CN114324666A - 一种藏党参的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藏党参的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下步骤：1)对照品溶液制备；2)供试品溶液制备；3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。本发明方法，通过特定的样品处理方法和色谱条件，首次建立了藏党参的指纹图谱，并通过对照品比对指认了4个峰，分别为绿原酸(2号峰)、木犀草苷(4号峰)、木犀草素(6号峰)及芹菜素(7号峰)。为藏党参其中的绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芹菜素检测提供了方法，也为藏党参的品质评价、临床应用提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种藏党参的HPLC指纹图谱检测方法。
背景技术
灰毛党参Codonopsis canescens Nannf.、脉花党参C.foetens subsp.nervosa(Chipp)D.Y.Hong为常用藏药，是桔梗科党参属的地方习用主流品种，藏医习称藏党参，主要分布于四川省、青海省及西藏自治区，在《度母本草》、《晶珠本草》等中均有记载。其来源还包括长花党参C.thalictrifoliavar.Mollis、党参C.pilosula等，具有消炎散肿、祛风除湿、健脾胃、补气等功效，用于治疗风湿性关节炎、麻风病、湿疹、黄水病、脚气病等症。
党参CODONOPSIS RADIX其性味甘平、无毒，有补中益气、生津止渴等功效。主治脾胃虚弱，中气不足，肺气亏虚，热病伤津，气短口渴，血虚萎黄，头晕心慌等症，是我国传统的补益药，其中潞党参Codono psispilosula(Franch.)Nnannf.被视为党参中品质优良的品种，多为人工栽培，产于山西，临床应用广泛，研究较多。
近年来，随着对资源有效利用的意识加强，藏党参地上部分的临床应用研究增多，在医疗行业、畜牧业及食品行业均有较高的经济开发潜力，且药用部位的扩大进一步保障了中藏药的可持续发展。指纹图谱是用于鉴别真伪、区分物种、质量控制的有效方法，可为使藏党参的药用植物鉴别、品质评价提供科学依据。但目前关于藏党参质量的研究较少，未有将党参与藏党参区分的化学鉴别方法研究，尚无区分藏党参中灰毛党参和脉花党参的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种藏党参的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下步骤：
1)对照品溶液制备：取绿原酸、木犀草苷、木犀草素和/或芹菜素对照品，加乙醇溶液溶解，即得对照品溶液；
2)供试品溶液制备：取待检样品，加乙醇溶液提取，即得供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：220nm；流动相：以0.4％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；梯度洗脱程序0～10min，17.5％B；10～20min，17.5％～21％B；20～30min，21％～22％B；30～40min，22％～25％B；40～45min，25％～30％B；45～50min，30％～62％B；50～60min，62％～65％B；60～66min，65％～75％B；66～70min，75％B。
进一步地，步骤1)所述对照品溶液每1ml含各对照品0.1～0.5mg。
进一步地，步骤2)所述待检样品与乙醇溶液的质量体积比为1g：5～100ml。
进一步地，所述乙醇溶液的浓度为25-75％，v/v，优选50％。
更进一步地，所述待检样品为藏党参的地上部分；所述藏党参为灰毛党参CodonopsiscanescensNannf.、脉花党参C.foetens subsp.nervosa(Chipp)D.Y.Hong。
进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，超声提取功率50～150W，频率25～65kHz，时间20～60min。
进一步地，步骤3)所述色谱条件中色谱柱：AcclaimTMPolarAdvantageⅡC18，4.6×250mm，5μm，柱温25～35℃，进样量5～20μL，流速为0.8～1.2mL·min-1。
更进一步地，步骤3)所述色谱条件中柱温30℃，进样量10μL，流速为1mL·min-1。
进一步地，所述指纹图谱中应有10个共有特征峰，与绿原酸相应的色谱峰为峰2，与木犀草苷相应的色谱峰为峰4，与木犀草素相应的色谱峰为峰6，与芹菜素相应的色谱峰为峰7。
