发明内容
本发明目的在于提供一种药物组合物的质量检测方法;本发明的另一目的在于提供一种治疗脑中风及脉管炎的药物组合物的质量检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的:
本发明质量检测方法包括如下指纹图谱检测:
色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:C18柱;流动相为0.01%~0.5%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占0.5-1.5%时开始以线性梯度方式洗脱,经55min~65min流动相中乙腈浓度达35%~45%,流动相中乙腈浓度达35%~45%时等度洗脱3~7min后,再以线性梯度方式经3~7min流动相中乙腈浓度达90~98%;流动相中乙腈浓度达90~98%时等度洗脱3~7min,再以线性梯度方式经3~7min回到流动相中乙腈浓度达0.5-1.5%;流动相中乙腈浓度达0.5-1.5%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:0.5ml~1.5ml/min;柱温:25~35℃;检测波长:260-280nm;记录时间:60~70min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.5-1.5mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10-3/10,精密加入30%~70%甲醇30-70ml,称定重量,回流提取20-40min,放至室温,再称定重量,用30%~70%甲醇补足减失的重量,滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1~10μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱。
本发明质量检测方法中指纹图谱检测优选为:
色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:phenomenex luna C18,4.6×150mm,5μm;流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占1%时开始以线性梯度方式洗脱,经60min流动相中乙腈浓度达40%,流动相中乙腈浓度达40%时等度洗脱5min后,再以线性梯度方式经5min流动相中乙腈浓度达95%;流动相中乙腈浓度达95%时等度洗脱5min,再以线性梯度方式经5min回到流动相中乙腈浓度达1%;流动相中乙腈浓度达1%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:1ml/min;柱温:30℃;检测波长:270nm;记录时间:65min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/5,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,回流提取30min,放至室温,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,0.45μm滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱。
本发明质量检测方法中指纹图谱检测优选为:
色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:C18柱;流动相为0.05%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占0.5%时开始以线性梯度方式洗脱,经65min流动相中乙腈浓度达35%,流动相中乙腈浓度达35%时等度洗脱7min后,再以线性梯度方式经7min流动相中乙腈浓度达98%;流动相中乙腈浓度达98%时等度洗脱3min,再以线性梯度方式经3min回到流动相中乙腈浓度达1.5%;流动相中乙腈浓度达1.5%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:0.5ml/min;柱温:35℃;检测波长:260nm;记录时间:70min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的/10,精密加入30%甲醇70ml,称定重量,回流提取20min,放至室温,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各2μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱。
本发明质量检测方法中指纹图谱检测优选为:
色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:C18柱;流动相为0.3%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占1.5%时开始以线性梯度方式洗脱,经55min流动相中乙腈浓度达45%,流动相中乙腈浓度达45%时等度洗脱3min后,再以线性梯度方式经3min流动相中乙腈浓度达90%;流动相中乙腈浓度达90%时等度洗脱7min,再以线性梯度方式经7min回到流动相中乙腈浓度达0.5%;流动相中乙腈浓度达0.5%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:1.5ml/min;柱温:25℃;检测波长:280nm;记录时间:60min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10,精密加入70%甲醇30ml,称定重量,回流提取40min,放至室温,再称定重量,用30%甲醇补足减失的重量,滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱。
上述本发明质量检测方法中指纹图谱检测结果为:一个S参照峰与5个主要峰,相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:S号峰的相对保留时间为1.0000,相对峰面积为1.0000,相对峰面积波动范围为100%;3号峰的相对保留时间为0.3714,相对峰面积为3.5634,相对峰面积波动范围为80%;4号峰的相对保留时间为0.4813,相对峰面积为5.9938,相对峰面积波动范围为180%;8号峰的相对保留时间为1.5077,相对峰面积为0.6483,相对峰面积波动范围为80%;9号峰的相对保留时间为1.5636,相对峰面积为1.9563,相对峰面积波动范围为50%;19号峰的相对保留时间为3.1069,相对峰面积为0.5329,相对峰面积波动范围为70%。
上述本发明质量检测方法中指纹图谱检测的检测结果还可以包括如下14个共有峰:14个共有峰的相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:1号峰的相对保留时间为0.1439,相对峰面积为0.2069,相对峰面积波动范围为80%;2号峰的相对保留时间为0.2683,相对峰面积为0.6317,相对峰面积波动范围为50%;5号峰的相对保留时间为0.5297,相对峰面积为0.3461,相对峰面积波动范围为100%;6号峰的相对保留时间为0.7639,相对峰面积为0.3331,相对峰面积波动范围为80%;7号峰的相对保留时间为1.0534,相对峰面积为0.3478,相对峰面积波动范围为60%;10号峰的相对保留时间为1.6361,相对峰面积为0.3116,相对峰面积波动范围为70%;11号峰的相对保留时间为1.7615,相对峰面积为0.2234,相对峰面积波动范围为60%;12号峰的相对保留时间为1.8127,相对峰面积为0.2044,相对峰面积波动范围为50%;13号峰的相对保留时间为1.8937,相对峰面积为0.1822,相对峰面积波动范围为90%;14号峰的相对保留时间为1.9186,相对峰面积为0.3206,相对峰面积波动范围为40%;15号峰的相对保留时间为2.0238,相对峰面积为0.3489,相对峰面积波动范围为90%;16号峰的相对保留时间为2.2032,相对峰面积为0.4331,相对峰面积波动范围为80%;17号峰的相对保留时间为2.2982,相对峰面积为0.6765,相对峰面积波动范围为60%;18号峰的相对保留时间为2.9360,相对峰面积为0.2716,相对峰面积波动范围为80%。
本发明质量检测方法包括如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种:
鉴别:
A、取本药物组合物日用剂量的1/6-1,研细,用甲醇超声提取1-3次,每次加甲醇40-60体积份提取10-30分钟,合并提取液后过滤,滤液蒸干,加水20-40体积份使溶解,用水饱和正丁醇提取2-4次,每次20-40体积份,合并正丁醇液,用氨试液洗涤1-3次,每次20-40体积份,弃去氨液;将正丁醇液蒸干,残渣加水3-8体积份使溶解,上D-101大孔吸附树脂柱,分别用水40-60体积份洗脱,弃去水液,用30-50%乙醇20-40体积份洗脱,弃去洗脱液,继续用60-80%乙醇40-60体积份洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1-3体积份溶解作为供试品溶液;另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各5-15μl分别点于同一硅胶G薄层板上,以3-7∶0.5-1.5∶2-6比例的正丁醇-醋酸乙酯-水的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5-15%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
B、取本药物组合物日用剂量的1/6-1,研细,加乙醇30-50体积份,加热回流20-40分钟,滤过,滤液蒸至近干,残渣加水5-15体积份使溶解,加5%硫酸-乙醇1∶1混合溶液5-15体积份,加热回流2-4小时,取出,置水浴上蒸至无醇味,用氯仿振摇提取1-3次,每次10-20体积份,合并氯仿液,浓缩至1体积份,作为供试品溶液;另取齐墩果酸对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5-15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以2-6∶1-3∶0.5-1.5比例的环己烷-丙酮-醋酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5-15%磷钼酸乙醇试液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
C、取本药物组合物日用剂量1/6-1,加5~15倍重量份甲醇,加热回流0.5-1.5小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水20-40体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次,每次10-30体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇0.5-1.5体积份使溶解,作为供试品溶液;另取党参对照药材0.5-1.5g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5-15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以5-9∶0.5-1.5∶0.3-0.7正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开16cm,取出,晾干,喷以5-15%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主荧光斑点;
D、取本药物组合物日用剂量1/6-1,加5~15倍重量份甲醇,加热回流0.5-1.5小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水20-40体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次,每次10-30体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇0.5-1.5体积份使溶解,作为供试品溶液;取玄参对照药材0.1-0.3g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液及玄参对照药材溶液各5-15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以5-9∶0.5-1.5∶1-3正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开14cm,取出,晾干,喷以香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点;
E、取本药物组合物日用剂量1/6-1,加5~15倍重量份的甲醇,加热回流0.5-1.5小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水20-40体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次,每次10-30体积份,合并正丁醇液,用0.5-1.5%NaOH振摇提取2-4次,每次10-30体积份,合并碱水液,用稀盐酸调pH值至2-4,用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次,每次10-30体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇0.5-1.5体积份使溶解,作为供试品溶液;另取甘草对照药材0.5-1.5g,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各4-6μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以10-20∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5-15%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
F、取本药物组合物日用剂量1/6-1,加5~15倍重量份甲醇,加热回流0.5-1.5小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水20-40体积份使溶解,用氯仿振摇提取2-4次,每次20-40体积份,合并氯仿提取液,置水浴上浓缩至干,残渣中精密加氯仿至0.5-1.5体积份使溶解,作为供试品溶液;另取滨蒿内酯对照品,加氯仿制成每1ml含0.3mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各5-15μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5醋酸乙酯-氯仿-浓氨溶液的下层溶液为展开剂,展开,展距8cm,取出,吹干,再以1-3∶2-4∶2-4环己烷-氯仿-醋酸乙酯为展开剂,展开,展距18cm,取出,晾干,在365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
含量测定:
G、绿原酸的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,10-20∶70-90∶2-4甲醇-水-冰醋酸为流动相,检测波长为330nm;理论板数按绿原酸计算,应不得低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品适量,置棕色瓶中,加50%甲醇制成每1ml含0.01mg~0.05mg的溶液,作为对照品溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/13-1/5,精密称定,置于50~100体积份容量瓶中,加40-60%甲醇近刻度,提取15~20分钟,放冷,加40-60%甲醇至刻度,以微孔滤膜过滤得供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl,注入液相色谱仪,测定,所得色谱中,应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰;
