CN102652785B - 六味地黄汤总提取物组合物、制备方法及在制备应激反应心、脑、睾丸并发症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
六味地黄汤总提取物组合物、其制备方法及其在制备治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸等并发症药物中的应用。六味地黄汤总提取物组合物，原料药由熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比组成，其特征在于，所述的组合物中包括有：六味地黄汤总提取物挥发油β-环糊精包合物组分；六味地黄汤总提取物多糖组分；六味地黄汤总提取物糖苷类组分，以及六味地黄汤总提取物脂溶性组分。本发明克服了现有技术忽略六味地黄汤总提取物脂溶性有效成分的不足，通过提取工艺，得到六味地黄汤总提取物的更完备的组分构成，并使得采用这种组合物治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸等并发症成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种六味地黄汤总提取物组合物、这种六味地黄汤总提取物组合物制备方法，以及这种六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸等并发症的药物中的应用。
技术背景
六味地黄汤源于宋代医学家钱乙的《小儿药证直诀》，该方是由熟地黄、山茱萸（制）、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓共六味中药组成，是中医“滋补肾阴”的基础方剂。其配方具有三补三泻的特点：六味地黄汤重用熟地滋阴补肾，填精益髓，为君药。山茱萸补养肝肾，并能涩精，取肝肾同源之意，山药补益脾阴，亦能固肾，共为臣药。三药配合，肾肝脾三阴并补，是为三补，但熟地黄用量是山茱萸和山药之和，故仍以补肾为主。泽泻利湿而泄肾浊，并能减熟地黄之滋腻，茯苓淡渗脾湿，并助山药之健运，与泽泻共泻肾浊，助真阴得复其位，牡丹皮清泄虚热，并制山茱萸之温涩。三药称为三泻，均为佐药。六味合用，三补三泻，其中补药用量重于泻药，是以补为主，肝脾肾三阴并补，以补肾阴为主。该方被誉为补肾方药之祖，主要用于肾阴虚引起的腰膝酸软、头晕耳鸣、手脚心发热、遗精盗汗等症状。经过现代药理学研究表明，六味地黄汤具有改善肾功能、调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、抗低温、耐缺氧、降血脂、降血压、降血糖和促进新陈代谢等作用。六味地黄制剂在中医临床中广泛应用，并获得了良好的治疗效果。但是目前该方在实际应用中存在明显不足，就是用药剂量大，用药不方便，因此，改进其制备工艺就有其重要意义。
据文献报道，六味地黄制剂中的脂溶性成分对糖尿病模型具有良好的降血糖作用【参考文献：韩璟超，季晖，薛城锋，等.山茱萸总萜的降血糖作用.中国天然药物，2006，4（2）：125-129】。专利申请号“200410058600.X”的专利中六味地黄制剂的制备方法考虑了六味地黄汤中多糖类和糖苷类有效成分，但在制备过程中忽略了六味地黄制剂中的脂溶性有效部位。
专利申请号“200410062502.3”的专利中六味地黄制剂的制备方法考虑到了多糖类成分和脂溶性成分，但该法仅是六味地黄处方中部分药采用了醇提取，并不是整体提取，丢失了部分脂溶性有效成分。
文献报道，茯苓的活性多糖的分子量为3.8×104左右【参考文献：陈春霞.羧甲基茯苓多糖的化学研究.中国食用菌，1994,（05）:35】，山药多糖分子量为4.22×104左右【参考文献：熊平，蒋灵芝，余俊龙，等.山药多糖研究评述.中医药学刊，2003,（11）:53】，山茱萸多糖的分子量为2.47×104左右【参考文献：杨云，刘翠平，王浴铭，等.山茱萸多糖的化学研究.中国中药杂志，1999,24（10）:615】,丹皮降血糖的活性多糖的分子量为1.3×104左右【参考文献：陈彦，沈业寿，赵帜平，等.丹皮多糖PSM2b的纯化及其理化性质研究.激光生物学报，2004,13（3）:237-241】，可见六味地黄活性多糖部位的分子量多集中在1万～5万之间。
发明内容
本发明的目的是提供一种六味地黄汤总提取物组合物、这种六味地黄汤总提取物组合物的制备方法，以及这种六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸等并发症的药物中的应用。本发明将克服现有技术忽略六味地黄汤总提取物脂溶性有效成分的不足，通过提取工艺，得到六味地黄汤总提取物的更完备的组分构成，并使得采用这种组合物治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸等并发症成为可能。本发明基于六味地黄汤的治疗新适应症和新靶点：应激状态是一种复杂的病理生理状态。其中，NADPH氧化酶的激活是最重要来源。 六味地黄汤的“三补三泄”的药理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，从而，可减少内质网应激分子，减轻无叠合蛋白质反应（Unfolded protein response，UPR）六味地黄汤治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸等并发症，由于抑制NADPH 氧化酶。