更进一步地，所述指纹图谱中以峰4为参照峰，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.275，峰3：0.685，峰5：1.500，峰8：2.100，峰9：2.200，峰10：2.230。
本发明最后提供了一种鉴别灰毛党参和脉花党参的方法，它包括如下步骤：
1)取待检样品，按前述方法检测；所述待检样品为灰毛党参和/或脉花党参；
2)分析所得指纹图谱，所述指纹图谱中与参照峰的相对保留时间1.400±0.028处存在一色谱峰，判断该待检样品为灰毛党参；所述参照峰为木犀草苷相应的色谱峰。
本发明藏党参的HPLC指纹图谱检测方法，通过特定的样品处理方法和色谱条件，首次建立了藏党参中灰毛党参和脉花党参的指纹图谱，并通过对照品比对指认了4个峰，分别为绿原酸(2号峰)、木犀草苷(4号峰)、木犀草素(6号峰)及芹菜素(7号峰)。为藏党参其中的绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芹菜素检测提供了方法，也为藏党参与党参区分提供了一种有效的方法，同时还为检测和鉴别灰毛党参和脉花党参提供了简单准确的方法，这为藏党参的品质评价、临床应用提供科学依据。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 灰毛党参HPLC对照指纹图谱
图2 脉花党参HPLC对照指纹图谱
图3 灰毛党参HPLC指纹图谱叠加图
图4 脉花党参HPLC指纹图谱叠加图
图5 混合对照品的HPLC指纹图谱
图6 5种党参的色谱图比较
图7 聚类分析树状图
图8 主成分分析得分图
图9 OPLS-DA得分图
图10 OPLS-DA置换检验图
图11 共有峰VIP值
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、试药、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1 本发明灰毛党参的指纹图谱检测
1)对照品溶液的制备
取绿原酸、木犀草苷、木犀草素及芹菜素对照品，精密称定，加50％乙醇制成各成分质量浓度各为0.1mg/mL的混合对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
称取灰毛党参地上部分药材粉末(过四号筛)1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25mL，称定质量，超声处理(功率100W，频率45kHz)45min，再称定质量，用50％乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：AcclaimTMPolarAdvantageⅡC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.4％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱((0～10min，17.5％B；10～20min，17.5％～21％B；20～30min，21％～22％B；30～40min，22％～25％B；40～45min，25％～30％B；45～50min，30％～62％B；50～60min，62％～65％B；60～66min，65％～75％B；66～70min，75％B)；体积流量1.0mL/min；检测波长220nm；柱温30℃。
4)分析色谱图
灰毛党参指纹图谱中有10个共有特征峰，与绿原酸相应的色谱峰为峰2，与木犀草苷相应的色谱峰为峰4，与木犀草素相应的色谱峰为峰6，与芹菜素相应的色谱峰为峰7，以峰4为参照峰，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.275，峰3：0.685，峰5：1.500，峰8：2.100，峰9：2.200，峰10：2.230。
实施例2 本发明脉花党参的指纹图谱检测
1)对照品溶液的制备
取绿原酸、木犀草苷、木犀草素及芹菜素对照品，精密称定，加50％乙醇制成各成分质量浓度各为0.2mg/mL的混合对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
称取脉花党参地上部分药材粉末(过四号筛)2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇80mL，称定质量，超声处理(功率100W，频率45kHz)45min，再称定质量，用50％乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件如下：
