CN115144495B - 一种基于uplc指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法 - Google Patents
一种基于uplc指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115144495B CN115144495B CN202210768290.9A CN202210768290A CN115144495B CN 115144495 B CN115144495 B CN 115144495B CN 202210768290 A CN202210768290 A CN 202210768290A CN 115144495 B CN115144495 B CN 115144495B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methanol
- fingerprint
- sample
- vitex negundo
- uplc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000248021 Vitex negundo Species 0.000 title claims abstract description 47
- 235000010363 Vitex negundo Nutrition 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 title claims abstract 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 111
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 claims abstract description 14
- NDSUKTASTPEKBX-LXXMDOISSA-N Vitexin glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C=2C3=C(C(C=C(O3)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)C(O)=CC=2O)O[C@@H]1CO NDSUKTASTPEKBX-LXXMDOISSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000010239 partial least squares discriminant analysis Methods 0.000 claims description 28
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 11
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 4
- 241000532412 Vitex Species 0.000 description 17
- 235000009347 chasteberry Nutrition 0.000 description 17
- 241001643642 Viticis Species 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 2
- 241001073567 Verbenaceae Species 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- 241000258957 Asteroidea Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010049077 Hernia pain Diseases 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 206010047601 Vitamin B1 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 208000002894 beriberi Diseases 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000010081 sangu Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8696—Details of Software
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明涉及中药质量标准技术领域。本发明提供了一种基于UPLC指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法。包括如下步骤：(1)将原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素‑4‑O‑葡萄糖苷分别采用甲醇溶解，得到对照品溶液；(2)将样品用甲醇溶解，超声提取，过滤后得到供试品溶液；(3)将对照品溶液和供试品溶液进行UPLC分析，得到指纹图谱并计算样品相似度；(4)利用指纹图谱进行主成分分析和聚类分析，对数据进行归类；(5)归类后的数据进行分析，得出鉴定结果。在指纹图谱相似度评价基础上，将指纹图谱数据与化学计量学方法相结合，综合评价牡荆子的药材质量优劣，为进一步完善牡荆子的质量控制提供数据参考。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量标准技术领域，尤其涉及一种基于UPLC指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法。
