、老年性功能衰退、更年期骨质疏松,老年骨质疏松等预防和治疗。
Claims (7)
1.六味地黄汤提取物,其包括以六味地黄汤提取物重量计,11.4-17重量%的多糖,和/或1.85-2.27%重量%的总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)和/或23.5-35.5重量%的甘露三糖,其中六味地黄汤由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
2.药物组合物,其包括含有11.4-17重量%多糖,和/或1.85-2.27%重量%总苷(莫诺苷、马钱素、芍药苷)和/或23.5-35.5重量%的甘露三糖的六味地黄汤提取物及药用载体,其中六味地黄汤由熟地、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六味中药以8∶4∶4∶3∶3∶3的重量比例配伍组成。
3.六味地黄汤提取物的制备方法,其包括:
i)将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3组成的混合物用沸水蒸煮两次,然后浓缩至浸膏;
ii)伴随搅拌往浸膏中加入乙醇至乙醇浓度30%(v/v)放置,离心,冲洗,将上清液与洗液合并为上清液;
iii)浓缩上清液,伴随搅拌往浓缩液中加95%乙醇至乙醇浓度60%(v/v),放置,分离得部位A和上清液;
iv)将iii)中上清液进行柱层析,用水和极性有机溶剂洗脱,有机溶剂洗脱液浓缩后得部位B;
v)iv)中水洗脱液浓缩后上活性炭柱,用乙醇洗脱,乙醇洗脱液浓缩后得部位C;
vi)将iii)中部位A,iv)中部位B和v)中部位C混合。
4.权利要求3所述方法,其中所用大孔吸附树脂为所有型号的弱极性大孔吸附树脂;两次醇沉淀所用醇为C1-4低级烷基醇,浓度范围分别为10%-40%和50%-95%;大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为所有大孔树脂所能允许使用的极性有机溶剂,浓度范围为10%-95%。活性炭层析洗脱所用醇为甲醇和乙醇,醇浓度为20%-95%。
5.根据权利要求1的六味地黄汤提取物,其中所述提取物是用于治疗肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱等的提取物。
6.权利要求2的药物组合物,其中所述组合物是治疗肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱的药物化合物。
7.权利要求1的提取物在制备治疗肿瘤、肿瘤化学或放射治疗过程中的副作用、白细胞减少症、衰老性免疫功能低下、感染、系统性红斑狼疮、肾病综合征、肾炎、支气管炎及支气管哮喘、前列腺炎、再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、重症肌无力、老年性免疫功能低下或紊乱、更年期综合征、卵巢功能低下、习惯性流产、不孕症、黄褐斑、男性乳房发育、更年期骨质疏松、老年性骨质疏松、植物神经紊乱的产品中用途。
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