色谱柱：AcclaimTMPolarAdvantageⅡC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.4％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱((0～10min，17.5％B；10～20min，17.5％～21％B；20～30min，21％～22％B；30～40min，22％～25％B；40～45min，25％～30％B；45～50min，30％～62％B；50～60min，62％～65％B；60～66min，65％～75％B；66～70min，75％B)；体积流量1.0mL/min；检测波长220nm；柱温30℃。
4)分析色谱图
脉花党参指纹图谱中有10个共有特征峰，与绿原酸相应的色谱峰为峰2，与木犀草苷相应的色谱峰为峰4，与木犀草素相应的色谱峰为峰6，与芹菜素相应的色谱峰为峰7，以峰4为参照峰，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.275，峰3：0.685，峰5：1.500，峰8：2.100，峰9：2.200，峰10：2.230。
以下通过实验例来说明本发明的有益效果：
实验例1
1材料
1.1仪器
UItiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技中国有限公司)；BP121S十万分之一电子分析天平(公司)；Milli-Q超纯水机；KQ-500VDE双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)。
1.2试药
对照品绿原酸(批号MUST-21030304)、木犀草苷(批号MUST-20062810)、木犀草素(批号MUST-20102418)、芹菜素(批号MUST-21030615)均购于成都曼斯特生物科技有限公司，质量分数大于98％；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他均为分析纯。
18批灰毛党参、17批脉花党参、2批党参、1批长花党参及1批大花党参经成都中医药大学蒋桂华教授和四川省中医药科学院周毅研究员鉴定，分别为灰毛党参C.canescensNannf.、脉花党参C.foetens subsp.nervosa(Chipp)D.Y.Hong、党参C.pilosula(Franch.)Nannf.、长花党参C.thalictrifoliavar.mollis(Chipp)L.T.Shen、大花党参C.nervosavar.macrantha(Nannf.)L.T.Shen的干燥地上部分。实验样品信息见表1。
表1实验样品信息
2方法与结果
2.1 HPLC指纹图谱的建立
2.1.1对照品溶液的制备
取绿原酸、木犀草苷、木犀草素及芹菜素对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成各成分质量浓度为0.1180mg/mL、0.1100mg/mL、0.1270mg/mL、0.1190mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2供试品溶液的制备
称取灰毛党参和脉花党参药材粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25mL，称定质量，超声处理(功率100W，频率45kHz)45min，再称定质量，用50％乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.3色谱条件与系统适用性
色谱柱：AcclaimTMPolarAdvantageⅡC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.4％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱((0～10min，17.5％B；10～20min，17.5％～21％B；20～30min，21％～22％B；30～40min，22％～25％B；40～45min，25％～30％B；45～50min，30％～62％B；50～60min，62％～65％B；60～66min，65％～75％B；66～70min，75％B)；体积流量1.0mL/min；检测波长220nm；柱温30℃，进样量10μl。
2.1.4精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液，连续进样6次，以木犀草苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间的RSD值＜1.00％，相对峰面积的RSD值＜3.00％，表明仪器精密度良好。
2.1.5重复性试验
精密称取同一份样品6份，照“2.1.2”项下制备供试品溶液，进样，以木犀草苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间的RSD值＜1.00％，相对峰面积的RSD值＜3.00％，表明该方法重复性良好。
2.1.6稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液，分别在0、4、8、12、16和24h测定，以木犀草苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间的RSD值＜1.00％，相对峰面积的RSD值＜3.00％，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.1.7指纹图谱的建立和共有峰指认
2.1.7.1指纹图谱的建立
取18批灰毛党参及17批脉花党参样品，照“2.1.2”项下制备供试品溶液，照“2.1.3”项下的色谱条件进样分析，记录色谱图。原始数据经Chromeleon 7软件统一积分后，以cdf文件形式导出，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)。分别选择H6样品作为参照，生成灰毛党参对照指纹图谱，M15样品作为参照，生成脉花党参对照指纹图谱，以中位数法，时间宽度设为0.1min，经多点校正和Mark峰匹配后，分别生成HPLC叠加图谱和对照指纹图谱，共标定了10个共有峰，见图1-4。
2.1.7.2共有峰的指认
通过与对照品色谱峰的保留时间、紫外吸收光谱信息比对，共指认了4个共有峰：按保留时间依次为绿原酸(2号峰)，木犀草苷(4号峰)，木犀草素(6号峰)，芹菜素(7号峰)，选择峰面积较大、峰形良好且分离度较好的4号峰为参照峰(S)，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.275，峰3：0.685，峰5：1.500，峰8：2.100，峰9：2.200，峰10：2.230。混合对照品的HPLC图见图5。
2.3结果与分析
2.3.1相似度比较分析
以H6样品作为参照，生成灰毛党参对照指纹图谱，分别计算18批灰毛党参、17批脉花党参与灰毛党参对照指纹图谱的相似度，见表2。结果表明，灰毛党参的相似度在0.860～0.996之间，均在0.850以上，不同产地灰毛党参的整体质量较稳定；脉花党参相似度在0.028～0.827之间，相似度均在0.850以下，表明灰毛党参与脉花党参指纹图谱存在一定差异，故再分别对灰毛党参对照指纹图谱和脉花党参对照指纹图谱进一步分析，得出灰毛党参指纹图谱中，与参照峰的相对保留时间1.400处(其相对保留时间应在规定值的±2％范围之内)，存在一色谱峰，该色谱峰是灰毛党参中含有而脉花党参指纹图谱中未含有的，故通过该色谱峰能将灰毛党参与脉花党参有效区分。
表2 指纹图谱相似度结果
2.3.2 5种党参指纹图谱相似度比较
取目前藏医临床常用的5种藏党参样品，照“2.1.2”方法制备供试品溶液，照“2.1.3”项下的色谱条件进样，以灰毛党参对照指纹图谱为参照，进行相似度比较分析，见表3，色谱图见图6。结果表明灰毛党参、脉花党参二者的相似度在0.850以下，其余3种党参相似度均在0.300以下，说明其化学成分相差较大，该方法能初步将党参属植物区分。就5种党参相似度评价结果而言：党参属植物在藏医临床上的混用是否具有科学性，仍需作进一步研究。
表3 5种党参相似度结果
2.3.3聚类分析
将18批灰毛党参与17批脉花党参指纹图谱的10个共有色谱峰的峰面积组成10×35阶矩阵，导入SPSS 26.0软件中进行聚类分析。以共有峰峰面积作为变量，采用Ward聚类方法，平方欧式距离作为度量标准，Z得分进行数据标准化，得到聚类分析树状图，见图7。根据图7可以看出，在度量距离为20时，35批藏党参样品被分为2个类群，H1～H15、H7～H18、M10、M14、M16～M17为第一类，M1～M9、M12～M13、M15、H6为第二类。结果表明灰毛党参和脉花党参大部分样品能被分开，但也存在交叉现象，说明二者的相似度较高，这与相似度评价结果吻合。在度量距离为10时，35批藏党参样品被分为4个类群，H1～H5、H7～H18、M10为第一类，M14、M16～M17为第二类，H6、M3、M7、M15为第三类，M1～M2、M4～M6、M8～M9、M11～M13为第四类。结果表明相同基原样品多被聚到一类，且同一产地样品大多被聚到一类，但也存在部分分类距离差异明显的情况，这可能与其分布、海拔、气候、采收时间、贮藏时间等相关。
2.3.4主成分分析(PCA)
利用SPSS 26.0软件，以藏党参共有峰峰面积(x1～x10)为变量进行主成分分析。特征值及方差贡献率见表4。以特征值＞1为提取标准，得到3个主成分，累计方差贡献率为81.302％。选取出的主成分能分别反映出指纹图谱中绝大部分化学信息，具有代表性。
表4 主成分分析特征值和方差贡献率
主成分因子载荷矩阵见表5。由表5可知，x2～x5、x9在第一主成分上具有较高正载荷值；x6～x7在第二主成分上具有较高正载荷值；x1在第三主成分上具有较高正载荷值。
表5 主成分因子载荷矩阵
采用方差贡献率对灰毛党参和脉花党参质量进行综合评价，二者主成分综合评分见表6。由表6可知，脉花党参占据了综合得分前15名，综合得分整体明显高于灰毛党参，这可能与其成分相对含量高有关。灰毛党参以样品H12、H6、H18排名前三，即四川省炉霍县和西藏山南市雍布拉康藏药厂样品质量较佳；脉花党参以样品M1、M15、M14排名前三，即四川省德格县藏医院、西藏拉萨市蓝宝石药材公司及西藏芒康县红拉山垭口样品质量较佳。
表6 主成分综合评分
主成分得分图见图8。利用SIMCA14.1软件，采用自标度化法(UV)进行缩放，提取3个主成分，建立PCA模型，得到模型解释率参数R2X为0.813，表明提取的主成分可解释81.3％的原始变量，与上述主成分累积贡献率一致；灰毛党参与脉花党参样品整体大致可以分为2类，结果与聚类分析基本一致。说明二者整体相似度较高，且不同产地样品之间存在差异，同一产地不同样品之间也存在一定差异。
2.3.5正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)
为进一步分析引起样品差异的原因及标志物，故建立具有监督模式判别的OPLS-DA模型。将二者共有峰峰面积导入SIMCA14.1软件进行分析，OPLS-DA得分图见图9。结果显示灰毛党参和脉花党参模型解释率参数R2X＝0.858，R2Y＝0.947(越接近1越好)，模型预测能力参数Q2＝0.918(越接近1越好)，说明所建模型有较强的解释率、稳定性，预测性较高。
采用置换检验(n＝200)对当前模型进行验证，置换检验图见图10。结果显示检验参数R2＝(0.0，0.170)，Q2＝(0.0，-0.732)，R2＜0.200，Q2均＜0.050，说明二者所建模型可靠，不存在过度拟合现象，可以用于判别组间差异。
采用变量重要性投影值(VIP)筛选引起差异性的化合物，VIP越大，对组间差异的影响权重越大，VIP值图见图11。以VIP＞1为阈值，筛选出3个共有峰，分别为x5、x3、x4(木犀草苷)，x5、x3还有待鉴定。说明这些化合物是影响灰毛党参和脉花党参药材质量差异的标志物。
3、结论
本实验前期对流动相及检测波长进行了考察，流动相考察了水-乙腈、0.1％磷酸水溶液-乙腈、0.2％甲酸水溶液-乙腈、0.2％磷酸水溶液-乙腈及0.4％磷酸水溶液-乙腈等，以流动相为0.4％磷酸水溶液-乙腈较佳，出峰个数多，峰形较好，基线平稳；采用DVD检测器对样品进行了紫外-可见光全波长扫描，发现检测波长在220nm时，色谱信息较为丰富，整体峰形较好。另对柱温(25℃、30℃、35℃)、流速(1.2mL/min、1.0mL/min、0.8mL/min)、样品提取方法(超声、回流)、样品提取溶剂(70％甲醇、70％乙醇、50％甲醇、50％乙醇)、样品提取时间(60min、45min、30min)均进行了考察，最终得到本发明藏党参的检测方法。
本发明以灰毛党参与脉花党参的地上部分为研究对象，建立了HPLC指纹图谱，并通过对照品比对指认了4个峰，分别为绿原酸(2号峰)、木犀草苷(4号峰)、木犀草素(6号峰)及芹菜素(7号峰)。相似度评价结果表明：不同产地灰毛党参的相似度均在0.850以上，整体质量较稳定；相似度评价结果能初步反映化学成分的差异，以灰毛党参对照指纹图谱为参照，脉花党参的相似度均在0.850以下，其他3种党参的相似度均在0.300以下，表明该方法能初步将党参属植物区分，同时也反映出各品种之间化学成分差异较大，而藏医临床将党参属植物混用，其科学性还有待考究。由于其他党参批次有限，故还需进一步研究。通过本发明检测方法能将藏党参中灰毛党参与脉花党参有效区分。
从灰毛党参和脉花党参的聚类分析和主成分分析结果发现同基原样品多被聚到一类，且同一产地样品大多被聚到一类，该方法可将其区分开，但也存在部分分类距离差异明显的情况，这可能与其分布、海拔、采收时间等相关。由主成分综合得分可以看出，脉花党参综合得分整体明显高于灰毛党参，这可能与其化学成分相对含量高有关。
为进一步分析引起样品差异的原因及标志物，建立了具有监督模式判别的OPLS-DA模型，并采用置换检验进行验证，结果表明该模型可靠，不存在过度拟合现象，可以用于判别组间差异。共筛选出3个影响较大的差异性成分，分别为x5、x3、x4(木犀草苷)，其余成分还有待鉴定。
灰毛党参与脉花党参是藏医临床常用品种，本发明首次将二者地上部分的HPLC指纹图谱进行对比，结合化学模式识别方法，发现二者化学成分较其他品种差异更小，这为二者在藏医临床混用提供了一定依据。《四川省藏药材标准》(2020年版)仅收载了灰毛党参，而脉花党参作为藏党参的主流品种，且化学成分相对含量较高，有待继续进行二者在药效学等方面的对比研究。本研究为党参属的资源开发利用、药用部位的扩大及临床应用提供了数据支撑。
Claims (10)
1.一种藏党参的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)对照品溶液制备：取绿原酸、木犀草苷、木犀草素和/或芹菜素对照品，加乙醇溶液溶解，即得对照品溶液；
2)供试品溶液制备：取待检样品，加乙醇溶液提取，即得供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：220nm；流动相：以0.4％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；梯度洗脱程序0～10min，17.5％B；10～20min，17.5％～21％B；20～30min，21％～22％B；30～40min，22％～25％B；40～45min，25％～30％B；45～50min，30％～62％B；50～60min，62％～65％B；60～66min，65％～75％B；66～70min，75％B。
2.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤1)所述对照品溶液每1ml含各对照品0.1～0.5mg。
3.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤2)所述待检样品与乙醇溶液的质量体积比为1g：5～100ml。
4.根据权利要求1或3所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述乙醇溶液的浓度为25-75％，v/v，优选50％。
5.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述待检样品为藏党参的地上部分；所述藏党参为灰毛党参CodonopsiscanescensNannf.、脉花党参C.foetenssubsp.nervosa(Chipp)D.Y.Hong。
6.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取为超声提取，超声提取功率50～150W，频率25～65kHz，时间20～60min。
7.根据权利要求1所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：步骤3)所述色谱条件中色谱柱：AcclaimTMPolarAdvantageⅡC18，4.6×250mm，5μm，柱温25～35℃，进样量5～20μL，流速为0.8～1.2mL·min-1。
8.根据权利要求7所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述色谱条件中柱温30℃，进样量10μL，流速为1mL·min-1。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述指纹图谱中应有10个共有特征峰，与绿原酸相应的色谱峰为峰2，与木犀草苷相应的色谱峰为峰4，与木犀草素相应的色谱峰为峰6，与芹菜素相应的色谱峰为峰7，以峰4为参照峰，规定值1.000，计算其余各特征峰与参照峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内；规定值为：峰1：0.275，峰3：0.685，峰5：1.500，峰8：2.100，峰9：2.200，峰10：2.230。
10.一种鉴别灰毛党参和脉花党参的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取待检样品，按权利要求1～8任一项所述方法检测；所述待检样品为灰毛党参和/或脉花党参；
2)分析所得指纹图谱，所述指纹图谱中与参照峰的相对保留时间1.400±0.028处存在一色谱峰，判断该待检样品为灰毛党参；所述参照峰为木犀草苷相应的色谱峰。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114324666B (zh) | 2023-11-24 |
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