背景技术
牡荆子为马鞭草科植物牡荆属牡荆的果实，主产华东各省及河北、湖南、湖北、广东、广西、四川、贵州、云南等，其中山东地区野生品产量较大，品质较佳，具有良好的药用价值。牡荆子具有除湿祛痰，止咳平喘，理气止痛的功效，主要用于咳嗽气喘，胃痛，泄泻，痢疾，疝气痛，脚气肿胀，白带，白浊等。
目前市场上流通的多为牡荆子、黄荆子及荆条种子的混用品，南方多为黄荆子，山东以野生牡荆子为主。牡荆子始载于梁·陶弘景集《名医别录》中，列为上品，曰：“生河间南阳宛朐山谷平寿、都乡高堤岸上，牡荆生田野”；“八月、九月采实，阴干”，推知当时使用的为牡荆果实。唐·苏敬《新修本草》注云：“牡荆作树，不为蔓生，故称为牡，非无实之谓也。”宋·苏颂《本草图经》谓：“牡荆，生河间、南阳、冤句三谷，或平寿、都乡高岸上及田野中。枝茎坚劲，作科不为蔓生，故称牡。叶如蓖麻，更疏瘦；花红作穗；实细而黄，如麻子大；或云即小荆也。八月、九月采实，阴干。”与今马鞭草科植物特征相符。从植物形态上虽较容易鉴别出牡荆子与黄荆子，但果实间的差异两者较难区分。
马鞭草科牡荆属有多种植物具有较高的药用价值，其中较常用的有单叶蔓荆、蔓荆、黄荆以及牡荆，由于亲缘关系较近对这些植物之间、来源于这些植物的生药之间的准确鉴别存在困难。如单叶蔓荆和蔓荆植物容易鉴别，果实之间准确鉴别难度较大。牡荆和黄荆植物与植物、果实与果实之间准确鉴别均较困难。就市场流通情况来看，存在以牡荆子、黄荆子假冒蔓荆子牟利的情况，这必然会给临床用药带来危害。因此很有必要建立快速、准确鉴别此类生药的方法，以确保临床用药安全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于UPLC指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法，为进一步完善牡荆子的质量控制提供数据参考。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于UPLC指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法，包括如下步骤：
(1)将原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素-4-O-葡萄糖苷用甲醇分别配置成溶液，得到对照品溶液；
(2)将样品用甲醇溶解，超声提取，过滤后得到供试品溶液；
(3)将对照品溶液和供试品溶液进行UPLC分析，得到指纹图谱并计算样品相似度；
(4)利用指纹图谱进行主成分分析和聚类分析，对数据进行归类；
(5)归类后的数据进行偏最小二乘-判别分析和正交偏最小二乘-判别分析，得出鉴定结果。
作为优选，步骤(1)和步骤(2)中所述甲醇的浓度独立的为60～80％。
作为优选，步骤(1)中所述原儿茶酸配置的溶液浓度为20.7～22.7μg/mL；对羟基苯甲酸配置的溶液浓度为20.8～22.8μg/mL；牡荆素-4-O-葡萄糖苷配置的溶液浓度为20～21.8μg/mL。
作为优选，步骤(2)中所述供试品的粒径为50～80目。
作为优选，步骤(2)中所述供试品和甲醇的用量比为1g：10～15mL。
作为优选，步骤(2)中所述超声的功率为400～600W，频率为30～50k Hz，时间为25～35min。
作为优选，步骤(2)中所述过滤时滤膜的孔径为0.20～0.24μm。
作为优选，步骤(3)中所述UPLC分析的条件为：以甲醇-0.08～0.12％磷酸水，梯度洗脱：0～10min，10～25％甲醇；10～15min，25～35％甲醇；15～20min，35～40％甲醇；20～30min，45～65％甲醇；30～35min，65～85％甲醇；35～40min，85～100％甲醇，流速为0.2～0.4mL/min，检测波长250～258nm，柱温25～35℃，进样量2～4μL。
作为优选，步骤(3)中所述计算样品相似度时采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算。
本发明提供了一种基于UPLC指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法。包括如下步骤：(1)将原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素-4-O-葡萄糖苷用甲醇分别配置成溶液，得到对照品溶液；(2)将样品用甲醇溶解，超声提取，过滤后得到供试品溶液；(3)将对照品溶液和供试品溶液进行UPLC分析，得到指纹图谱并计算样品相似度；(4)利用指纹图谱进行主成分分析和聚类分析，对数据进行归类；(5)归类后的数据进行分析，得出鉴定结果。本发明采用UPLC指纹图谱构建了一种可量化、综合的提供化学成分特征的色谱图。本实验通过UPLC建立了不同来源牡荆子及炒牡荆子的指纹图谱研究，标定了9个共有峰，经对照品比对，鉴定出了原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素-4-O-葡萄糖苷等3个共有峰。在指纹图谱相似度评价基础上，将指纹图谱数据与化学计量学方法相结合，综合评价牡荆子的药材质量优劣，为进一步完善牡荆子的质量控制提供数据参考。
附图说明
图1为20批牡荆子药材及炒牡荆子的UPLC指纹图谱；
图2为牡荆子药材指纹图谱特征峰的指认；
图3为20批牡荆子药材聚类分析树状图；
图4为PCA、PLS-DA、OPLS-DA拟合图摘要；
图5为PLS-DA模型排列图：A(DA1)、B(DA2)、C(DA3)；
图6为OPLS-DA模型排列图：A(DA1)、B(DA2)、C(DA3)；
图7为PCA(A)、PLS-DA(B)、OPLS-DA(C)得分散点图；
图8为PLS-DA和OPLS-DAVIP图：A(PLS-DA)、B(OPLS-DA)；