完成上述发明任务的方案是，一种六味地黄汤总提取物组合物，原料药由熟地黄、山茱萸（制）、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10.4~7.6：5.2~2.8：5.2~2.8：3.9~2.1：3.9~2.1：3.9~2.1的重量比组成，其特征在于，所述的组合物中包括有：六味地黄汤总提取物挥发油β-环糊精包合物组分，六味地黄汤总提取物多糖组分，味地黄汤总提取物糖苷类组分，以及六味地黄汤总提取物脂溶性组分。
上述原料药的优化比例是：熟地黄、山茱萸（制）、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比组成。
上述原料药中，所述的地黄、山茱萸及山药可以分别选择生品；也可分别选择制品（炮制品）。
（1）水煎液的制备：
将由熟地黄、山茱萸（制）、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3处方投料，水煎煮2次，同时回收挥发油，合并水煎液，水煎液浓缩至清膏，清膏的相对密度：1.10～1.25（50℃），药渣备用；
（2）挥发油β-环糊精包合物组分的制备：
采用β-环糊精饱和水溶液法包合六味地黄汤总提取物的挥发油，将六味地黄汤总提取物的挥发油缓缓滴入β-环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏（4℃）静置48小时后抽滤， 40℃干燥，即得挥发油β-环糊精包合物组分。
（3）水煎液的乙醇沉淀：
将步骤（1）中的清膏中加入乙醇并不断搅拌至乙醇浓度为70%，冷藏（4℃）静置48小时，分离得到上清液和沉淀；
（4）多糖组分的制备：
将步骤（3）中的沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为1万的超滤膜过滤，除去相对分析量低于1万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量1万～5万分子量的物质，喷雾干燥得到多糖组分；
（5）糖苷类组分的制备：
将步骤（3）中的上清液经大孔树脂柱层析，依次以水、20%、40%、65%乙醇的梯度洗脱，分别收集流分，合并40%和65%乙醇部分浓缩至无醇味，喷雾干燥得到糖苷类组分；
（6）脂溶性组分的制备：
将步骤（1）中的药渣干燥后，加入乙醇回流提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇，浓缩至无醇味后，喷雾干燥得到脂溶性组分；
（7）六味地黄汤总提取物的制备：
将步骤（4）中多糖组分、步骤（5）中糖苷类组分、步骤（6）中脂溶性组分及步骤（2）中的挥发油β-环糊精包合物组分混合，即得六味地黄汤总提取物组合物。
以上组合物的进一步限定，具有以下特征：
⑴．六味地黄汤总提取物组合物的红外图谱的特征峰：IR 
(cm-1)：3396、2926、2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714、573；或者，
六味地黄汤总提取物组合物的二阶导数（Second Derivative，简称SD，下同）红外光谱的特征峰：SD-IR
(600～1800cm-1)：1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、1154、1077、1027、794、768、742、715；
⑵．六味地黄汤提取物的多糖组分（部位A）的红外光谱的特征峰：IR
(cm-1)：3400、2930、1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527；或者，
六味地黄汤提取物的多糖组分（部位A）的二阶导数红外光谱的特征峰：SD-IR
(600～1800cm-1)：1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、1153、1125、1106、1079、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604；
⑶．六味地黄汤提取物中糖苷类组分（部位B）的红外图谱的特征峰：IR
(cm-1)：3398、2934、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627；或者，
六味地黄汤提取物中糖苷类组分（部位B）的二阶导数红外光谱的特征峰：SD-IR
(600～1800cm-1)：1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、1349、1316、1280、1202、1176、1119、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、767、741、715；
⑷．六味地黄汤提取物脂溶性组分（部位C）的红外图谱的特征峰：IR(cm-1)：3391、2928、1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422；或者，
六味地黄汤提取物脂溶性组分（部位C）的二阶导数红外光谱的特征峰：SD-IR
(600～1800cm-1)：1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、1195、1150、1105、1079、1054、1026、977、962、917、891、865、817、799、779、700、673、661、631。
以上所述的本组合物的图谱特征，是指：同类组合物的图谱，其相似度不小于0.85。
换言之，以上组合物的图谱特征是：
⑴．六味地黄汤总提取物组合物的红外指纹图谱符合：A，图8 六味地黄汤提取物组合物的红外光谱图，其相似度不小于0.85；或B，图9 六味地黄汤提取物组合物的二阶导数红外光谱图；