H、甘草酸铵的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;50-70∶30-40甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相;检测波长为250nm;理论板数按甘草酸峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取甘草酸铵对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,折合甘草酸0.1959mg,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量1/13-1/5,精密称定,置烧瓶中,精密加入10~30倍体积份的60-80%乙醇,称定重量,回流法提取45分钟,放至室温,再称定重量,用60-80%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;甘草酸含量应不低于6~7.2g/日用剂量;
I、木犀草苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相I,以0.4-0.6%冰醋酸溶液为流动相II,进行梯度洗脱;检测波长350nm,理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量,加60-80%乙醇制成每1ml含10μg的溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量1/13-1/5,精密称定,置于容量瓶中,加70%乙醇适量超声使溶解,定容至刻度,以微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液5-15μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;金银花以木犀草苷C21H20O11计,不得少于1.5-1.8mg/日用剂量;;
J、黄芪甲苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;70-90∶20-30甲醇-水为流动相;用蒸发光散射检测器检测;理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量1/13-1/5,精密称定,置烧瓶中,精密加入10~20倍体积份的甲醇超声提取10-30min,滤过,残渣连同滤纸加甲醇10-30体积份,再超声提取10-30min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,浓缩至干,残渣加水10体积份,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取2-4次,每次10-30体积份,合并正丁醇提取液,用氨试液提取1-3次,每次10-30体积份,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液4-6μl、10-30μl与供试品溶液5-15μl,注入液相色谱仪,用外标两点法对数方程计算,即得;黄芪甲苷的含量为含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计,不得少于0.6-0.72mg/日用剂量。
本发明的质量检测方法优选如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种:
鉴别:
A、取本药物组合物日用剂量的1/4,研细,用甲醇超声提取2次,每次加甲醇50体积份提取20分钟,合并提取液后过滤,滤液蒸干,加水30体积份使溶解,用水饱和正丁醇提取3次,每次30体积份,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次30体积份,弃去氨液;将正丁醇液蒸干,残渣加水5体积份使溶解,上D-101大孔吸附树脂柱,分别用水50体积份洗脱,弃去水液,用40%乙醇30体积份洗脱,弃去洗脱液,继续用70%乙醇50体积份洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2体积份溶解作为供试品溶液;另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl分别点于同一硅胶G薄层板上,以5∶1∶4比例的正丁醇-醋酸乙酯-水的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
B、取本药物组合物日用剂量的1/4,研细,加乙醇40体积份,加热回流30分钟,滤过,滤液蒸至近干,残渣加水10体积份使溶解,加5%硫酸-乙醇1∶1混合溶液10体积份,加热回流3小时,取出,置水浴上蒸至无醇味,用氯仿振摇提取2次,每次15体积份,合并氯仿液,浓缩至1体积份,作为供试品溶液;另取齐墩果酸对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以4∶2∶1比例的环己烷-丙酮-醋酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇试液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
C、取本药物组合物日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取党参对照药材1g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶0.5正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开16cm,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主荧光斑点;
D、取本药物组合物日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;取玄参对照药材0.2g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取鉴别C中供试品溶液及玄参对照药材溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶2正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开14cm,取出,晾干,喷以香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点;
E、取本药物组合物日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇液,用1%NaOH振摇提取3次,每次20体积份,合并碱水液,用稀盐酸调pH值至3,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取甘草对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以15∶1∶1∶2乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
F、取本药物组合物日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用氯仿振摇提取3次,每次30体积份,合并氯仿提取液,置水浴上浓缩至干,残渣中精密加氯仿至1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取滨蒿内酯对照品,加氯仿制成每1ml含0.3mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以1∶1∶1醋酸乙酯-氯仿-浓氨溶液的下层溶液为展开剂,展开,展距8cm,取出,吹干,再以2∶3∶3环己烷-氯仿-醋酸乙酯为展开剂,展开,展距18cm,取出,晾干,在365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
含量测定:
G、绿原酸的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,17∶80∶3甲醇-水-冰醋酸为流动相,检测波长为330nm;理论板数按绿原酸计算,应不得低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品,置棕色瓶中,加50%甲醇制成每1ml含0.01mg~0.05mg的溶液,作为对照品溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10,精密称定,置于75体积份容量瓶中,加50%甲醇近刻度,提取18分钟,放冷,加50%甲醇至刻度,以微孔滤膜过滤得供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,所得色谱中,应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰;
H、甘草酸铵的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;64∶36甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相;检测波长为250nm;理论板数按甘草酸峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取甘草酸铵对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,折合甘草酸0.1959mg,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入20倍体积份的70%乙醇,称定重量,回流法提取45分钟,放至室温,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;甘草酸含量应不低于6mg/日用剂量;
I、木犀草苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相I,以0.5%冰醋酸溶液为流动相II,进行梯度洗脱;检测波长350nm,理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1ml含10μg的溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10,精密称定,置于容量瓶中,加70%乙醇适量超声使溶解,定容至刻度,以微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;
金银花以木犀草苷C21H20O11计,不得少于1.5mg/日用剂量;
J、黄芪甲苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;77∶23甲醇-水为流动相;用蒸发光散射检测器检测;理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入15倍体积份的甲醇超声提取20min,滤过,残渣连同滤纸加甲醇20体积份,再超声提取20min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,浓缩至干,残渣加水10体积份,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20体积份,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,用外标两点法对数方程计算,即得;黄芪甲苷的含量为含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14)计,不得少于0.6mg/日用剂量。
本发明药物组合物不同制剂的日用剂量(每日服用剂量或每日使用剂量)因制剂不同而不同,但不同制剂的日用剂量中含相当生药材量相同。本发明质量检测方法以日用剂量为计量单位。
本发明上述质量检测方法中所述的重量份/体积份的关系为g/ml。
本发明所述的质量检测方法中的药物组合物原料药组成为:黄芪400-550重量份、当归400-550重量份、党参400-550重量份、玄参400-550重量份、金银花400-550重量份、石斛400-550重量份、牛膝400-550重量份、甘草400-550重量份。
所述的药物组合物原料药组成优选为:黄芪420重量份、当归530重量份、党参420重量份、玄参530重量份、金银花420重量份、石斛530重量份、牛膝420重量份、甘草530重量份;黄芪530重量份、当归420重量份、党参530重量份、玄参420重量份、金银花530重量份、石斛420重量份、牛膝530重量份、甘草420重量份或黄芪480重量份、当归480重量份、党参480重量份、玄参480重量份、金银花480重量份、石斛480重量份、牛膝480重量份、甘草480重量份。
本发明所述的质量检测方法中的药物组合物由常规方法制备,也可以由如下方法制成:
A、煎煮:将原料药加入多功能提取罐中,加4-6倍量水,加热煎煮0.5-2.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加2-4倍量的水煎煮0.5-1.5小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;
B、浓缩:将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;
C、醇沉:取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达50-70%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;
D、干燥:取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;
E、将干浸膏加入常规辅料,按照常规工艺,制成临床可接受的剂型,包括但不限于浓缩丸剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、片剂、软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。
本发明所述的质量检测方法中的药物组合物薄膜衣片由如下方法制备:
A、煎煮:将原料药加入多功能提取罐中,加4-6倍量水,加热煎煮0.5-2.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加2-4倍量的水煎煮0.5-1.5小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;
B、浓缩:将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;
C、醇沉:取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达50-70%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;
D、干燥:取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;
F、制粒:将干浸膏粉碎,得干浸膏粉,干浸膏粉加1-3%淀粉、0.5-1.5%微粉硅胶,用乙醇作为润湿剂在高效湿法混合制粒机进行制粒,颗粒水分控制在不超过4.5%;
G、整粒:用14目筛摇摆式颗粒机整粒;
H、总混:将颗粒置三维运动混合机中,加0.5-1.5%滑石粉,0.1-0.3%硬脂酸镁,以10-20转/分钟的转速开机混合10分钟;
I、压片:将颗粒压制成片芯重0.36g±4.0%的素片,操作间湿度控制在不超过50%;
J、用水溶性薄膜包衣材料包薄膜衣,包衣材料为胃溶型欧巴代薄膜包衣预混剂,按素片重量的4-5%称取包衣材料即欧巴代;加5-15%的稀乙醇液配制成10-30%的混悬液,连续搅拌40-50分钟,充分搅拌均匀,备用;将素片加入包衣锅内,转动包衣锅用10%-40%的欧巴代混悬液进行喷包,进风温度为25-70℃,出风温度为25-60℃,蠕动泵速度为1.0-20.0转/分;片床温度为25-50℃,包衣锅转速2-15转/分,出片温度在35℃以下,包衣时间4-8小时,在包衣结束后,包衣片干燥,干燥间湿度应控制在50%以内,得临床可接受的薄膜衣片。
本发明质量检测方法新增加了党参、玄参、甘草、黄芪、石斛的TLC定性鉴别方法;甘草酸、木犀草苷、黄芪甲苷的HPLC含量测定方法和含量限度规定。本发明针对本发明药物组合物制成的片剂(通塞脉片)指纹图谱进行了研究,对测定指纹图谱的仪器,色谱柱、流动相、检测波长等条件进行了优选,建立了液相指纹图谱测定条件并进行了方法学考察,根据多批大生产样品制订了通塞脉口服制剂液相指纹图谱标准,在生产过程中可有效的指导投料、严格规范生产操作,真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。
下述实验例和实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明.