图9为PCA贡献得分图：A(S9、S19、S10、S20)、B(S1-S8)、C(S11-S18)；
图10为PLS-DA贡献得分图：A(S9、S19、S10、S20)、B(S1-S8)、C(S11-S18)；
图11为OPLS-DA贡献得分图：A(S9、S19、S10、S20)、B(S1-S8)、C(S11-S18)；
图12为PCA(A)、PLS-DA(B)、OPLS-DA(C)负载和得分双标图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
仪器：Waters ACQUITY超高效液相色谱仪(UPLC)(美国沃特世科技有限公司，PDA检测器，Empower色谱工作站)；ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；SB-5200DTS超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，BP211D型电子天平(Sartorius公司)，高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司、DFT-50A)
材料：原儿茶酸(批号：110809-200604)购自中国食品药品检定研究院；对羟基苯甲酸(批号：PS010297)、牡荆素-4-O-葡萄糖苷(批号：PS00696)均购自成都普斯生物科技股份有限公司；
HPLC级甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司，色谱纯)；屈臣氏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；磷酸(分析纯、天津市大茂化学试剂厂)；甲醇(分析纯、北京化工厂)；
本实验收集了十批不同产地的牡荆子药材，并对各批牡荆子药材进行了炮制。不同批次牡荆子实地采集信息见表1。S1～S10为牡荆子药材，S11～S20为炒牡荆子。
表1 10批牡荆子生品及10批炒牡荆子药材来源信息
| 编号 | 样品产地 | 样品批号 | 编号 | 样品炮制来源 |
| S1 | 山东 | 20211013 | S11 | 由S1炮制 |
| S2 | 河南 | 20210501 | S12 | 由S2炮制 |
| S3 | 河北 | 20210228 | S13 | 由S3炮制 |
| S4 | 山东 | 20211014(自采) | S14 | 由S4炮制 |
| S5 | 山东 | 20211116(自采) | S15 | 由S5炮制 |
| S6 | 湖北 | 20201114 | S16 | 由S6炮制 |
| S7 | 山东 | 20211117(自采) | S17 | 由S7炮制 |
| S8 | 河南 | 20201216 | S18 | 由S8炮制 |
| S9 | 安徽 | 20210301 | S19 | 由S9炮制 |
| S10 | 河北 | 20210402 | S20 | 由S10炮制 |
实施例1 UPLC条件
采用ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，以甲醇-0.1％磷酸水，梯度洗脱：10min，15％甲醇；12min，30％甲醇；18min，37％甲醇；25min，55％甲醇；32min，75％甲醇；37min，90％甲醇。流速0.3m L/min，检测波长254nm，柱温30℃，进样量3μL。
实施例2对照品溶液的制备
取原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素-4-O-葡萄糖苷对照品，精密称定，加入70％甲醇制成质量浓度分别为21.7μg/mL、21.8μg/mL、20.9μg/mL对照品溶液。
实施例3供试品溶液的制备
取各批次牡荆子样品，粉碎，过三号筛，精密称定2.0g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，称重，超声处理30min(功率500W，频率40k Hz)，取出，称重，70％甲醇补足重量，摇匀，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
实施例4方法学考察
1.精密度试验
按实施例3的方法制备牡荆子(S5)供试品溶液，实施例1的条件连续进样6次，记录色谱图。计算得到其他各共有峰相对保留时间及峰面积RSD均小于3.0％，表明仪器精密度良好。
2.稳定性试验
按实施例3的方法制备牡荆子(S5)供试品溶液，实施例1的条件下于0、2、4、8、10、12h分析测定，结果显示，各共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于3.0％，表明该供试品溶液在室温下放置12h稳定性良好。
3.重复性试验
按实施例3的方法平行制备6份供试品溶液，按实施例1的条件进样，以对羟基苯甲酸(2号峰)为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0％，表明该方法重复性良好。
实施例5指纹图谱的建立及相似度评价
将20批牡荆子及炒牡荆子按实施例3的方法制备供试品溶液，按实施例1的条件进样，将20批色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)本”软件进行评价，设定S7样品的图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.3，采用平均数法结合多点校正生成对照图谱，并进行相似度评价，20批牡荆子样品UPLC指纹图谱及对照指纹图谱见图1、2。共标定了9个共有峰，通过与对照品图谱比对，指认了其中3个色谱峰，即峰1为原儿茶酸、峰2为对羟基苯甲酸、峰6牡荆素-4-O-葡萄糖苷。峰2出峰时间靠前、峰面积适中且分离度良好，故选择对羟基苯甲酸(2号峰)为参照峰(S)，计算样品指纹图谱共有峰相对保留时间RSD均小于0.50％，表明这20批样品中9个共有峰保留时间较稳定；但共有峰相对峰面积RSD为13.04～73.22％，相差较大，表明各批次间这9个共有峰所代表化合物的含量存在较大差异，见表2。以对照指纹图谱为对照，计算各批次样品相似度，结果见表3，20批样品相似度均大于0.88。