⑵．六味地黄汤提取物的多糖组分的红外图谱符合：A，图2 六味地黄汤提取物的多糖组分（部位A）的红外光谱图；或B，图3 六味地黄汤提取物的多糖组分（部位A）的二阶导数红外光谱图；
⑶．六味地黄汤提取物中糖苷类组分的红外图谱符合：A，图4 六味地黄汤提取物中糖苷类组分（部位B）的红外光谱图；或B，图5 六味地黄汤提取物中糖苷类组分（部位B）的二阶导数红外光谱图；
⑷．六味地黄汤提取物脂溶性组分的红外图谱符合：A，图6 六味地黄汤提取物脂溶性组分（部位C）的红外光谱图；或B，图7 六味地黄汤提取物脂溶性组分（部位C）的二阶导数红外光谱图。
本发明通过对传统的六味地黄汤进行科学的处理，在中医整体观理论的指导下，保持原六味地黄汤各药药效的基础上，增加了六味地黄中脂溶性的有效部位。如前文“背景技术”所述：茯苓活性多糖的分子量为3.8×104左右，山茱萸多糖的分子量为2.47×104左右，牡丹皮降血糖的活性多糖的分子量为1.3×104左右，可见六味地黄活性多糖部位的分子量多集中在1万～5万之间；因此本方法采用超滤法提取精制了六味地黄1万～5万分子量的活性多糖类部位。本方法采用大孔树脂柱层析法提取精制了六味地黄中的糖苷类活性成分，大大降低了六味地黄汤的使用体积。
完成本申请第2个发明任务的方案是：上述六味地黄汤总提取物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）水煎液的制备：
将由熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3处方投料，水煎煮，同时回收挥发油，合并水煎液，水煎液浓缩至清膏，药渣备用；
（2）挥发油β-环糊精包合物组分的制备：
采用β-环糊精饱和水溶液法包合六味地黄汤总提取物的挥发油，将六味地黄汤总提取物的挥发油缓缓滴入β-环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏静置后抽滤，干燥，即得挥发油β-环糊精包合物组分。
（3）水煎液的乙醇沉淀：
将步骤（1）中的清膏中加入乙醇并不断搅拌至乙醇重量比浓度为70%，冷藏静置，分离得到上清液和沉淀；
（4）多糖组分的制备：
将步骤（3）中的沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为1万的超滤膜过滤，除去相对分析量低于1万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量1万～5万分子量的物质，喷雾干燥得到多糖组分；
（5）糖苷类组分的制备：
将步骤（3）中的上清液经大孔树脂柱层析，依次以水、不同浓度的乙醇的梯度洗脱，分别收集流分，合并乙醇部分浓缩至无醇味，喷雾干燥得到糖苷类组分；
（6）脂溶性组分的制备：
将步骤（1）中的药渣干燥后，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至无醇味后，喷雾干燥得到脂溶性组分；
（7）六味地黄汤总提取物的制备：
将步骤（4）中多糖组分、步骤（5）中糖苷类组分、步骤（6）中脂溶性组分及步骤（2）中的挥发油β-环糊精包合物组分混合，即得六味地黄汤总提取物组合物。
除了以上所述的步骤以外，为提高制备工艺过程的可控性、中间体与成品的质量其稳定性，在工艺中还可以增加制药上可接受的辅料等步骤。
以上方案更具体和更优化地说：
步骤（1）中，所述的水煎液是水煎煮2次；所述的水煎液浓缩至清膏，是浓缩至清膏50℃的相对密度：1.10～1.25；
步骤（2）中，所述的冷藏，是指4℃冷藏静置48小时；所述的干燥，是在40℃干燥；
步骤（3）中，水煎液的乙醇沉淀：所述的冷藏，是指4℃冷藏静置48小时；
步骤（5）中，所述的梯度洗脱，是依次以水、重量比浓度20%、40%、65%的乙醇的梯度洗脱，分别收集流分，合并重量比浓度40%和65%乙醇部分；
步骤（6）中，所述的乙醇回流提取，是指乙醇回流提取2次，每次1小时，合并滤液，再回收乙醇，浓缩。
本发明六味地黄汤提取物制备工艺流程见图1。
具体来讲，将六味地黄处方中的六味药以8:4:4:3:3:3的比例投料，水煎煮2次，同时回收挥发油，过滤，合并水煎液，将水煎液浓缩至清膏，清膏的相对密度：1.10 ~1.25（50℃），药渣备用。β-环糊精制成饱和水溶液后，将挥发油缓缓滴入β-环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏（4℃）静置48小时后抽滤，40℃干燥，即得挥发油β-环糊精包合物。清膏中加入乙醇并不断搅拌至乙醇浓度为70%，冷藏（4℃）静置48小时，分离得到上清液和沉淀；沉淀经过多次醇沉处理后，沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为1万的超滤膜过滤，除去相对分析量低于1万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量1万～5万分子量的物质，喷雾干燥得到部位A。将上清液浓缩回收乙醇后，经大孔树脂柱层析，依次以水、20%、40%和65%乙醇的梯度洗脱，分别收集洗脱液，水和20%乙醇部分弃去，合并40%和65%乙醇部分，浓缩后喷雾干燥或冷冻干燥后得到部位B。药渣干燥后，加入乙醇回流提取2次，过滤，合并滤液，浓缩回收乙醇后，喷雾干燥得到部位C。将A、B、C部位及挥发油环糊精包合物合并，即为六味地黄汤总提取物。
根据本发明六味地黄汤提取物的多糖组分（部位A）主要由1万～5万分子量多糖成分组成。
根据本发明六味地黄汤提取物中糖苷类组分（部位B）主要由糖苷类成分组成。