实验例1 指纹图谱质量检测方法实验
1、供试品来源
由江苏南星药业有限责任公司提供。
2、供试品溶液的制备
根据通塞脉片的生产工艺,分别考察了水、50%甲醇、甲醇做为提取溶剂,经过综合分析,50%甲醇提取所得供试品溶液能够较全面的反映成品中的主要成分,且重复性较好,所以确定50%甲醇作为提取溶剂;又对提取方法(超声、回流)进行了考察,发现超声提取的供试品指纹图谱基线不如回流提取平稳,最终确定制剂指纹图谱测定供试品制备方法为:取本品5片,除去薄膜衣,研细,取1g细粉,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,回流提取30min,放至室温,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,0.45μm滤膜滤过,取续滤液,即得。
3、参照物溶液的制备
通塞脉片主要有效成分为绿原酸(chlorogenic acid)、木犀草苷(galuteolin)、阿魏酸(ferulic acid)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、哈巴苷(harpagide)、哈巴俄苷(harpagoside)等,经过试验研究,我们选择出峰时间居中、且峰面积适中的绿原酸作为参照物,由中国药品生物制品检定所提供(批号:0753-200111,供含量测定用)。
4、检测方法的建立
4.1仪器、试剂和色谱条件
仪器:Agilent 1100液相色谱;DAD检测器,G1313A全自动进样器,Agilent LC色谱工作站。
试剂:乙腈、甲醇为色谱纯(Tedia company),水为超纯水,其余试剂均为分析纯。
色谱柱:phenomenex luna C18(4.6×150mm 5μm);检测波长:203、220、230、254、260、270、280、300、360nm;进样5~20μl;柱温:30℃;流速:1ml/min。
4.2流动相的选择:
经比较、筛选,发现(A)0.1%磷酸水-(B)乙腈系统以线性梯度洗脱,所得液相色谱图基线较平稳、色谱峰峰形较对称、分离度较好,因此选择0.1%磷酸水-乙腈系统为流动相。
4.3梯度洗脱程序的优化:
经系统摸索、优化,发现如下线性梯度洗脱程序既能较全面的检出制剂中的化学成分,又可使这些成分获得较理想的分离效果:从1%B开始以线性梯度方式经60min达到40%B,40%B等度洗脱5min后,再以线性梯度方式经5min达到95%B,95%B等度洗脱5min,再以线性梯度方式经5min回到1%B,1%B等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序。纪录时间为0~65min。
4.4最佳测定波长的确定:
经液相色谱—紫外光谱3维图谱的比较分析,发现203、230、254nm的制剂图谱中出峰较多,但基线不平,峰形不佳;280、300nm的制剂图谱中基线较平,峰形不错,但出峰较少,不能较全面反映制剂的成分;在270nm下,除已知成分绿原酸、阿魏酸、甘草酸等均能被较好的检出外,其它成分指纹峰分离度也较好,综合考虑色谱峰的数目、基线及信号响应强弱,确定270nm为制剂指纹图谱的最佳检测波长(见附图1~2)。
实验例2 指纹图谱质量检测方法的滞后峰检试验:
为了验证最佳线性梯度洗脱程序是否能较全面的检出制剂中的化学成分,延长测试时间至2.5小时,即:从1%B开始以线性梯度方式经60min达到40%B,40%B等度洗脱90min,纪录时间为0~150min,结果65min之后未见滞后峰出现(见附图3)。说明最佳线性梯度洗脱程序能较全面的检出通塞脉片中的化学成分。
实验例3 指纹图谱质量检测方法的系统适应性试验
不同的仪器,由于梯度曲线质量和滞后时间的不同,可能影响方法的重现性及选择性,通常可通过调整进样和梯度起始时间减少这种影响,必要时可调整梯度程序。所以我们测定了系统梯度滞后时间,方法如下:用一零死体积连接器代替色谱柱,以甲醇为溶剂A,含0.1%丙酮的甲醇为溶剂B,检测波长为260nm,运行0~100%B的线性梯度,梯度时间20分钟,流速1.0ml/mm,记录梯度图形,测定梯度曲线中间点的时间,减去10分钟,即得。
检测结果为1min,可见Agilent 1100 HPLC系统梯度滞后时间较小,基本不影响方法的重现性(见附图4)。
实验例4 指纹图谱质量检测方法的仪器精密度试验
取批号为060405的通塞脉片,按正文方法制备供试品溶液,连续进样5次进行测定,测定结果见附图5,表1、2。
结果表明,供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD<3%),又以第1次进样所得指纹图谱做为参照,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后4次进样所得指纹图谱的相似度,结果相似度均不小于0.99,符合指纹图谱的技术要求(应不小于0.95)。
表1 通塞脉片液相指纹图谱精密度考察结果(主要峰的相对保留时间)
峰号 |
相对保留时间比值 | 平均比值 | RSD% |
第1针 |
第2针 |
第3针 |
第4针 |
第5针 |
s348919 |
10.36980.47961.51081.56723.1202 |
10.36970.47951.51111.56763.1218 |
10.37030.48021.51111.56733.1214 |
10.37030.48011.51011.56633.1193 |
10.37040.48031.50991.56603.1167 |
10.37010.47991.51061.56693.1199 |
0.000.090.070.040.040.07 |
表2 通塞脉片液相指纹图谱精密度考察结果(主要峰的相对峰面积)
峰号 |
相对峰面积比值 | 平均比值 | RSD% |
第1针 |
第2针 |
第3针 |
第4针 |
第5针 |
s348919 |
14.47035.97690.47112.00470.5492 |
14.47885.95830.47512.00170.5477 |
14.49705.96100.47411.98060.5508 |
14.47045.96290.47271.99750.5474 |
14.47855.95390.47081.98250.5478 |
14.47905.96260.47281.99340.5486 |
0.000.240.150.390.560.26 |
以上结果表明,Agilent 1100液相色谱仪的精密度良好。
实验例5 指纹图谱质量检测方法的样品稳定性试验:
取批号为060405的通塞脉片,按正文方法制备供试品溶液,分别于0、1.5、3、6、9、12、18、24、36、48hr考察稳定性,共测10次,测定结果见附图6,表3、4。
结果表明,供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD<3%),又以第1次进样所得指纹图谱作为参照,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后9次进样所得指纹图谱的相似度,结果相似度均不小于0.99,符合指纹图谱的技术要求(应不小于0.95)。
表3 通塞脉片液相指纹图谱稳定性考察结果(主要峰的相对保留时间)
峰号 |
s |
3 |
4 |
8 |
9 |
19 |
相对保留时间比值 |
0hr1.5hr3hr6hr9hr12hr18hr24hr36hr48hr |
1111111111 |
0.36980.36970.37030.37040.37020.37010.37030.37130.37040.3707 |
0.47960.47950.48020.48030.48000.47990.48000.48110.48030.4806 |
1.51081.51111.51111.50991.51031.51101.51071.50851.50851.5086 |
1.56721.56761.56731.56601.56641.56701.56661.56431.56481.5650 |
3.12023.12183.12143.11673.11623.11873.11523.10903.11173.1107 |
平均值RSD(%) |
10.00 |
0.37030.12 |
0.48020.10 |
1.51010.07 |
1.56620.07 |
3.11610.15 |
表4 通塞脉片液相指纹图谱稳定性考察结果(主要峰的相对峰面积)
峰号 |
s |
3 |
4 |
8 |
9 |
19 |
相对峰面积比值 |
0hr1.5hr3hr6hr9hr12hr18hr24hr36hr48hr |
1111111111 |
4.47034.47884.49704.47854.46774.45004.42194.33784.31964.2686 |
5.97695.95835.96105.95395.95365.95965.97005.94646.03666.0450 |
0.47110.47510.47410.47080.46740.44980.46260.45930.45950.4599 |
2.00472.00171.98061.98252.00322.00532.00431.99702.02442.0247 |
0.54920.54770.55080.54780.54700.54750.54940.54830.55260.5534 |
平均值RSD(%) |
10.00 |
4.41901.82 |
5.97610.59 |
0.46501.74 |
2.00280.73 |
0.54940.40 |
以上结果表明,供试品溶液在48小时内测定是稳定的。
实验例6 指纹图谱质量检测方法的方法重复性试验
取批号为060405的通塞脉片,按正文方法平行制备6份供试品溶液,依法测定,测定结果见附图7,表5、6。
结果表明,供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD<3%),又以第1份供试品溶液所得指纹图谱做为参照,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后5份供试品溶液所得指纹图谱的相似度,结果相似度均不小于0.99,符合指纹图谱的技术要求(应不小于0.95)。
表5 通塞脉片液相指纹图谱重复性考察结果(主要峰的相对保留时间)
峰号 |
相对保留时间比值 | 平均值 |
RSD(%) |
第1针 |
第2针 |
第3针 |
第4针 |
第5针 |
第6针 |
s348919 |
10.37010.47981.51071.56663.1185 |
10.37010.48001.51021.56633.1171 |
10.37040.48001.51071.56663.1175 |
10.37040.48011.51051.56653.1150 |
10.37010.48001.51041.56653.1186 |
10.37030.48001.51111.56693.1191 |
10.37020.48001.51061.56663.1176 |
0.000.030.020.020.010.05 |
表6 通塞脉片液相指纹图谱重复性考察结果(主要峰的相对峰面积)
峰号 |
相对峰面积比值 | 平均值 |
RSD(%) |
第1针 |
第2针 |
第3针 |
第4针 |
第5针 |
第6针 |
s348919 |
14.47235.95600.45841.99790.5465 |
14.44825.97550.45601.98000.5488 |
14.43335.96180.45181.99400.5456 |
14.45366.00480.46182.01890.5507 |
14.43516.03290.45662.02530.5509 |
14.41405.96870.46762.00670.5486 |
14.44285.98330.45872.00380.5485 |
0.000.450.501.190.830.39 |
以上方法学考察结果表明,用本方法测定通塞脉片的指纹图谱,样品稳定性、仪器精密度、方法重复性均较好,能够准确测定该制剂的指纹图谱。
实验例7 通塞脉片标准指纹图谱的获得及相似度限度的确定
1、十一批大生产成品的测定和标准指纹图谱的获得
十一批成品均由江苏南星药业有限责任公司生产,批号分别为:060323、060401、060402、060403、060404、060405、060406、060407、060408、060409、060410。按正文方法制备供试品溶液,依法测定,十一批成品的液相指纹图谱叠加图谱见附图8,标准指纹图谱见附图9。
2、通塞脉片指纹图谱中各特征峰相对保留时间和相对峰面积波动范围的确定
把所得11批成品指纹图谱的检测数据导入Excel中,计算各特征峰与参照物峰的相对保留时间和相对峰面积,检测结果见表7、8。
将11批成品指纹图谱中各特征峰相对保留时间和相对峰面积的平均值,分别作为标准指纹图谱各特征峰的相对保留时间和相对峰面积值,根据大生产实际,为了有效、全面控制产品质量,对各特征峰相对保留时间和相对峰面积的波动范围进行了限定,详见表9、10。
表7 十一批通塞脉片指纹图谱的相对峰面积检测结果
批号峰号 | 060323 | 060401 | 060402 | 060403 | 060404 | 060405 | 060406 | 060407 | 060408 | 060409 | 060410 |
共有模式 |
123456s78910111213141516171819 |
0.23620.61233.61524.69530.36410.36901.00000.38100.36451.92950.31550.23380.20150.17320.30820.33300.42540.66230.27770.5273 |
0.15760.59152.15872.12680.19160.30361.00000.33670.29401.92750.31150.23670.22630.16930.36000.29910.49080.62330.25160.5068 |
0.24010.67043.46115.93410.37100.36271.00000.36800.35721.88280.30500.22820.20160.17800.30910.34090.46330.7250.28590.5583 |
0.20310.66234.21469.31050.38850.35251.00000.36610.41792.01200.33860.22860.19780.19440.31990.37960.43300.74180.29550.5556 |
0.11590.52552.14941.92280.20070.29961.00000.33140.29382.03260.30660.24360.22610.15760.34720.28220.50170.6330.26780.4521 |
0.21380.64924.39546.00530.37460.34181.00000.35910.43241.97530.29680.20390.19270.19610.29600.37910.36930.74790.22090.5473 |
0.14850.61933.13803.79560.22310.29141.00000.32290.33401.92840.32120.21390.20670.17800.32610.31590.44970.62240.26430.5053 |