表2 10批牡荆子和10批炒牡荆子峰面积
表3牡荆子药材和炒牡荆子相似度评价结果
实施例6化学模式识别
将从20批牡荆子样品指纹图谱中导出的共有峰峰面积导入EXCEL中，样品放入行，9个共有峰放入列，再将含有数据的EXCEL文件导入多元变量统计分析软件(SIMCA 14.1)软件中，以共有峰峰面积为自变量，进行主成分分析(PCA)，并进行聚类分析(HCA)，树状图见图3，树状图显示在约17～40距离间，20批样品被分为三类；对此三组数据分别进行偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)。PCA、PLS-DA、OPLS-DA的拟合图摘要分别见表4和图4；PLS-DA模型排列图见图5；OPLS-DA模型排列图见图6；得分散点图见图7；PLS-DA和OPLS-DA的VIP图见图8；PCA贡献得分图见图9；PLS-DA贡献得分图见图10；OPLS-DA贡献得分图见图11；PCA、PLS-DA、OPLS-DA的负载和得分双标图见图12。
表4 PCA、PLS-DA、OPLS-DA拟合图摘要
结果
图3树状图显示在17～40距离间，20批样品被分为三类，S9、S19、S10、S20为一类，S1-S8为一类，S11-S18为一类，聚类分析结果与实际情况一致，S9号样品来源于安徽亳州药材市场、S10号样品来源于河北安国药材市场，均非当年新采集样品，与当季新采样品相比，颜色灰暗没有光泽，香气欠浓郁。1-8号为正品牡荆子，11-18号为对应正品牡荆子的炮制品。
由表4和图4模型拟合图摘要可知，PCA模型结实率参数R2X(cum)为0.961，预测参数Q2(cum)为0.501；PLS-DA模型结实率参数R2X(cum)为0.92，区分参数R2Y(cum)为0.883，预测参数Q2(cum)为0.745；OPLS-DA模型结实率参数R2X(cum)为0.84，区分参数R2Y(cum)为0.856，预测参数Q2(cum)为0.773；均大于0.5，表明模型具有较好的预测准确性。为防止PLS-DA模型和OPLS-DA模型过拟合造成假阳性结果，设置分类Y矩阵变量按照默认的随机排列20次做置换检验，得PLS-DA模型排列图5和OPLS-DA模型排列图6。PLS-DA模型DA1、DA2、DA3的Q2回归线在Y轴截距分别为-0.646、-0.517、-0.52；OPLS-DA模型DA1、DA2、DA3的Q2回归线在Y轴截距分别为-0.539、-0.437、-0.558，表明所建立的模型没有出现过拟合现象，可用于判别分析20批样品的组间差异。
由图7PCA、PLS-DA、OPLS-DA得分散点图可知，20个样本没有明显的离群点，三种模型均能区分三个分组，但模型的解析能力和有效性方面，OPLS-DA＞PLS-DA＞PCA，OPLS-DA和PLS-DA较PCA能更好的区分样本组间差异。
PLS-DA和OPLS-DA模型中变量重要性投影值(variable Importance for theprojection，VIP值)可直观反映出具有统计学意义的差异标志物，结果见图8。在95％置信区间内，筛选出VIP＞1.0的色谱峰为差异标志物。PLS-DA模型中具有统计学意义的5个差异标志物的影响程度依次为峰9＞峰7＞峰5＞峰1＞峰2，峰3、峰4虽未达到统计学意义，但其VIP值分别为0.989和0.911。OPLS-DA模型中具有统计学意义的5个差异标志物的影响程度依次为峰9＞峰2＞峰1＞峰5＞峰4＞峰7，峰3虽未达到统计学意义，但其VIP值为0.945。
虽然VIP值可直观反映出具有统计学意义的差异标志物，但是并不能明确差异标志物的所属分组。由图9-图11三种模型贡献得分图可知，峰1、峰2、峰5、峰7、峰9对S9、S19、S10、S20正向贡献较大，峰3、峰4对S1-S8正向贡献较大，而S11-S18则没有峰对其有较大正向贡献。三种模型贡献得分图结果一致。从图12三种模型负载和得分双标图中更能直观的观察自变量色谱峰对各组的贡献。
由以上实施例可知，本发明提供了一种基于UPLC指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法。包括如下步骤：(1)将原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素-4-O-葡萄糖苷用甲醇分别配置成溶液，得到对照品溶液；(2)将样品用甲醇溶解，超声提取，过滤后得到供试品溶液；(3)将对照品溶液和供试品溶液进行UPLC分析，得到指纹图谱并计算样品相似度；(4)利用指纹图谱进行主成分分析和聚类分析，对数据进行归类；(5)归类后的数据进行分析，得出鉴定结果。本发明采用UPLC指纹图谱构建了一种可量化、综合的提供化学成分特征的色谱图。本实验通过UPLC建立了不同来源牡荆子及炒牡荆子的指纹图谱研究，标定了9个共有峰，经对照品比对，鉴定出了原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素-4-O-葡萄糖苷等3个共有峰。在指纹图谱相似度评价基础上，将指纹图谱数据与化学计量学方法相结合，综合评价牡荆子的药材质量优劣，为进一步完善牡荆子的质量控制提供数据参考。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于UPLC指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将原儿茶酸、对羟基苯甲酸、牡荆素-4-O-葡萄糖苷用甲醇分别配置成溶液，得到对照品溶液；