根据本发明六味地黄汤提取物脂溶性组分（部位C）主要由脂溶性成分组成。
完成本申请第3个发明任务的方案分别是：
上述六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的心脏并发症的药物中的应用。
上述六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的脑并发症的药物中的应用。
上述六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的睾丸并发症的药物中的应用。
六味地黄汤的治疗新适应症和新靶点：
六味地黄汤的应用十分广泛，销售量很大，与之相比较，对临床适应症和药理学的研究显得十分不足，主治不明，机制不清。临床大量使用与药理学研究与当代分子生物学和生物医学的研究脱节。因此，对它的药理作用认识，和对疾病的主治，作用主要靶点应予以深入研究。
剧烈的应激性（体力性或精神性）常导致心脏功能突然恶化，血管功能损害，脑损害，短时间内会严重损害机体，危及生命。阻断急性严重的应激反应引起的心脑血管病变，是保障人民健康的重要措施。
另外，中老年人群中，男性性功能低下的发病高， 呈现增长趋势。在急性紧张的状态下， 对睾丸的性激素生成会出现明显的抑制状态，血中性激素含量明显降低。提示：对男性健康明显影响。尼日利亚军队报道，紧张的军事训练，能使男性士兵的血中睾酮的含量明显降低， 证明过于繁重的军事训练，会损害睾丸的功能。
应激状态是一种复杂的病理生理状态。包含体内活性氧类(reactive oxygen species， ROS)的生成和释放量大大增加。体内氧自由基的生成有多种来源，其中，NADPH氧化酶的激活是最重要来源。 六味地黄汤的“三补三泄”的药理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，从而，可减少内质网应激分子，减轻无叠合蛋白质反应（Unfolded protein response，UPR）； 我们发现：六味地黄汤治疗应激反应的多种并发症，主要在于抑制NADPH氧化酶的活性。
近年来发现，无折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）增多的早期，它是补偿性反应，随着病情发展，内质网应激分子不断增加，细胞核转录生成的炎性物质和促炎性物质愈来愈多。最终细胞无法克服，导致细胞死亡。蛋白质中肽链要进行-SH， -SH 键的缩合，形成3 度空间的立体构象，才获得生物活性。蛋白质的叠合反应对氧自由基十分敏感，过多氧自由基干扰蛋白质的叠合反应。应激反应通过激活NADPH氧化酶活性，使ROS生成急剧上升，诱发内质网应激，细胞遭受严重的伤害。六味地黄汤通过阻断NADPH氧化酶的激活，抑制内质网应激，使应激性病变明显缓解或完全抑制。六味地黄汤阻断NADPH氧化酶，就有可能制止严重应激性心、脑等损害的发生，或是明显缓解。
六味地黄汤缓解应激性反应的心血管并发症，由于抑制NADPH 氧化酶：
NADPH氧化酶在病理条件下，成为生成ROS的主要来源。NADPH氧化酶的结构，可分为二大部分：催化亚单位：NOX2， NOX4，等，和调控亚单位： p22phox，p47phox， p67phox，等。 应激状态，以及糖尿病，NADPH氧化酶被高度激活，产生众多ROS，造成组织损害； 应激性反应引起：心肌病，血管病，肾病，睾丸病和脑病。NADPH氧化酶是六味地黄汤的主要的靶点，由NADPH氧化酶激活所介导的诸多疾病，六味地黄汤均可有效。
NADPH氧化酶的激活，还会引起内质网应激(ER stress）。内质网功能之一，合成具有生物活性的蛋白质。如有较多ROS存在，蛋白质无法正常地叠合，或错误叠合，生成的蛋白质无活性。称之为无蛋白质叠合反应（UPR）。此时，内质网和细胞核间的对话异常，生成大量ER stress 的分子，如PERK，Bip，CHOP，等，促使大量生成炎症因子，或促炎症因子。引起细胞凋亡，细胞死亡，出现心血管病，脑病，肾病，睾丸病等。引起ER 应激的主要机制， 是由于NADPG氧化酶的激活。
本发明，首次发现六味地黄汤对NADPH氧化酶的很强阻断作用，是它的药理作用基础， 对抗应激性和糖尿病和它的并发症。本发明使用工具药选择性NADPH氧化酶阻断剂乙酰香草素（APO）作为阳性对照， APO只是在药理学研究中的一种工具药，APO不是临床使用的药物。 用它对比只是说明：六味地黄汤制剂的药效是通过阻断NADPH氧化酶的机制。六味地黄汤制剂的作用于APO相仿，证明通过同一作用机制。这是首次证明六味地黄汤制剂所具有的作用和机制。因此， 六味地黄汤制剂可抑制氧自由基产生的源头， 以及可控制所有氧自由基损害所形成的病变。
通过六味地黄汤的治疗，对很强的应激性反应中，抑制激活的NADPH氧化酶，对抗内质网应激，使器官的各项观察指标，均回到或接近正常的状态。
疗效实例：
抑制NADPH氧化酶，治疗应激性心肌损害。
SD大鼠，异丙肾上腺素注射引起应激性心肌损害，心力衰竭。用新工艺制作的六味地黄汤制剂给药治疗，模型组和治疗组皮下注射异丙肾上腺素1mg/kg，每天一次，给药10天；第6天至第10天，治疗组分别给药乙酰香草素（皮下注射，10mg/kg）或六味地黄汤制剂，在0.5% CMC-Na制成混悬液灌胃，二个剂量组：1.2g/kg，和2.4g/kg。正常组皮下注射生理盐水。第11天乌拉坦麻醉，手术做心内插管，测血流动力学，和心肌中肌浆网的钙调控蛋白，等观察糖尿病心肌病对心功能，心肌氧化应激，肌浆网钙调控蛋白的影响，和APO，六味地黄汤制剂的治疗作用。
方法：
40只清洁级SD大鼠随机分为5组：正常组，使用异丙肾上腺素制作应激性损伤的病理模型组(ISO,sc,1mg/kg，10 天)，乙酰香草素（Apocynin，APO）选择性阻断NADPG氧化酶为阳性药治疗组(APO, sc, 10mg/kg,5天)，六味地黄汤的中、高剂量组（1.2g/kg（LM）， 2.4g/kg（LH）六味地黄汤的干浸膏），分别相当于生药材7g/kg和14g/kg）。正常组皮下注射生理盐水，模型组第6-10天以0.5%CMC-Na溶液灌胃。
主要结果（举例）：
一、治疗应激性心肌损害：
1. 抑制心肌中氧化应激：
黄嘌呤氧化酶（XOD）（A）活性，MDA（B）和iNOS（C）在糖尿病心肌病中升高，六味地黄汤的二个剂量，均使明显降低，与选择性NADPH氧化酶抑制剂APO一致。(数据： mean ± S.D., n = 6. **P<0.01 vs. 正常组， # P<0.05, ## P<0.01 vs. ISO 应激性损害的未治疗组，下同l。
2. 恢复应激性损害的心功能：
见图12-A~图12-D： LM， LH， 为六味地黄汤的中，高二个组。糖尿病组的 LVSP（A），LV+dp/dtmax（B），LV-dp/dtmin （C）降低， LVEDP 上升（D）； 六味地黄汤使恢复到正常状态，与APO的作用相同。
3. 恢复心肌中钙调控蛋白FKBP12.6（稳钙蛋白）（A），及CAQS2 (储钙蛋白)（B）：见图13-A、13-B）：
4. 抑制应激反应引起的心肌的内质网应激：
见图14-A、图14-B）：心肌中内质网应激分子PERK 上调：mRNA(A), 蛋白（B）， 六味地黄汤抑制内质网应激，使恢复到正常， 与APO一致。
5. 修复心肌细胞间的隙缝蛋白的通信连接：
见图15-A、15-A B）： 心肌细胞间的隙缝连接蛋白Cx43（connexin 43）在应激性心脏损伤时，明显降低：mRNA (A), 蛋白（B）。细胞间通信不畅，构成心功能损害的重要病理改变之一。大剂量的六味地黄汤的恢复Cx43的药效与APO相同。
6. 抑制心肌中NADPH氧化酶：
见图16-A~图16-D）： 应激性心肌病变中， NADPH氧化酶明显激活，六味地黄汤很明显的抑制NADPH氧化酶p22phox 的 mRNA 和蛋白表达，作用于APO 相仿。
7. 恢复心脏中基质金属蛋白酶的正常表达：
见图17-A~图17-D）， 应激性心肌损害，使心肌中MMP2、9 （基质金属蛋白2，9） 明显上调，使心肌细胞的胶质组分降解大增，损伤心肌细胞的组分，功能和形态，出现心功能降低。 六味地黄汤的二个剂量组， 使明显恢复， 与APO的效果相近。
二、治疗应激性脑损害
应激性脑损害， 容易出现脑中风， 脑组织损害，坏死等严重事件。六味地黄汤能有效地对抗应激性脑损害：
1. 抑制脑内氧化应激：
应激性脑损伤时， 脑内MDA，和iNOS 增多，构成氧化应激。 六味地黄汤对应激性氧化应激具有很强的抑制作用。见图18-A、图18-B： MDA（A）， iNOS（B）。作用与APO相同。
2. 抑制脑内NADPH氧化酶：
应激时，脑内NADPH氧化酶显著上调，六味地黄汤二个剂量， 均有效地使恢复到正常状态，药效与APO相同。见图19-A、图19-B：
3. 抑制脑细胞的内质网应激
与正常组相比，ISO组引起很强的应激反应时，脑组织中PERK mRNA（左）和蛋白（右）明显上调。 经APO、六味地黄汤中剂量和高剂量干预后，PERK mRNA及蛋白恢复到正常水平。见图20-A、图20-B。
4. 调控脑内基质金属蛋白酶：
反映在应激反应中的脑损害， 脑组织的细胞中胶原成分降解增速，表现为MMP2(A,B)， MMP9(C,D) 的mRNA和蛋白上调。 经六味地黄汤和APO的治疗，把异常的表达降到正常。见图21-A~图21-D。
5. 调控脑内的内皮素受体A （ETAR）：
ISO组（应激组）中脑组织中ETAR 的mRNA和蛋白，表达均明显上升。ETAR 与ROS偶联，ETAR的作用有NADPH 氧化酶所介导。 ETAR参与脑内应激反应，和损害。 经APO、六味地黄汤中剂量和高剂量干预后，ETAR 的mRNA（左）和蛋白（右）表达均下降到正常范围。 消除对脑细胞的损害。见图22-A、图22-B。
6. 脑内细胞间的缝隙信息沟通：
脑内的神经元间由突触的联系沟通信息。 另方面，在神经元间，和神经元和胶质细胞间，以及胶质细胞间的信息沟通，尚可经细胞间的缝隙的接触，而实现小分子，水分，离子，和其他活性小分子的沟通和交换。此功能对维护脑的正常功能起到重要的作用。 在这一家属中， Cx40 （左）， Cx43 （右）的蛋白都下调，提示：有脑功能的障害。六味地黄汤二个剂量和APO 使明显改善它们的表达。见图23-A、图23-B。
三、六味地黄汤治疗应激性睾丸损害：
1. 低睾酮血症、及高FSH和LH水平：
大鼠sc ISO1mg/kg, 10 天，在6-10天给药干预5天： 六味地黄汤中，高二个剂量，及用APO 做阳性对照同前。 下丘脑-垂体-睾丸轴的功能，在ISO的应激反应中， 出现明显的性功能障碍。 低睾酮血症， 同时，血中 FSH，和 LH 降低。经过六味地黄汤治疗后，明显提高睾酮，恢复了正常的FSH，LH。见图24-A、图24-B、图24-C。 左, 血清睾酮； 右,血清FSH; 下, 血清LH。
2. 睾酮生物合成的相关基因表达异常：
StAR、P450scc和3β-HSD是胆固醇转化为睾酮的三个重要基因和相应的蛋白， 我们评价了它们的基因mRNA表达，发现ISO 诱导的应激反应中，大鼠睾丸StAR、P450scc和3β-HSD的mRNA表达明显下降(P<0.01)， 与血中睾酮含量降低一致，表明应激反应可导致 大鼠的睾酮生物合成体系的破坏。六味地黄汤和APO治疗后，有效恢复三个基因的表达水平(P<0.01) 见图25-A、图25-B、图25-C。
3. 睾丸中内质网应激分子PERK的蛋白表达上调：
ISO诱导的应激反应，损伤大鼠睾丸的捏分泌功能，病变睾丸的PERK基因及蛋白的水平显著增强(P<0.01)。六味地黄汤和APO治疗，可以有效减少PERK基因及其蛋白的表达水平(P<0.01) 见图26。
4. 睾丸NADPH氧化酶激活：
NADPH氧化酶是睾丸ROS的一个重要来源，亚基的过表达可提示其活性增强。注射ISO后，大鼠病变的睾丸组织中发生明显的氧化应激现象， 其中p22phox， p47phox 和 p67phox 蛋白表达的水平明显上调 (P<0.01)。经过六味地黄汤和APO治疗后，NADPH氧化酶的各亚型 恢复正常。见图27-A、图27-B、图27-C。
5. Cx40及Cx43下调：
ISO 诱导应激性损伤大鼠睾丸病变中， Cx40 及Cx43 mRNA表达明显下调 (P<0.01) ，表明睾丸细胞间的信号交流收到干扰。经过六味地黄汤和APO治疗后，恢复了Cx40 及Cx43的信息交流。见图28-A、图28-B。
本发明克服了现有技术忽略六味地黄汤总提取物脂溶性有效成分的不足，通过提取工艺，得到六味地黄汤总提取物的更完备的组分构成，并使得采用这种组合物治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸等并发症成为可能。
附图说明
图1 为六味地黄汤提取物制备工艺流程图；
图2 为六味地黄汤提取物的多糖组分（部位A）的红外光谱图；
图3 为六味地黄汤提取物的多糖组分（部位A）的二阶导数红外光谱图；
图4 为六味地黄汤提取物中糖苷类组分（部位B）的红外光谱图；
图5 为六味地黄汤提取物中糖苷类组分（部位B）的二阶导数红外光谱图；
图6 为六味地黄汤提取物脂溶性组分（部位C）的红外光谱图；
图7 为六味地黄汤提取物脂溶性组分（部位C）的二阶导数红外光谱图；
图8 为六味地黄汤提取物组合物的红外光谱图；
图9 为六味地黄汤提取物组合物的二阶导数红外光谱图；
图10为10批次六味地黄汤提取物的红外光谱叠加图谱；
附图中的纵坐标是吸光度（A）。
图11~图28为本发明治疗效果测试结果的柱状图。
具体实施方式
实施例1：六味地黄汤提取物的制备
将六味地黄汤中熟地黄、山茱萸（制）、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3比例投料（共1680g），加入10倍量水，浸泡3h，煎煮两次，同时回收挥发油，每次30min，用纱布过滤，减压浓缩至清膏，清膏的相对密度为1.10～1.25（50℃），过滤后剩余的药渣备用；β-环糊精制成饱和水溶液后，将挥发油缓缓滴入β-环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏（4℃）静置48小时后抽滤，40℃干燥，即得挥发油β-环糊精包合物（5.76g）。清膏中加入乙醇并不断搅拌至乙醇的量为70%，将其置于冰箱4℃下冷藏48小时后，分离得到上清液和沉淀，沉淀用70%乙醇洗涤3次；沉淀除醇，沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为1万的超滤膜过滤，除去相对分析量低于1万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量1万～5万分子量的物质，喷雾干燥得到部位A（108.24g）。合并上清液减压浓缩至清膏，经过D101大孔树脂柱层析，按照每千克生药采用1.5Kg的大孔树脂的比例上样，然后用水、20%乙醇、40%乙醇和65%乙醇依次洗脱，水和20%乙醇洗脱液弃去，合并40%乙醇和65%乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥得到部位B（16.35g）。药渣干燥后，加入5倍量乙醇回流提取2次，1小时/次，过滤，合并滤液，浓缩回收乙醇后，喷雾干燥得到部位C（19.73g）。合并A、B、C及挥发油β-环糊精包合物，得到六味地黄汤总提取物。六味药植物来源为中国药典所规定的品种。
实施例2，与实施例1基本相同，但有以下改变：原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10.4：5.2：5.2：3.9：3.9：3.9的重量比组成，原料药中，所述的地黄、山茱萸及山药是选择生品。
实施例3，与实施例1基本相同，但有以下改变：原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照7.6：2.8：2.8：2.1：2.1：2.1的重量比组成，原料药中，所述的地黄、山茱萸及山药是选择制品。
实施例4，与实施例1基本相同，但有以下改变：原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10.4：2.8：5.2：2.1：3.9：2.1的重量比组成，原料药中，所述的地黄、山茱萸是选择制品；山药是选择生品。
实施例5，与实施例1基本相同，但有以下改变：原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照7.6：5.2：2.8：：3.9：2.1：3.9的重量比组成，原料药中，所述的山茱萸是选择制品；地黄及山药是选择生品。
实施例6，与实施例1基本相同，但有以下改变：原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10.4~7.6：5.2~2.8：3.9~2.1：3.9~2.1：3.9~2.1：3.9~2.1的重量比组成，原料药中，所述的地黄、山茱萸及山药是选择生品；或是选择制品。
实施例7，与实施例1基本相同，但有以下改变：原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10.4：5.2：3.9：2.1：2.1：2.1的重量比组成。
实施例8，与实施例1基本相同，但有以下改变：原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照7.6：2.8：2.1：3.9：3.9：3.9的重量比组成。
六味地黄汤提取物的红外测定
采用Perkin Elmer公司的FTIR傅里叶变换红外光谱仪，运用KBr压片法测定得到各有效部位的红外光谱图。
各有效部位的红外光谱图采用Perkin Elmer公司Spectrum v6.0操作软件（平滑点数为13）得到各有效部位的二阶导数光谱图。
通过采用红外光谱软件对10批六味地黄汤提取物的红外光谱扫描数据进行相似度计算处理，最终所得的10批六味地黄汤提取物组合物的红外光谱叠加图谱（如图10），以六味地黄汤提取物（批号：10111001）为参考，其余六味地黄汤提取物红外光谱图的相似度值见表，结果表明不同批次六味地黄汤提取物的相似度值均大于0.85，表明该制备工艺比较稳定。
六味地黄汤提取物红外光谱图的相似度表
| 批号 | 相似度 |
| 10111001 | 1 |
| 10111002 | 0.9901 |
| 10111003 | 0.9843 |
| 10111004 | 0.9822 |
| 10111005 | 0.9784 |
| 10111006 | 0.9571 |
| 10111007 | 0.9426 |
| 10111008 | 0.9275 |
| 10111009 | 0.9247 |
| 10111010 | 0.8576 |
Claims (6)
1.一种六味地黄汤总提取物组合物，其特征在于，原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10.4～7.6：5.2～2.8：5.2～2.8：3.9～2.1：3.9～2.1：3.9～2.1的重量比组成，所述的组合物中包括有：六味地黄汤总提取物挥发油β-环糊精包合物组分，六味地黄汤总提取物多糖组分，六味地黄汤总提取物糖苷类组分，以及六味地黄汤总提取物脂溶性组分；
所述的组合物具有以下特征：
⑴.六味地黄汤总提取物组合物的红外光谱的特征峰：
cm-1：3396、2926、2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714、573；或者，
六味地黄汤总提取物组合物的二阶导数红外光谱的特征峰：
cm-1：1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、1154、1077、1027、794、768、742、715；
⑵.六味地黄汤提取物的多糖组分的红外光谱的特征峰：
cm-1：3400、2930、1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527；或者，
六味地黄汤提取物的多糖组分的二阶导数红外光谱的特征峰：
cm-1：1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、1153、1125、1106、1079、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604；
⑶.六味地黄汤提取物中糖苷类组分的红外图谱的特征峰：
cm-1：3398、2934、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627；或者，
六味地黄汤提取物中糖苷类组分的二阶导数红外光谱的特征峰：
cm-1：1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、1349、1316、1280、1202、1176、1119、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、767、741、715；
⑷.六味地黄汤提取物脂溶性组分的红外图谱的特征峰：
cm-1：3391、2928、1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422；或者，
六味地黄汤提取物脂溶性组分的二阶导数红外光谱的特征峰：
cm-1：1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、1195、1150、1105、1079、1054、1026、977、962、917、891、865、817、799、779、700、673、661、631；
所述的组合物是指通过以下方法制备得到的组合物：
（1）水煎液的制备：
将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3处方投料，水煎煮，同时回收挥发油，合并水煎液，水煎液浓缩至清膏，药渣备用；
（2）挥发油β-环糊精包合物组分的制备：
采用β-环糊精饱和水溶液法包合六味地黄汤总提取物的挥发油，将六味地黄汤总提取物的挥发油缓缓滴入β-环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏静置后抽滤，干燥，即得挥发油β-环糊精包合物组分；
（3）水煎液的乙醇沉淀：
将步骤（1）中的清膏中加入乙醇并不断搅拌至乙醇重量比浓度为70%，冷藏静置，分离得到上清液和沉淀；
（4）多糖组分的制备：
将步骤（3）中的沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为1万的超滤膜过滤，除去相对分子量低于1万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量1万～5万分子量的物质，喷雾干燥得到多糖组分；
（5）糖苷类组分的制备：
将步骤（3）中的上清液经大孔树脂柱层析，依次以水、20%、40%、65%乙醇的梯度洗脱，分别收集流分，合并40%和65%乙醇部分浓缩至无醇味，喷雾干燥得到糖苷类组分；
（6）脂溶性组分的制备：
将步骤（1）中的药渣干燥后，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至无醇味后，干燥得到脂溶性组分；
（7）六味地黄汤总提取物组合物的制备：
步骤（2）中的挥发油β-环糊精包合物组分、步骤（5）中糖苷类组分及步骤（6）中脂溶性组分混合，按适当比例与步骤（4）中多糖组分混合制粒，干燥，压片或灌封胶囊，即得六味地黄汤总提取物组合物；
步骤（1）中，所述的水煎液是水煎煮2～3次；所述的水煎液浓缩至清膏，是浓缩至清膏50℃的相对密度：1.10～1.25；
步骤（2）中，所述的冷藏，是指4℃冷藏静置12～48小时；所述的干燥，是在30～60℃干燥；
步骤（3）中，水煎液的乙醇沉淀：所述的冷藏，是指4℃冷藏静置12～48小时；
步骤（5）中，所述的梯度洗脱中的固定相为制药上可接受的大孔树脂；梯度洗脱是依次以水、重量比浓度20%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；用40%～75%的乙醇梯度洗脱，收集流分，合并洗脱液；
步骤（6）中，所述的乙醇回流提取，是指乙醇回流提取2次，每次1小时，合并滤液，再回收乙醇，浓缩。
2.权利要求1所述的六味地黄汤总提取物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）水煎液的制备：
将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3处方投料，水煎煮，同时回收挥发油，合并水煎液，水煎液浓缩至清膏，药渣备用；
（2）挥发油β-环糊精包合物组分的制备：
采用β-环糊精饱和水溶液法包合六味地黄汤总提取物的挥发油，将六味地黄汤总提取物的挥发油缓缓滴入β-环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏静置后抽滤，干燥，即得挥发油β-环糊精包合物组分；
（3）水煎液的乙醇沉淀：
将步骤（1）中的清膏中加入乙醇并不断搅拌至乙醇重量比浓度为70%，冷藏静置，分离得到上清液和沉淀；
（4）多糖组分的制备：
将步骤（3）中的沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为1万的超滤膜过滤，除去相对分子量低于1万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量1万～5万分子量的物质，喷雾干燥得到多糖组分；
（5）糖苷类组分的制备：
将步骤（3）中的上清液经大孔树脂柱层析，依次以水、20%、40%、65%乙醇的梯度洗脱，分别收集流分，合并40%和65%乙醇部分浓缩至无醇味，喷雾干燥得到糖苷类组分；
（6）脂溶性组分的制备：
将步骤（1）中的药渣干燥后，加入乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至无醇味后，喷雾干燥得到脂溶性组分；
（7）六味地黄汤总提取物组合物的制备：
步骤（2）中的挥发油β-环糊精包合物组分、步骤（5）中糖苷类组分及步骤（6）中脂溶性组分混合，按适当比例与步骤（4）中多糖组分混合制粒，干燥，压片或灌封胶囊，即得六味地黄汤总提取物组合物；
步骤（1）中，所述的水煎液是水煎煮2～3次；所述的水煎液浓缩至清膏，是浓缩至清膏50℃的相对密度：1.10～1.25；
步骤（2）中，所述的冷藏，是指4℃冷藏静置12～48小时；所述的干燥，是在30～60℃干燥；
步骤（3）中，水煎液的乙醇沉淀：所述的冷藏，是指4℃冷藏静置12～48小时；
步骤（5）中，所述的梯度洗脱中的固定相为制药上可接受的大孔树脂；梯度洗脱是依次以水、重量比浓度20%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；用40%～75%的乙醇梯度洗脱，收集流分，合并洗脱液；
步骤（6）中，所述的乙醇回流提取，是指乙醇回流提取2次，每次1小时，合并滤液，再回收乙醇，浓缩。
3.权利要求1所述的六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的心脏并发症的药物中的应用。
4.权利要求1所述的六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的脑并发症的药物中的应用。
5.权利要求1所述的六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的睾丸并发症的药物中的应用。
6.根据权利要求3-5之一所述的六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗应激性反应的心脏、脑、睾丸并发症的药物中的应用，其特征在于，大鼠实验中的用量为：中剂量组：1.2g/kg六味地黄汤的干浸膏；高剂量组：2.4g/kg六味地黄汤的干浸膏，分别相当于生药材7g/kg和14g/kg。
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