0.16580.61033.86207.30880.34440.34931.00000.36700.40482.05140.33360.22840.19790.19030.32150.37040.43440.70330.28740.5476 |
0.21230.62513.98478.83760.41470.32451.00000.33950.43571.91510.30560.19840.18840.19210.30180.38260.37700.66030.26130.5326 |
0.22820.63873.15427.39340.39630.32471.00000.35890.38322.00550.30330.23350.21360.17270.33960.36360.39360.62380.26700.5302 |
0.35470.74385.06408.60160.53770.34451.00000.40580.44891.85950.28990.20810.19570.20200.29790.39120.42590.69880.30780.5990 |
0.20690.63173.56345.99380.34610.33311.00000.35780.37881.95630.31160.22340.20440.18220.32060.34890.43310.67650.27160.5329 |
注:s为参照峰
表8 十一批通塞脉片指纹图谱的相对保留时间检测结果
批号峰号 |
060323 |
060401 |
060402 |
060403 |
060404 |
060405 |
060406 |
060407 |
060408 |
060409 |
060410 |
共有模式 |
123456s78910111213141516171819 |
0.14960.26660.37030.48020.52840.76301.00001.05371.51041.56621.63911.76481.81601.89821.92252.02852.20772.30402.94543.1167 |
0.14840.26730.37060.48030.52860.76311.00001.05371.51001.56521.63831.76391.81521.89711.92142.02722.20612.30212.94233.1135 |
0.14980.26750.37090.48080.52920.76371.00001.05351.50851.56441.63701.76241.81361.89481.91962.02492.20432.29962.93783.1088 |
0.14860.26830.37100.48070.52900.76331.00001.05361.50891.56491.63741.76301.81411.89511.92002.02522.20472.29962.93803.1089 |
0.15060.26830.37140.48140.52980.76401.00001.05341.50811.56391.63651.76201.81321.89391.91902.02412.20342.29822.93553.1065 |
0.14950.26790.37110.48110.52950.76361.00001.05351.50701.56321.63551.76091.81211.89261.91782.02292.20252.29722.93443.1050 |
0.14860.26950.37210.48190.53040.76451.00001.05331.50721.56301.63571.76111.81231.89321.91822.02322.20272.29772.93493.1059 |
0.15050.26870.37130.48130.52960.76391.00001.05351.50741.56331.63551.76081.81191.89261.91762.02282.20202.29702.93473.1055 |
0.15060.26820.37180.48190.53030.76461.00001.05301.50641.56251.63471.76001.81101.89171.91672.02182.20122.29612.93363.1043 |
0.14790.26990.37270.48270.53120.76491.00001.05311.50581.56191.63411.75971.81101.89211.91722.02222.20162.29652.93403.1047 |
0.14840.26940.37180.48170.53050.76411.00001.05261.50531.56151.63341.75801.80941.88921.91452.01902.19862.29212.92513.0957 |
0.14930.26830.37140.48130.52970.76391.00001.05341.50771.56361.63611.76151.81271.89371.91862.02382.20322.29822.93603.1069 |
注:s为参照峰
表9 通塞脉片的标准指纹图谱数据
峰号 |
保留时间 |
相对保留时间 |
峰面积 |
相对峰面积 |
123456s78910111213141516171819 |
2.8845.1837.1739.29610.23214.75519.31620.34729.12330.20331.60334.02535.01536.57837.05939.09242.55644.39256.71260.012 |
0.14930.26830.37140.48130.52970.76391.00001.05341.50771.56361.63611.76151.81271.89371.91862.02382.20322.29822.93603.1069 |
39.5375122.6721681.95341137.902066.000164.7236195.314069.5465126.0570382.363760.924543.762040.088235.387562.917867.609485.0221131.534452.9151103.5463 |
0.20690.63173.56345.99380.34610.33311.00000.35780.64831.95630.31160.22340.20440.18220.32060.34890.43310.67650.27160.5329 |
注:s为参照峰
表10 通塞脉片标准指纹图谱相对保留时间和相对峰面积的波动范围
峰号 | 相对保留时间 | 相对保留时间波动范围 |
平均相对峰面积 |
相对峰面积波动范围(%) | 峰面积占总面积比例(%) |
123456s78910111213141516171819 |
0.14930.26830.37140.48130.52970.76391.00001.05341.50771.56361.63611.76151.81271.89371.91862.02382.20322.29822.93603.1069 | ±2.0% |
0.20690.63173.56345.99380.34610.33311.00000.35780.64831.95630.31160.22340.20440.18220.32060.34890.43310.67650.27160.5329 |
±80±20±50±75±60±20±25±20±30±10±15±15±15±20±20±30±20±25±25±20 |
1.35042.831819.279813.33082.04711.65343.80721.54492.88117.07961.30510.80481.55561.09262.47401.95653.47834.28351.00073.1341 |
注:“s”为参照峰,“-”为不作要求。
从11批成品指纹图谱的检测结果来看,相对保留时间的波动范围很窄(1.5%以内),说明Agilent 1100液相色谱仪性能很好。2、6、7、9~14、16、19号峰相对峰面积的波动范围均在20%以内,说明这些成分在通塞脉片的生产过程中相对来说还是较稳定的。
实验例9 通塞脉片指纹图谱稳定性考察
考察04~05年生产的13批通塞脉片指纹图谱中各特征峰相对保留时间和相对峰面积的变化情况,以验证其稳定性,结果见表11、12、表13。
从13批成品指纹图谱的检测结果见表11、12,相对保留时间的波动变大(3.5%以上);相对峰面积的波动也较大,与表10标准波动范围相比,所有色谱峰相对峰面积的波动范围均在40%以上,说明这些成分在通塞脉片的生产过程中对药材来源、生产工艺、储存条件等较为敏感,因此对表10标准作调整,调整结果见表13。
表11 13批通塞脉片指纹图谱的相对保留时间检测结果
注:“s”为参照峰
表12 13批通塞脉片指纹图谱的相对峰面积检测结果
注:“s”为参照峰
表13 通塞脉片标准指纹图谱相对保留时间和相对峰面积的波动范围
峰号 | 相对保留时间 |
相对保留时间波动范围 | 相对峰面积 |
相对峰面积波动范围(%) |
峰面积占总面积比例(%) |
123456s78910111213141516171819 |
0.14930.26830.37140.48130.52970.76391.00001.05341.50771.56361.63611.76151.81271.89371.91862.02382.20322.29822.93603.1069 | ±4.0% |
0.20690.63173.56345.99380.34610.33311.00000.35780.64831.95630.31160.22340.20440.18220.32060.34890.43310.67650.27160.5329 |
±80±50±80±180±100±80±80±60±80±50±70±60±50±90±40±90±80±60±80±70 |
1.35042.831819.279813.33082.04711.65343.80721.54492.88117.07961.30510.80481.55561.09262.47401.95653.47834.28351.00073.1341 |
实验例8 含量测定方法实验
一、绿原酸含量测定方法实验
由于在生产中加强了原料控制,使用地道药材,并对各工段加强控制,减少有效成份的损失,使得干浸膏中绿原酸检测含量有所提高。检测方法中用50%甲醇超声处理后,制备更加简便,理论板数较高。实验数据表明峰形较好,回收率较高,更好的控制含量。
二、甘草酸含量测定方法实验
甘草为通塞脉片处方中的药味之一,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效。为了更好地控制通塞脉片的质量,我们选用甘草之主要成分甘草酸作为含量测定指标,采用高效液相色谱方法进行试验,方法简便,重现性好,易操作,准确度高。
(一)仪器和试剂及试药
仪器:Agilent 1100液相色谱仪;Mettler AE240电子天平(十万分之一);H66025超声波清洗机(无锡超声电子设备厂);PTHW型电热套(巩义市英峪予华仪器厂)。试剂:甲醇(色谱纯,TEDIA,USA);水为超纯水;其余试剂均购自上海化学试剂有限公司,分析纯。试药:甘草酸铵对照品(购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:110731-200408);通塞脉片由南星药业提供;缺甘草的通塞脉片空白对照样品(按全处方缺甘草制备)。
(二)色谱条件
色谱柱:ZORBAX SB-C18(5μm,4.6mm×250mm);用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇-0.1%磷酸溶液(64∶36)为流动相;检测波长为250nm。理论板数按甘草酸峰计应不低于2000。对照品溶液的制备:精密称取甘草酸铵对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得。流速:1.0ml/min;柱温:30℃。测定波长的选择:250nm作为甘草酸铵的检测波长。系统适用性试验:在上述条件下,以甘草酸峰计算理论板数大于2000,分离度大于1.5,达到基线分离。
(三)供试品溶液的制备
1.提取方法考察
取本品(批号:060208)适量,除去薄膜衣后,研细,取2g,平行2份,精密称定,置烧瓶中,精密加入70%甲醇50ml,称定重量,分别用超声(功率300W,频率20kHz)和回流法提取30分钟,放至室温,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,测定其含量,结果见表14。
表14不同提取方法提取结果比较
提取方法 |
超声法 |
回流法 |
甘草酸含量(mg/g) |
2.7723 |
2.8087 |
试验结果表明,本品使用回流法提取,所测甘草酸含量较高(有无统计学意义?),故确定使用回流法作为供试品提取方法。
2.提取溶剂考察
(1)提取溶剂考察
取本品(批号:060208)适量,除去薄膜衣后,研细,取2g,平行2份,精密称定,置烧瓶中,分别加入不同溶剂50ml,称定重量,回流法提取30分钟,放至室温,再称定重量,用相同溶剂补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,测定其含量,结果见下表。
表15不同溶剂提取结果比较
溶剂 |
甲醇 |
乙醇 |
甘草酸含量(mg/g) |
2.7922 |
2.8301 |
试验结果表明,以乙醇为提取溶剂,所测甘草酸含量较高(有无统计学意义?),故确定乙醇为供试品提取溶剂。
(2)提取溶剂浓度考察
取本品(批号:060208)适量,除去薄膜衣后,研细,取2g,平行五份,精密称定,置烧瓶中,分别加入不同浓度乙醇50ml,称定重量,回流法提取30分钟,放至室温,再称定重量,用相同溶剂补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,测定其含量,结果见表16。
表16不同浓度乙醇提取结果比较
溶剂 |
100%乙醇 |
70%乙醇 |
50%乙醇 |
30%乙醇 |
水 |
甘草酸含量(mg/g) |
0 |
2.7278 |
2.7033 |
2.6917 |
2.2470 |
试验结果表明,以70%乙醇为提取溶剂,所测甘草酸含量较高,故确定70%乙醇为供试品提取溶剂。
3.提取时间考察
取本品(批号:060207)适量,除去薄膜衣后,研细,取2g,平行四份,精密称定,置烧瓶中,加入70%乙醇50ml,称定重量,分别回流法提取15分钟、30分钟、45分钟、60分钟,放至室温,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,测定其含量,结果见表17。
表17不同提取时间提取结果比较
提取时间(min) |
15 |
30 |
45 |
60 |
甘草酸含量(mg/g) |
1.9104 |
2.2672 |
2.2717 |
2.2647 |
试验结果表明,以70%乙醇回流提取45min,所测甘草酸含量较高,确定回流提取时间为45min。
根据以上试验结果,确定供试品制备方法为:取本品适量,除去薄膜衣后,研细,取2g,精密称定,置烧瓶中,加入70%乙醇50ml,称定重量,回流法提取45分钟,放至室温,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,测定其含量。经高效液相色谱方法学考察验证,甘草酸的含量测定方法能够准确的检测通塞脉制剂和中间体中甘草酸的含量。
根据多批通塞脉片的含量测定试验结果,本品中甘草酸含量应不低于0.4mg/片。
三、木犀草苷含量测定方法实验
金银花为通塞脉片处方中的主要药味之一,具有清热解毒、凉散风热之功效,由于其主要成分绿原酸在中药材中普遍存在,为了更好地控制通塞脉片的质量,我们选用金银花中的特征性有效成分木犀草苷作为含量测定指标,采用高效液相色谱方法进行试验,方法简便,重现性好,易操作,准确度高。
(一)仪器和试剂及试药:
仪器:Agilent 1100液相色谱仪;Mettler AE240电子天平(十万分之一);H66025超声波清洗机(无锡超声电子设备厂)。试剂:乙腈(色谱纯,TEDIA,USA);水为超纯水;其余试剂均购自上海化学试剂有限公司,分析纯。试药:木犀草苷对照品(购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:111520-200201);通塞脉片由南星药业提供;缺金银花的通塞脉片空白对照样品(按全处方缺金银花制备)。
(二)色谱条件
色谱条件:ZORBAX SB-C18(5μm,4.6mm×150mm),以乙腈为流动相A,以0.5%冰醋酸溶液为流动相B,按表18进行梯度洗脱;检测波长350nm,流速:1.0ml/min;柱温:30℃。
表18梯度洗脱表
时间(分钟) |
流动相A% |
流动相B% |
0~30 |
10→30 |
90→70 |
(三)样品制备方法
对照品溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量,加70%乙醇制成每ml含10μg的溶液。供试品溶液的制备:取本品10片,除去薄膜衣后,研细,取1.5g,精密称定,置于25ml容量瓶中,加70%乙醇适量超声(功率300W,频率20kHz)使溶解,定容至刻度,以微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。阴性供试品溶液的制备:取不含金银花的通塞脉片干浸膏,按样品溶液制备,即得。经高效液相色谱方法学考察验证,木犀草苷的含量测定方法能够准确的检测通塞脉制剂和中间体中木犀草苷的含量。根据多批木犀草苷的含量数据,结合大生产实际情况,通塞脉片中木犀草苷的含量为:金银花以木犀草苷(C21H20O11)计,不得少于0.10mg/片。该方法简便,重现性好,易操作,准确度高,可以较好控制产品质量。
四、黄芪甲苷含量测定方法实验
黄芪为通塞脉片处方中的主要药味之一,为了更好地控制通塞脉片的质量,选用黄芪中的特征性有效成分黄芪甲苷作为含量测定指标,采用高效液相色谱方法进行试验,方法简便,重现性好,易操作,准确度高。
(一)仪器和试剂及试药:仪器:Waters 600液相色谱仪,Alltech 500型蒸发光散射检测器;Mettler AE240电子天平(十万分之一);H66025超声波清洗机(无锡超声电子设备厂)。
试剂:甲醇(色谱纯,TEDIA,USA);水为超纯水;其余试剂均购自上海化学试剂有限公司,分析纯。试药:黄芪甲苷对照品(购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号:0781-200109);通塞脉片由南星药业提供;缺黄芪的通塞脉片空白对照样品(按全处方缺黄芪制备)。
(二)色谱条件。色谱条件:Lichrospher 5-C18(5μm,4.6mm×250mm),以甲醇-水(75∶25)为流动相,流速:1.0ml/min;柱温:30℃;用蒸发光散射检测器检测。
(三)样品制备方法
对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得。供试品溶液的制备:取本品10片,除去薄膜衣后,研细,取1.5g,精密称定,加甲醇20ml超声提取(功率300W,频率20kHz)20min,滤过,残渣连同滤纸加甲醇20ml,再超声提取20min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,浓缩至干,残渣加水10ml,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。阴性供试品溶液的制备:取不含黄芪的通塞脉片干浸膏,按样品溶液制备即得。经高效液相色谱方法学考察验证,黄芪甲苷的含量测定方法能够准确的检测通塞脉制剂和中间体中黄芪甲苷的含量。根据多批黄芪甲苷的含量数据,结合大生产实际情况,通塞脉片中黄芪甲苷的含量为含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计,不得少于0.04mg/片。该方法简便,重现性好,易操作,准确度高,可以较好控制产品质量。
下述实施例均可实现上述实验例的效果
具体实施方式
实施例1:
黄芪420kg、当归530kg、党参420kg、玄参530kg、金银花420kg、石斛530kg、牛膝420kg、甘草530kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加6倍量水,加热煎煮0.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加4倍量的水煎煮0.5小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达70%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏加入常规辅料,按照常规工艺,制成临床接受的胶囊剂;
指纹图谱检测:色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:phenomenex luna C18,4.6×150mm,5μm;流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占1%时开始以线性梯度方式洗脱,经60min流动相中乙腈浓度达40%,流动相中乙腈浓度达40%时等度洗脱5min后,再以线性梯度方式经5min流动相中乙腈浓度达95%;流动相中乙腈浓度达95%时等度洗脱5min,再以线性梯度方式经5min回到流动相中乙腈浓度达1%;流动相中乙腈浓度达1%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:1ml/min;柱温:30℃;检测波长:270nm;记录时间:65min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/5,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,回流提取30min,放至室温,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,0.45μm滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱;
检测结果为:一个S参照峰与5个主要峰,相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:S号峰的相对保留时间为1.0000,相对峰面积为1.0000,相对峰面积波动范围为100%;3号峰的相对保留时间为0.3714,相对峰面积为3.5634,相对峰面积波动范围为80%;4号峰的相对保留时间为0.4813,相对峰面积为5.9938,相对峰面积波动范围为180%;8号峰的相对保留时间为1.5077,相对峰面积为0.6483,相对峰面积波动范围为80%;9号峰的相对保留时间为1.5636,相对峰面积为1.9563,相对峰面积波动范围为50%;19号峰的相对保留时间为3.1069,相对峰面积为0.5329,相对峰面积波动范围为70%。
实施例2:
黄芪480kg、当归480kg、党参480kg、玄参480kg、金银花480kg、石斛480kg、牛膝480kg、甘草480kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加5倍量水,加热煎煮1.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加3倍量的水煎煮1小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达60%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏粉碎,得干浸膏粉,干浸膏粉加2.3%淀粉、1%微粉硅胶,用适量乙醇作为润湿剂在高效湿法混合制粒机进行制粒,颗粒水分控制在不超过4.5%;用14目筛摇摆式颗粒机整粒;将颗粒置三维运动混合机中,加1%滑石粉,0.2%硬脂酸镁,以13转/分钟的转速开机混合10分钟;将颗粒压制成片芯重0.36g±4.0%的素片,操作间湿度控制在不超过50%;用水溶性薄膜包衣材料包薄膜衣,包衣材料为胃溶型欧巴代薄膜包衣预混剂,按素片重量的4.5%称取包衣材料即欧巴代;加10%的稀乙醇液配制成20%的混悬液,连续搅拌45分钟,充分搅拌均匀,备用;将素片加入包衣锅内,转动包衣锅用20%欧巴代混悬液进行喷包,进风温度为45℃,出风温度为40℃,蠕动泵速度为10.0转/分;片床温度为35℃,包衣锅转速9转/分,出片温度在35℃以下,包衣时间6小时,在包衣结束后,包衣片干燥,干燥间湿度应控制在50%以内,得临床可接受的薄膜衣片;
指纹图谱检测:色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:C18柱;流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占0.5%时开始以线性梯度方式洗脱,经65min流动相中乙腈浓度达35%,流动相中乙腈浓度达35%时等度洗脱7min后,再以线性梯度方式经7min流动相中乙腈浓度达98%;流动相中乙腈浓度达98%时等度洗脱3min,再以线性梯度方式经3min回到流动相中乙腈浓度达1.5%;流动相中乙腈浓度达1.5%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:0.5ml/min;柱温:35℃;检测波长:260nm;记录时间:70min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的/10,精密加入30%甲醇70ml,称定重量,回流提取20min,放至室温,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各2μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱;
检测结果为:一个S参照峰与5个主要峰,相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:S号峰的相对保留时间为1.0000,相对峰面积为1.0000,相对峰面积波动范围为100%;3号峰的相对保留时间为0.3714,相对峰面积为3.5634,相对峰面积波动范围为80%;4号峰的相对保留时间为0.4813,相对峰面积为5.9938,相对峰面积波动范围为180%;8号峰的相对保留时间为1.5077,相对峰面积为0.6483,相对峰面积波动范围为80%;9号峰的相对保留时间为1.5636,相对峰面积为1.9563,相对峰面积波动范围为50%;19号峰的相对保留时间为3.1069,相对峰面积为0.5329,相对峰面积波动范围为70%。
实施例3:
黄芪480kg、当归480kg、党参480kg、玄参480kg、金银花480kg、石斛480kg、牛膝480kg、甘草480kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加5倍量水,加热煎煮1.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加3倍量的水煎煮1小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达60%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏粉碎,得干浸膏粉,干浸膏粉加2.3%淀粉、1%微粉硅胶,用适量乙醇作为润湿剂在高效湿法混合制粒机进行制粒,颗粒水分控制在不超过4.5%;用14目筛摇摆式颗粒机整粒;将颗粒置三维运动混合机中,加1%滑石粉,0.2%硬脂酸镁,以13转/分钟的转速开机混合10分钟;将颗粒压制成片芯重0.36g±4.0%的素片,操作间湿度控制在不超过50%;
用水溶性薄膜包衣材料包薄膜衣,包衣材料为胃溶型欧巴代薄膜包衣预混剂,按素片重量的4.5%称取包衣材料即欧巴代;加10%的稀乙醇液配制成20%的混悬液,连续搅拌45分钟,充分搅拌均匀,备用;将素片加入包衣锅内,转动包衣锅用20%欧巴代混悬液进行喷包,进风温度为45℃,出风温度为40℃,蠕动泵速度为10.0转/分;片床温度为35℃,包衣锅转速9转/分,出片温度在35℃以下,包衣时间6小时,在包衣结束后,包衣片干燥,干燥间湿度应控制在50%以内,得临床可接受的薄膜衣片;
指纹图谱检测:色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:C18柱;流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占1.5%时开始以线性梯度方式洗脱,经55min流动相中乙腈浓度达45%,流动相中乙腈浓度达45%时等度洗脱3min后,再以线性梯度方式经3mi n流动相中乙腈浓度达90%;流动相中乙腈浓度达90%时等度洗脱7min,再以线性梯度方式经7min回到流动相中乙腈浓度达0.5%;流动相中乙腈浓度达0.5%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:1.5ml/min;柱温:25℃;检测波长:280nm;记录时间:60min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10,精密加入70%甲醇30ml,称定重量,回流提取40min,放至室温,再称定重量,用30%甲醇补足减失的重量,滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱;
检测结果为:一个S参照峰与5个主要峰,相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:S号峰的相对保留时间为1.0000,相对峰面积为1.0000,相对峰面积波动范围为100%;3号峰的相对保留时间为0.3714,相对峰面积为3.5634,相对峰面积波动范围为80%;4号峰的相对保留时间为0.4813,相对峰面积为5.9938,相对峰面积波动范围为180%;8号峰的相对保留时间为1.5077,相对峰面积为0.6483,相对峰面积波动范围为80%;9号峰的相对保留时间为1.5636,相对峰面积为1.9563,相对峰面积波动范围为50%;19号峰的相对保留时间为3.1069,相对峰面积为0.5329,相对峰面积波动范围为70%;
含量测定:
G、绿原酸的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,17∶80∶3甲醇-水-冰醋酸为流动相,检测波长为330nm;理论板数按绿原酸计算,应不得低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品,置棕色瓶中,加50%甲醇制成每1ml含0.01mg~0.05mg的溶液,作为对照品溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置于75体积份容量瓶中,加50%甲醇近刻度,提取18分钟,放冷,加50%甲醇至刻度,以微孔滤膜过滤得供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,所得色谱中,应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰;
H、甘草酸铵的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;64∶36甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相;检测波长为250nm;理论板数按甘草酸峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取甘草酸铵对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,折合甘草酸0.1959mg,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入20倍体积份的70%乙醇,称定重量,回流法提取45分钟,放至室温,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;甘草酸含量应不低于6mg/日用剂量;
I、木犀草苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相I,以0.5%冰醋酸溶液为流动相II,进行梯度洗脱;检测波长350nm,理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1ml含10μg的溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置于容量瓶中,加70%乙醇适量超声使溶解,定容至刻度,以微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;
金银花以木犀草苷C21H20O11计,不得少于1.5mg/日用剂量;
J、黄芪甲苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;77∶23甲醇-水为流动相;用蒸发光散射检测器检测;理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入15倍体积份的甲醇超声提取20min,滤过,残渣连同滤纸加甲醇20体积份,再超声提取20min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,浓缩至干,残渣加水10体积份,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20体积份,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,用外标两点法对数方程计算,即得;黄芪甲苷的含量为含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14)计,不得少于0.6mg/日用剂量。
实施例4:
黄芪420kg、当归530kg、党参420kg、玄参530kg、金银花420kg、石斛530kg、牛膝420kg、甘草530kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加6倍量水,加热煎煮0.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加4倍量的水煎煮0.5小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达70%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏加入常规辅料,按照常规工艺,制成临床接受的颗粒剂;
指纹图谱检测:色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:phenomenex luna C18,4.6×150mm,5μm;流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占1%时开始以线性梯度方式洗脱,经60min流动相中乙腈浓度达40%,流动相中乙腈浓度达40%时等度洗脱5min后,再以线性梯度方式经5min流动相中乙腈浓度达95%;流动相中乙腈浓度达95%时等度洗脱5min,再以线性梯度方式经5min回到流动相中乙腈浓度达1%;流动相中乙腈浓度达1%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:1ml/min;柱温:30℃;检测波长:270nm;记录时间:65min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/5,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,回流提取30min,放至室温,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,0.45μm滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱;
检测结果为:一个S参照峰、5个主要峰与14个共有峰;相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:S号峰的相对保留时间为1.0000,相对峰面积为1.0000,相对峰面积波动范围为100%;3号峰的相对保留时间为0.3714,相对峰面积为3.5634,相对峰面积波动范围为80%;4号峰的相对保留时间为0.4813,相对峰面积为5.9938,相对峰面积波动范围为180%;8号峰的相对保留时间为1.5077,相对峰面积为0.6483,相对峰面积波动范围为80%;9号峰的相对保留时间为1.5636,相对峰面积为1.9563,相对峰面积波动范围为50%;19号峰的相对保留时间为3.1069,相对峰面积为0.5329,相对峰面积波动范围为70%;1号峰的相对保留时间为0.1439,相对峰面积为0.2069,相对峰面积波动范围为80%;2号峰的相对保留时间为0.2683,相对峰面积为0.6317,相对峰面积波动范围为50%;5号峰的相对保留时间为0.5297,相对峰面积为0.3461,相对峰面积波动范围为100%;6号峰的相对保留时间为0.7639,相对峰面积为0.3331,相对峰面积波动范围为80%;7号峰的相对保留时间为1.0534,相对峰面积为0.3478,相对峰面积波动范围为60%;10号峰的相对保留时间为1.6361,相对峰面积为0.3116,相对峰面积波动范围为70%;11号峰的相对保留时间为1.7615,相对峰面积为0.2234,相对峰面积波动范围为60%;12号峰的相对保留时间为1.8127,相对峰面积为0.2044,相对峰面积波动范围为50%;13号峰的相对保留时间为1.8937,相对峰面积为0.1822,相对峰面积波动范围为90%;14号峰的相对保留时间为1.9186,相对峰面积为0.3206,相对峰面积波动范围为40%;15号峰的相对保留时间为2.0238,相对峰面积为0.3489,相对峰面积波动范围为90%;16号峰的相对保留时间为2.2032,相对峰面积为0.4331,相对峰面积波动范围为80%;17号峰的相对保留时间为2.2982,相对峰面积为0.6765,相对峰面积波动范围为60%;18号峰的相对保留时间为2.9360,相对峰面积为0.2716,相对峰面积波动范围为80%;
鉴别:
A、取本药物组合物颗粒剂日用剂量的1/4,研细,用甲醇超声提取2次,每次加甲醇50体积份提取20分钟,合并提取液后过滤,滤液蒸干,加水30体积份使溶解,用水饱和正丁醇提取3次,每次30体积份,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次30体积份,弃去氨液;将正丁醇液蒸干,残渣加水5体积份使溶解,上D-101大孔吸附树脂柱,分别用水50体积份洗脱,弃去水液,用40%乙醇30体积份洗脱,弃去洗脱液,继续用70%乙醇50体积份洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2体积份溶解作为供试品溶液;另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl分别点于同一硅胶G薄层板上,以5∶1∶4比例的正丁醇-醋酸乙酯-水的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
B、取本药物组合物颗粒剂日用剂量的1/4,研细,加乙醇40体积份,加热回流30分钟,滤过,滤液蒸至近干,残渣加水10体积份使溶解,加5%硫酸-乙醇1∶1混合溶液10体积份,加热回流3小时,取出,置水浴上蒸至无醇味,用氯仿振摇提取2次,每次15体积份,合并氯仿液,浓缩至1体积份,作为供试品溶液;另取齐墩果酸对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以4∶2∶1比例的环己烷-丙酮-醋酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇试液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
C、取本药物组合物颗粒剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取党参对照药材1g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶0.5正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开16cm,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主荧光斑点;
D、取本药物组合物颗粒剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;取玄参对照药材0.2g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取鉴别C中供试品溶液及玄参对照药材溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶2正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开14cm,取出,晾干,喷以香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点;
E、取本药物组合物颗粒剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇液,用1%NaOH振摇提取3次,每次20体积份,合并碱水液,用稀盐酸调pH值至3,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取甘草对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以15∶1∶1∶2乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
F、取本药物组合物颗粒剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用氯仿振摇提取3次,每次30体积份,合并氯仿提取液,置水浴上浓缩至干,残渣中精密加氯仿至1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取滨蒿内酯对照品,加氯仿制成每1ml含0.3mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以1∶1∶1醋酸乙酯-氯仿-浓氨溶液的下层溶液为展开剂,展开,展距8cm,取出,吹干,再以2∶3∶3环己烷-氯仿-醋酸乙酯为展开剂,展开,展距18cm,取出,晾干,在365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例5:
黄芪420kg、当归530kg、党参420kg、玄参530kg、金银花420kg、石斛530kg、牛膝420kg、甘草530kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加6倍量水,加热煎煮0.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加4倍量的水煎煮0.5小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达70%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏加入常规辅料,按照常规工艺,制成临床接受的浓缩丸剂;
指纹图谱检测:色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:C18柱;流动相为0.05%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占0.5%时开始以线性梯度方式洗脱,经65min流动相中乙腈浓度达35%,流动相中乙腈浓度达35%时等度洗脱7min后,再以线性梯度方式经7min流动相中乙腈浓度达98%;流动相中乙腈浓度达98%时等度洗脱3min,再以线性梯度方式经3min回到流动相中乙腈浓度达1.5%;流动相中乙腈浓度达1.5%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:0.5m l/min;柱温:35℃;检测波长:260nm;记录时间:70min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的/10,精密加入30%甲醇70ml,称定重量,回流提取20min,放至室温,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各2μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱;
检测结果为:一个S参照峰、5个主要峰与14个共有峰;相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:S号峰的相对保留时间为1.0000,相对峰面积为1.0000,相对峰面积波动范围为100%;3号峰的相对保留时间为0.3714,相对峰面积为3.5634,相对峰面积波动范围为80%;4号峰的相对保留时间为0.4813,相对峰面积为5.9938,相对峰面积波动范围为180%;8号峰的相对保留时间为1.5077,相对峰面积为0.6483,相对峰面积波动范围为80%;9号峰的相对保留时间为1.5636,相对峰面积为1.9563,相对峰面积波动范围为50%;19号峰的相对保留时间为3.1069,相对峰面积为0.5329,相对峰面积波动范围为70%;1号峰的相对保留时间为0.1439,相对峰面积为0.2069,相对峰面积波动范围为80%;2号峰的相对保留时间为0.2683,相对峰面积为0.6317,相对峰面积波动范围为50%;5号峰的相对保留时间为0.5297,相对峰面积为0.3461,相对峰面积波动范围为100%;6号峰的相对保留时间为0.7639,相对峰面积为0.3331,相对峰面积波动范围为80%;7号峰的相对保留时间为1.0534,相对峰面积为0.3478,相对峰面积波动范围为60%;10号峰的相对保留时间为1.6361,相对峰面积为0.3116,相对峰面积波动范围为70%;11号峰的相对保留时间为1.7615,相对峰面积为0.2234,相对峰面积波动范围为60%;12号峰的相对保留时间为1.8127,相对峰面积为0.2044,相对峰面积波动范围为50%;13号峰的相对保留时间为1.8937,相对峰面积为0.1822,相对峰面积波动范围为90%;14号峰的相对保留时间为1.9186,相对峰面积为0.3206,相对峰面积波动范围为40%;15号峰的相对保留时间为2.0238,相对峰面积为0.3489,相对峰面积波动范围为90%;16号峰的相对保留时间为2.2032,相对峰面积为0.4331,相对峰面积波动范围为80%;17号峰的相对保留时间为2.2982,相对峰面积为0.6765,相对峰面积波动范围为60%;18号峰的相对保留时间为2.9360,相对峰面积为0.2716,相对峰面积波动范围为80%;
含量测定:
G、绿原酸的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,17∶80∶3甲醇-水-冰醋酸为流动相,检测波长为330nm;理论板数按绿原酸计算,应不得低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品,置棕色瓶中,加50%甲醇制成每1ml含0.01mg~0.05mg的溶液,作为对照品溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物浓缩丸剂日用剂量的1/6,精密称定,置于75体积份容量瓶中,加50%甲醇近刻度,提取18分钟,放冷,加50%甲醇至刻度,以微孔滤膜过滤得供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,所得色谱中,应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰;
H、甘草酸铵的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;64∶36甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相;检测波长为250nm;理论板数按甘草酸峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取甘草酸铵对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,折合甘草酸0.1959mg,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物浓缩丸剂日用剂量的1/6,精密称定,置烧瓶中,精密加入20倍体积份的70%乙醇,称定重量,回流法提取45分钟,放至室温,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;甘草酸含量应不低于6.5mg/日用剂量;
鉴别:
A、取本药物组合物浓缩丸剂日用剂量的1/5,研细,用甲醇超声提取2次,每次加甲醇50体积份提取20分钟,合并提取液后过滤,滤液蒸干,加水30体积份使溶解,用水饱和正丁醇提取3次,每次30体积份,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次30体积份,弃去氨液;将正丁醇液蒸干,残渣加水5体积份使溶解,上D-101大孔吸附树脂柱,分别用水50体积份洗脱,弃去水液,用40%乙醇30体积份洗脱,弃去洗脱液,继续用70%乙醇50体积份洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2体积份溶解作为供试品溶液;另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl分别点于同一硅胶G薄层板上,以5∶1∶4比例的正丁醇-醋酸乙酯-水的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
B、取本药物组合物浓缩丸剂日用剂量的1/5,研细,加乙醇40体积份,加热回流30分钟,滤过,滤液蒸至近干,残渣加水10体积份使溶解,加5%硫酸-乙醇1∶1混合溶液10体积份,加热回流3小时,取出,置水浴上蒸至无醇味,用氯仿振摇提取2次,每次15体积份,合并氯仿液,浓缩至1体积份,作为供试品溶液;另取齐墩果酸对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以4∶2∶1比例的环己烷-丙酮-醋酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇试液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
C、取本药物组合物浓缩丸剂日用剂量1/5,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取党参对照药材1g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶0.5正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开16cm,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主荧光斑点。
实施例6:
黄芪480kg、当归480kg、党参480kg、玄参480kg、金银花480kg、石斛480kg、牛膝480kg、甘草480kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加5倍量水,加热煎煮1.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加3倍量的水煎煮1小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达60%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏粉碎,得干浸膏粉,干浸膏粉加2.3%淀粉、1%微粉硅胶,用适量乙醇作为润湿剂在高效湿法混合制粒机进行制粒,颗粒水分控制在不超过4.5%;用14目筛摇摆式颗粒机整粒;将颗粒置三维运动混合机中,加1%滑石粉,0.2%硬脂酸镁,以13转/分钟的转速开机混合10分钟;将颗粒压制成片芯重0.36g±4.0%的素片,操作间湿度控制在不超过50%;
用水溶性薄膜包衣材料包薄膜衣,包衣材料为胃溶型欧巴代薄膜包衣预混剂,按素片重量的4.5%称取包衣材料即欧巴代;加10%的稀乙醇液配制成20%的混悬液,连续搅拌45分钟,充分搅拌均匀,备用;将素片加入包衣锅内,转动包衣锅用20%欧巴代混悬液进行喷包,进风温度为45℃,出风温度为40℃,蠕动泵速度为10.0转/分;片床温度为35℃,包衣锅转速9转/分,出片温度在35℃以下,包衣时间6小时,在包衣结束后,包衣片干燥,干燥间湿度应控制在50%以内,得临床可接受的薄膜衣片;
指纹图谱检测:色谱条件与系统适应性试验:可实现线性梯度的高效液相色谱仪;色谱柱:C18柱;流动相为0.3%磷酸溶液-乙腈溶剂系统;洗脱程序为:流动相中乙腈浓度占1.5%时开始以线性梯度方式洗脱,经55min流动相中乙腈浓度达45%,流动相中乙腈浓度达45%时等度洗脱3min后,再以线性梯度方式经3min流动相中乙腈浓度达90%;流动相中乙腈浓度达90%时等度洗脱7min,再以线性梯度方式经7min回到流动相中乙腈浓度达0.5%;流动相中乙腈浓度达0.5%时等度洗脱至基线平稳,即完成1个样品分析程序;流速:1.5ml/min;柱温:25℃;检测波长:280nm;记录时间:60min;理论板数按绿原酸峰C16H18O9参照物计算,应不低于60000;
参照物溶液的制备:取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液,即得;供试品溶液的制备:取本药物组合物日用剂量的1/10,精密加入70%甲醇30ml,称定重量,回流提取40min,放至室温,再称定重量,用30%甲醇补足减失的重量,滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液;测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定;得本发明药物组合物制剂的指纹图谱;
检测结果为:一个S参照峰、5个主要峰与14个共有峰;相对保留时间的波动范围均不大于4%,分别为:S号峰的相对保留时间为1.0000,相对峰面积为1.0000,相对峰面积波动范围为100%;3号峰的相对保留时间为0.3714,相对峰面积为3.5634,相对峰面积波动范围为80%;4号峰的相对保留时间为0.4813,相对峰面积为5.9938,相对峰面积波动范围为180%;8号峰的相对保留时间为1.5077,相对峰面积为0.6483,相对峰面积波动范围为80%;9号峰的相对保留时间为1.5636,相对峰面积为1.9563,相对峰面积波动范围为50%;19号峰的相对保留时间为3.1069,相对峰面积为0.5329,相对峰面积波动范围为70%;1号峰的相对保留时间为0.1439,相对峰面积为0.2069,相对峰面积波动范围为80%;2号峰的相对保留时间为0.2683,相对峰面积为0.6317,相对峰面积波动范围为50%;5号峰的相对保留时间为0.5297,相对峰面积为0.3461,相对峰面积波动范围为100%;6号峰的相对保留时间为0.7639,相对峰面积为0.3331,相对峰面积波动范围为80%;7号峰的相对保留时间为1.0534,相对峰面积为0.3478,相对峰面积波动范围为60%;10号峰的相对保留时间为1.6361,相对峰面积为0.3116,相对峰面积波动范围为70%;11号峰的相对保留时间为1.7615,相对峰面积为0.2234,相对峰面积波动范围为60%;12号峰的相对保留时间为1.8127,相对峰面积为0.2044,相对峰面积波动范围为50%;13号峰的相对保留时间为1.8937,相对峰面积为0.1822,相对峰面积波动范围为90%;14号峰的相对保留时间为1.9186,相对峰面积为0.3206,相对峰面积波动范围为40%;15号峰的相对保留时间为2.0238,相对峰面积为0.3489,相对峰面积波动范围为90%;16号峰的相对保留时间为2.2032,相对峰面积为0.4331,相对峰面积波动范围为80%;17号峰的相对保留时间为2.2982,相对峰面积为0.6765,相对峰面积波动范围为60%;18号峰的相对保留时间为2.9360,相对峰面积为0.2716,相对峰面积波动范围为80%;
含量测定:
I、木犀草苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相I,以0.5%冰醋酸溶液为流动相II,进行梯度洗脱;检测波长350nm,理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1ml含10μg的溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/12,精密称定,置于容量瓶中,加70%乙醇适量超声使溶解,定容至刻度,以微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;
金银花以木犀草苷C21H20O11计,不得少于1.7mg/日用剂量;
J、黄芪甲苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;77∶23甲醇-水为流动相;用蒸发光散射检测器检测;理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/12,精密称定,置烧瓶中,精密加入15倍体积份的甲醇超声提取20min,滤过,残渣连同滤纸加甲醇20体积份,再超声提取20min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,浓缩至干,残渣加水10体积份,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20体积份,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,用外标两点法对数方程计算,即得;黄芪甲苷的含量为含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14)计,不得少于0..65mg/日用剂量;
鉴别:
D、取本药物组合物片剂日用剂量3/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;取玄参对照药材0.2g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取鉴别C中供试品溶液及玄参对照药材溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶2正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开14cm,取出,晾干,喷以香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点;
E、取本药物组合物片剂日用剂量3/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇液,用1%NaOH振摇提取3次,每次20体积份,合并碱水液,用稀盐酸调pH值至3,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取甘草对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以15∶1∶1∶2乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
F、取本药物组合物片剂日用剂量3/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用氯仿振摇提取3次,每次30体积份,合并氯仿提取液,置水浴上浓缩至干,残渣中精密加氯仿至1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取滨蒿内酯对照品,加氯仿制成每1ml含0.3mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以1∶1∶1醋酸乙酯-氯仿-浓氨溶液的下层溶液为展开剂,展开,展距8cm,取出,吹干,再以2∶3∶3环己烷-氯仿-醋酸乙酯为展开剂,展开,展距18cm,取出,晾干,在365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例7:
黄芪420kg、当归530kg、党参420kg、玄参530kg、金银花420kg、石斛530kg、牛膝420kg、甘草530kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加6倍量水,加热煎煮0.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加4倍量的水煎煮0.5小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达70%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏加入常规辅料,按照常规工艺,制成临床接受的胶囊剂;
含量测定:
G、绿原酸的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,17∶80∶3甲醇-水-冰醋酸为流动相,检测波长为330nm;理论板数按绿原酸计算,应不得低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品,置棕色瓶中,加50%甲醇制成每1ml含0.01mg~0.05mg的溶液,作为对照品溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物胶囊剂日用剂量的1/10,精密称定,置于75体积份容量瓶中,加50%甲醇近刻度,提取18分钟,放冷,加50%甲醇至刻度,以微孔滤膜过滤得供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,所得色谱中,应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰;
H、甘草酸铵的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;64∶36甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相;检测波长为250nm;理论板数按甘草酸峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取甘草酸铵对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,折合甘草酸0.1959mg,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物胶囊剂日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入20倍体积份的70%乙醇,称定重量,回流法提取45分钟,放至室温,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;甘草酸含量应不低于6mg/日用剂量;
I、木犀草苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相I,以0.5%冰醋酸溶液为流动相II,进行梯度洗脱;检测波长350nm,理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1ml含10μg的溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物胶囊剂日用剂量的1/10,精密称定,置于容量瓶中,加70%乙醇适量超声使溶解,定容至刻度,以微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;
金银花以木犀草苷C21H20O11计,不得少于1.5mg/日用剂量;
J、黄芪甲苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;77∶23甲醇-水为流动相;用蒸发光散射检测器检测;理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物胶囊剂日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入15倍体积份的甲醇超声提取20min,滤过,残渣连同滤纸加甲醇20体积份,再超声提取20min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,浓缩至干,残渣加水10体积份,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20体积份,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,用外标两点法对数方程计算,即得;黄芪甲苷的含量为含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14)计,不得少于0.6mg/日用剂量;
鉴别::
A、取本药物组合物胶囊剂日用剂量的1/4,研细,用甲醇超声提取2次,每次加甲醇50体积份提取20分钟,合并提取液后过滤,滤液蒸干,加水30体积份使溶解,用水饱和正丁醇提取3次,每次30体积份,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次30体积份,弃去氨液;将正丁醇液蒸干,残渣加水5体积份使溶解,上D-101大孔吸附树脂柱,分别用水50体积份洗脱,弃去水液,用40%乙醇30体积份洗脱,弃去洗脱液,继续用70%乙醇50体积份洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2体积份溶解作为供试品溶液;另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl分别点于同一硅胶G薄层板上,以5∶1∶4比例的正丁醇-醋酸乙酯-水的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
B、取本药物组合物胶囊剂日用剂量的1/4,研细,加乙醇40体积份,加热回流30分钟,滤过,滤液蒸至近干,残渣加水10体积份使溶解,加5%硫酸-乙醇1∶1混合溶液10体积份,加热回流3小时,取出,置水浴上蒸至无醇味,用氯仿振摇提取2次,每次15体积份,合并氯仿液,浓缩至1体积份,作为供试品溶液;另取齐墩果酸对照品,加乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以4∶2∶1比例的环己烷-丙酮-醋酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇试液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
C、取本药物组合物胶囊剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取党参对照药材1g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶0.5正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开16cm,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主荧光斑点;
D、取本药物组合物胶囊剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;取玄参对照药材0.2g,按供试品制备的相同方法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取鉴别C中供试品溶液及玄参对照药材溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以7∶1∶2正丁醇-冰醋酸-水为展开剂,展开14cm,取出,晾干,喷以香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点;
E、取本药物组合物胶囊剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇液,用1%NaOH振摇提取3次,每次20体积份,合并碱水液,用稀盐酸调pH值至3,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,正丁醇液置水浴上蒸干,残渣加甲醇1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取甘草对照药材1g,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以15∶1∶1∶2乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;
F、取本药物组合物胶囊剂日用剂量1/4,加10倍重量份的甲醇,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水30体积份使溶解,用氯仿振摇提取3次,每次30体积份,合并氯仿提取液,置水浴上浓缩至干,残渣中精密加氯仿至1体积份使溶解,作为供试品溶液;另取滨蒿内酯对照品,加氯仿制成每1ml含0.3mg的溶液,作为对照品溶液;照薄层色谱法试验,吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以1∶1∶1醋酸乙酯-氯仿-浓氨溶液的下层溶液为展开剂,展开,展距8cm,取出,吹干,再以2∶3∶3环己烷-氯仿-醋酸乙酯为展开剂,展开,展距18cm,取出,晾干,在365nm紫外光灯下检视;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
实施例8:
黄芪480kg、当归480kg、党参480kg、玄参480kg、金银花480kg、石斛480kg、牛膝480kg、甘草480kg;
将原料药加入多功能提取罐中,加5倍量水,加热煎煮1.5小时,锅内温度达到100℃时开始计时;滤过,得滤液I,输入储液罐内备用;药渣复加3倍量的水煎煮1小时,滤过,与滤液I合并,得滤液II,药渣弃去;将滤液II输入双效浓缩器中,温度控制在70℃以下,真空度-0.05Mpa以上加热浓缩至50~60℃相对密度1.10~1.29,收集稠膏I;取稠膏I置醇沉罐中,加入乙醇至含醇量达60%,充分搅匀,静置24小时以上;取上清液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩至50~60℃相对密度1.30~1.50的稠膏II,将稠膏II收集于容器中;取稠膏II分装于烘盘中置干燥温度控制在80℃以下,真空度-0.05MPa以上的真空干燥箱中干燥,烘干后得干浸膏;将干浸膏粉碎,得干浸膏粉,干浸膏粉加2.3%淀粉、1%微粉硅胶,用适量乙醇作为润湿剂在高效湿法混合制粒机进行制粒,颗粒水分控制在不超过4.5%;用14目筛摇摆式颗粒机整粒;将颗粒置三维运动混合机中,加1%滑石粉,0.2%硬脂酸镁,以13转/分钟的转速开机混合10分钟;将颗粒压制成片芯重0.36g±4.0%的素片,操作间湿度控制在不超过50%;用水溶性薄膜包衣材料包薄膜衣,包衣材料为胃溶型欧巴代薄膜包衣预混剂,按素片重量的4.5%称取包衣材料即欧巴代;加10%的稀乙醇液配制成20%的混悬液,连续搅拌45分钟,充分搅拌均匀,备用;将素片加入包衣锅内,转动包衣锅用20%欧巴代混悬液进行喷包,进风温度为45℃,出风温度为40℃,蠕动泵速度为10.0转/分;片床温度为35℃,包衣锅转速9转/分,出片温度在35℃以下,包衣时间6小时,在包衣结束后,包衣片干燥,干燥间湿度应控制在50%以内,得临床可接受的薄膜衣片;
含量测定:
G、绿原酸的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,17∶80∶3甲醇-水-冰醋酸为流动相,检测波长为330nm;理论板数按绿原酸计算,应不得低于1500;
对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品,置棕色瓶中,加50%甲醇制成每1ml含0.01mg~0.05mg的溶液,作为对照品溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置于75体积份容量瓶中,加50%甲醇近刻度,提取18分钟,放冷,加50%甲醇至刻度,以微孔滤膜过滤得供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,所得色谱中,应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰;
H、甘草酸铵的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;64∶36甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相;检测波长为250nm;理论板数按甘草酸峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取甘草酸铵对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,折合甘草酸0.1959mg,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入20倍体积份的70%乙醇,称定重量,回流法提取45分钟,放至室温,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;甘草酸含量应不低于6mg/日用剂量;
I、木犀草苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈为流动相I,以0.5%冰醋酸溶液为流动相II,进行梯度洗脱;检测波长350nm,理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取木犀草苷对照品适量,加70%乙醇制成每1ml含10μg的溶液;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置于容量瓶中,加70%乙醇适量超声使溶解,定容至刻度,以微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;
金银花以木犀草苷C21H20O11计,不得少于1.5mg/日用剂量;
J、黄芪甲苷的含量测定方法照高效液相色谱法测定,
色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;77∶23甲醇-水为流动相;用蒸发光散射检测器检测;理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于2000;
对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取本药物组合物片剂日用剂量的1/10,精密称定,置烧瓶中,精密加入15倍体积份的甲醇超声提取20min,滤过,残渣连同滤纸加甲醇20体积份,再超声提取20min,滤过,残渣用甲醇适量洗涤,合并滤液与洗液,浓缩至干,残渣加水10体积份,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20体积份,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20体积份,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液5μl、20μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,用外标两点法对数方程计算,即得;黄芪甲苷的含量为含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14)计,不得少于0.6mg/日用剂量。