(2)将样品用甲醇溶解，超声提取，过滤后得到供试品溶液；
(3)将对照品溶液和供试品溶液进行UPLC分析，得到指纹图谱并计算样品相似度；
(4)利用指纹图谱进行主成分分析和聚类分析，对数据进行归类；
(5)归类后的数据进行偏最小二乘-判别分析和正交偏最小二乘-判别分析，得出鉴定结果；
步骤(3)中所述UPLC分析的条件为：以甲醇-0.08~0.12%磷酸水，梯度洗脱：0~10 min，10~25%甲醇；10~ 15 min，25~35%甲醇；15~20 min，35~40%甲醇；20~30 min，45~65%甲醇；30~35 min，65~85%甲醇；35~40 min，85~100%甲醇， 流速为0.2~0.4mL/min，检测波长250~258nm，柱温25~35℃，进样量2~4μL；
所述UPLC分析时采用ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱，色谱柱的规格为2.1 mm×100mm，粒径1.8 μm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述甲醇的浓度独立的为60~80%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述原儿茶酸配置的溶液浓度为20.7~22.7 µg/mL；对羟基苯甲酸配置的溶液浓度为20.8~22.8 µg/mL；牡荆素-4-O-葡萄糖苷配置的溶液浓度为20~21.8 µg/mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述供试品的粒径为50~80目。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述供试品和甲醇的用量比为1g：10~15mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述超声的功率为400~600 W，频率为30~50 k Hz，时间为25~35min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述过滤时滤膜的孔径为0.20~0.24µm。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述计算样品相似度时采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210768290.9A CN115144495B (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 一种基于uplc指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210768290.9A CN115144495B (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 一种基于uplc指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115144495A CN115144495A (zh) | 2022-10-04 |
| CN115144495B true CN115144495B (zh) | 2023-10-31 |
Family
ID=83410928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210768290.9A Active CN115144495B (zh) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | 一种基于uplc指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115144495B (zh) |
-
2022
- 2022-07-01 CN CN202210768290.9A patent/CN115144495B/zh active Active
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 4种牡荆属植物来源生药的近红外漫反射指纹图谱聚类分析;辛海量;胡园;张巧艳;郑汉臣;秦路平;;时珍国医国药(第12期);第3037-3038页 * |
| UPLC法同时测定五味沙棘散中7个成分的含量;王全巧;孙宝;;中国药师(第05期);第975-979页 * |
| 基于UFLC-IT-TOF-MS技术的牡荆子中2个木脂素在大鼠体内代谢研究;李月婷;孙晶;霍会霞;庞道然;孙慧;张云封;宋月林;屠鹏飞;赵云芳;李军;;中草药(第24期);第5117-5124页 * |
| 牡荆子和黄荆子的定性与定量鉴别研究;罗国良;汪洋;李华强;舒志恒;秦路平;郑承剑;;中草药(第17期);第3624-3628页 * |
| 牡荆的化学成分及药理作用研究进展;舒柄垚;彭新宇;魏文康;罗胜军;魏光伟;徐在言;唐兴刚;郭伟干;;动物医学进展(第05期);第105-110页 * |
| 蔓荆子与混淆品牡荆子的比较鉴别;陆大忠, 朱山寅;中药材(第04期);第179-181页 * |
| 蔓荆子化学成分研究;吴闯;张健;殷志琦;;药物生物技术(第06期);第504-507/564页 * |
| 蔓荆子炮制前后HPLC指纹图谱比较研究;李国卫;吴文平;索彩仙;孙冬梅;何民友;潘礼业;;广东药科大学学报(第02期);第200-204/209页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115144495A (zh) | 2022-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107389813A (zh) | 基于化学分类法及UPLC‑Tof‑MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法 | |
| Tian et al. | Simultaneous quantitative analysis of nine constituents in six Chinese medicinal materials from Citrus genus by high‐performance liquid chromatography and high‐resolution mass spectrometry combined with chemometric methods | |
| CN113759003B (zh) | 一种基于uplc指纹图谱和化学计量法的甘草产地判别方法 | |
| Jiang et al. | HPLC fingerprinting-based multivariate analysis of chemical components in Tetrastigma Hemsleyanum Diels et Gilg: Correlation to their antioxidant and neuraminidase inhibition activities | |
| CN113720931B (zh) | 一种三叶青药材的质量评价方法 | |
| CN110297060B (zh) | 一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱 | |
| Li et al. | Metabolic discrimination of different Rhodiola species using 1H-NMR and GEP combinational chemometrics | |
| CN117250298A (zh) | 奇楠沉香的液质指纹图谱的构建方法及其指纹图谱 | |
| Tanaka et al. | Quality evaluation of Astragali Radix using a multivariate statistical approach | |
| Wu et al. | Simultaneous qualitative and quantitative analysis of 10 bioactive flavonoids in Aurantii Fructus Immaturus (Zhishi) by ultrahigh‐performance liquid chromatography and high‐resolution tandem mass spectrometry combined with chemometric methods | |
| CN108267535B (zh) | 青皮药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱 | |
| CN115144495B (zh) | 一种基于uplc指纹图谱鉴定牡荆子和炒牡荆子的方法 | |
| Wei et al. | Evaluation of two parts of Lithocarpus polystachyus Rehd. from different Chinese areas by multicomponent content determination and pattern recognition | |
| CN110261512B (zh) | 基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法 | |
| CN114891131B (zh) | 一种粉条儿菜多糖的提取纯化工艺 | |
| Chen et al. | Comparative chemical and statistical analysis of cultivated and wild Radix Scutellariae | |
| CN113466363B (zh) | 一种鉴别硫磺熏蒸山楂的方法 | |
| CN115326974A (zh) | 枳壳药材的质量双标可视化质量控制技术 | |
| CN115267038A (zh) | 一种鉴别油菜蜂王浆的方法与应用 | |
| Nie et al. | Relationship between the UPLC Fingerprints of Citrus reticulata “Chachi” Leaves and Their Antioxidant Activities | |
| CN113804775A (zh) | 一种基于质谱技术的广藿香指纹图谱的构建方法及多指标定量评价方法 | |
| Zhang et al. | Study on the Correlation Between the Appearance Traits and Intrinsic Chemical Quality of Bitter Almonds Based on Fingerprint-Chemometrics | |
| CN109444275B (zh) | 一种快速筛查紫藤三叶青与青藤三叶青药材的方法 | |
| CN113640432A (zh) | 一种壮腰健身丸的质量评价方法 | |
| CN109490450B (zh) | 细叶石仙桃药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |