CN106324146A - 苦瓜叶的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苦瓜叶的HPLC指纹图谱检测方法，该方法包括对照品溶液的制备、参照物溶液的制备、对照指纹图谱的建立、供试品溶液的制备及检测。本发明通过多个工艺的筛选，将苦瓜叶中的多个成分有效分离并检测出来，所得的指纹图谱出峰多、各峰分离度良好，方法重复性好、精密度高，从而可以简便、快速、全面、准确、可靠地监控苦瓜叶药材的质量，为全面监控苦瓜叶的药材质量提供了有效的保障。

Description

苦瓜叶的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及药物质量控制方法技术领域，尤其涉及苦瓜叶的HPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

苦瓜叶为葫芦科苦瓜属一年生蔓性草本植物苦瓜(Momordica charantia L.)的干燥叶。性凉、味苦。具清热解毒、杀菌、止痢、止痛的功效，能治疗胃痛，痢疾，疔疮肿毒。苦瓜叶作为常用民间药，使用广泛，常用于治疗蚊虫叮咬后皮肤的红肿热痛、小儿痱子、热毒疮肿、杨梅疮、狗咬和鹅掌风。

苦瓜叶资源丰富，疗效确切，民间使用广泛，认可度高且方便易得，具有较好的开发价值。但是目前，国内外多对苦瓜果实进行多角度研究而其叶研究甚少，尚缺乏对苦瓜叶的质量评价方法和标准。

因此，为了确保苦瓜叶的质量和安全，需要一种检测方法，用于评估苦瓜叶的质量。考虑到中药材的成分繁多，且各个成分间容易相互影响，仅以一两个有效成分的含量难以全面评价中药的真实质量。因此，目前需要一种可以监控苦瓜叶中多个成分的检测方法，以更加全面地监控苦瓜叶的质量状况。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种苦瓜叶的HPLC指纹图谱检测方法，它包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取苦瓜叶药材粉末，50％甲醇提取，过滤，得苦瓜叶对照品溶液；

(2)参照物溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品，加入甲醇，得到参照物溶液；

(3)对照指纹图谱的建立：

分别取参照物溶液和由不同批次苦瓜叶药材制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪检测，得到各批次药材和参照物的色谱数据；色谱条件如下：

检测波长：250nm；

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈；

梯度洗脱程序如下：

对所得色谱数据进行处理，建立苦瓜叶的对照指纹图谱；

(4)供试品溶液的制备：取待测药材，按照步骤(1)相同的方法制备得到供试品溶液；

(5)按照步骤(3)相同的色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所得色谱图与对照指纹图谱进行比对，可鉴别出苦瓜叶及其质量状况。

进一步地，步骤(1)中，所述提取是超声提取或回流提取。

进一步地，所述回流提取的时间为1-2小时，超声提取的时间为0.5-1小时；优选超声提取0.5小时。

进一步地，步骤(1)中，所述提取的温度是40℃。

进一步地，步骤(1)中，所述药材与50％甲醇溶液的重量体积比为1g:25mL。

进一步地，所述C18色谱柱为迪马C18色谱柱，色谱柱的规格为250mm×4.6mm，5μm

进一步地，所述色谱条件的柱温为25～35℃；更进一步地，所述柱温为30℃。

进一步地，所述色谱条件的流速为1.0mL/min。

进一步地，所述对照指纹图谱如图8中的R所示。

本发明通过多个工艺的筛选，将苦瓜叶中的多个成分有效分离并检测出来，所得的指纹图谱出峰多、各峰分离度良好，方法重复性好、精密度高，从而可以简便、快速、全面、准确、可靠地监控苦瓜叶药材的质量，为全面监控苦瓜叶的药材质量提供了有效的保障。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为人参皂苷Rg1的色谱图。

图2为甲醇提取色谱图。

图3为50％甲醛提取色谱图。

图4为回流提取1h色谱图。

图5为回流提取2h色谱图。

图6为超声提取30min色谱图。

图7为超声提取1h色谱图。

图8为10批不同产地苦瓜叶HPLC指纹色谱图的叠加图，R代表对照指纹图谱；S1-S10代表不同产地10批次苦瓜叶样品色谱图谱。

图9为不同产地苦瓜叶药材的共有模式图谱。

图10为空白实验中，50％甲醇色谱图。

图11为苦瓜叶指纹图谱稳定性试验相似度评价叠加图。

图12为苦瓜叶指纹图谱重复性试验相似度评价叠加图。

图13为苦瓜叶指纹图谱仪器精密度试验相似度评价叠加图。

具体实施方式

下述实施例所用实验材料如下：

不同采收地点的样品于2011年8月前后分别采自四川省成都市、彭州市、简阳市、内江市、自贡市、宜宾市及河北保定，浙江嘉兴，广东佛山等地。采集新鲜叶，除去杂质，阴干即得。以上实验样品均经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为葫芦科植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥叶。样品采集地点、时间及生长环境见表1。

于2011年8月20日对口采于四川省彭州市敖平镇，经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为葫芦科苦瓜属植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥叶，作为对照药材；所用试剂均为分析纯。

表1不同产地苦瓜叶样品

仪器如下：

Agilent 1200型HPLC高效液相色谱仪，电子恒温水浴锅(北京中兴DZKW-4)，超声波清洗器(昆山KQ5200E)，十万分之一电子天平(德国SartoriusBP211D)。

试剂如下：

人参皂苷Rg1(中国食品药品检定研究院，批号110703-201128)，甲醇(分析纯)，甲醇(色谱纯)，乙腈。

实施例1工艺参数的筛选

1、色谱条件的筛选

(1)检测波长考察

取(表1中7号样)苦瓜叶药材粉末2.0g，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加入50％甲醇50mL，称重，超声提取30min，冷却，用50％甲醇补足至原重，用0.45μm的微孔滤膜滤过，得供试液。吸取10μl，记录供试液在全波长扫描下的色谱图。通过比较3D色谱图，发现在250nm波长下各峰吸收较强且分离度较好，因此将检测波长定为250nm。

(2)色谱条件

取供试液20μl，注入高效液相色谱仪，记录在250nm检测波长下流动相为乙睛-水、甲醇-水的色谱图。从色谱图可以看到，乙睛-水系统分离效果相对较好，甲醇-水系统未能有效分离各峰。因此，选定乙睛-水作为本指纹图谱的色谱流动相。

考察柱温25℃、30℃、35℃，以优化色谱条件。从色谱图可以看到，柱温对色谱峰的分离效果影响不大，故选择柱温为30℃。

从色谱图可以看到，保留时间在80min以后已无其他色谱峰出现。因此将苦瓜叶药材指纹图谱的检测时间定为80min。确定色谱条件如下：

流动相：水(A)、乙腈(B)；

色谱柱：迪马C18Ser#6001573；

柱温：30℃；

检测波长：250nm；

检测时间：80min；

进样量：20μl；

流速：1mL/min。

流动相梯度如下所示：

测定法：吸取对照品溶液2μl、供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录在250nm检测波长下的色谱图。

2、对照品溶液的制备

本试验选择人参皂苷Rg1作为外标参照，采用色谱图中峰面积相对较大，比较稳定的出峰时间在32.442min的物质峰作为参照物，标记为S。

取干燥至恒重的人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，置于50mL容量瓶中，加入甲醇，定容，摇匀，配制成每1mL含有40μg对照品的溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过。吸取对照溶液2μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

3、供试品溶液制备方法考察

(1)提取溶剂选择

取(表1中7号样)苦瓜叶药材粉末2.0g，精密称定，置于250mL锥形瓶中，分别加入50％甲醇、甲醇，称重，超声处理30分钟后，冷却，用相应提取溶剂补足至原重，摇匀，过滤，用0.45μm的微孔滤膜滤过。滤液置于棕色容量瓶中，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图2、3所示。

结果显示：采用溶剂50％甲醇提取苦瓜叶药材，色谱峰数目多，峰值高，信息量丰富，且峰形较好，分离度佳。故选择50％甲醇作为提取溶剂。

(2)提取方法选择

取7号药材粉末2.0g，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加入50％甲醇50mL，称重，分别回流提取1h、回流提取2h、超声提取30min、超声提取1h后，冷却，用50％甲醇补足至原重，摇匀，过滤，用0.45μm的微孔滤膜滤过。滤液置于棕色容量瓶中，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图4-7所示。

结果显示：采用上述的提取方法，样品的峰数、分离度、峰形均较佳，最终选择超声处理30min。

因此，最终供试品的制备方法确定为：

取苦瓜叶药材粉末2.0g，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加入50％甲醇50mL，称重，超声提取30min后，冷却，用50％甲醇补足至原重，摇匀，过滤，用0.45μm的微孔滤膜滤过。滤液置于棕色容量瓶中，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

实施例2本发明的方法及其方法学验证

1、药材HPLC对照指纹图谱的建立

(1)不同产地苦瓜叶药材HPLC指纹图谱及对照指纹图谱

取表1中10批苦瓜叶药材，照实施例1下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并且按照实施例1下的色谱条件下实验，记录HPLC色谱图。

结果显示：HPLC色谱图以保留时间约为32.431min的2号峰作为参照峰(S)，其保留时间及峰面积为1，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.5％，相对峰面积的RSD均较大，用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算色谱的相似度，得到苦瓜叶药材色谱对照图谱，见表2、表3及图8。

表2苦瓜叶指纹图谱共有峰相对保留时间

表3苦瓜叶指纹图谱共有峰相对峰面积

(2)苦瓜叶HPLC指纹图谱共有模式的确定

根据苦瓜叶样品的HPLC图谱，以国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”对指纹图谱进行分析，生成共有模式，得到7个特征峰，分别标记为1，2，3……7。见图9。

(3)苦瓜叶药材的相似度评价

以苦瓜叶药材对照指纹图谱为参照，采用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”，分别与苦瓜叶药材进行相似度评价，结果见表4。

表4 10批苦瓜叶药材指纹图谱与对照指纹图谱的相似度

由上表可知，苦瓜叶药材指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.9，相似性良好，反映了药材的同源性。由图8，可知10批苦瓜叶在主要成分上无明显差异。

2、HPLC指纹图谱方法学验证

(1)空白实验

精密吸取50％甲醇20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。实验结果表明，提取溶剂不干扰实验测定。色谱图见图10。

(2)稳定性实验

取(7号)苦瓜叶药材，照实施例1下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12h共5个时间点(分别编号1～5)在实施例1下的色谱条件下实验，记录HPLC色谱图。

结果显示：HPLC色谱图以保留时间约为32.431min的2号峰作为参照峰(S)，其保留时间及峰面积为1，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.5％，相对峰面积的RSD均小于5.0％，用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算色谱的相似度，为0.998、0.996、0.999、0.997、0.995，RSD值为0.15％，表明供试品溶液在12h内稳定。见表5、6及图11。

表5稳定性实验共有峰相对保留时间

表6稳定性实验共有峰相对峰面积

(3)重复性实验

取(7号)苦瓜叶药材，5份，照实施例1下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在实施例1的色谱条件下实验，记录HPLC色谱图。

结果显示：HPLC色谱图以保留时间约为32.431min的2号峰作为参照峰(S)，其保留时间及峰面积为1，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.4％，相对峰面积的RSD均小于3.5％，用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算色谱的相似度，均为1.000。见表7、8及图12。

表7重复性实验共有峰相对保留时间

表8重复性实验共有峰相对峰面积

(4)仪器精密度试验

取(7号)苦瓜叶药材，照实施例1下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在实施例1的色谱条件下实验，连续进样5次，记录HPLC色谱图。

结果显示：HPLC色谱图以保留时间约为32.431min的2号峰作为参照峰(S)，其保留时间及峰面积为1，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.5％，相对峰面积的RSD均小于5.0％，用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算色谱的相似度，为0.999、0.997、0.997、0.996、0.999，均大于0.99，RSD值为0.13％，表明仪器精密度良好。见表9、10及图13。

表9精密度实验共有峰相对保留时间

表10精密度实验共有峰相对峰面积

综上所述，本发明通过多个工艺的筛选，将苦瓜叶中的多个成分有效分离并检测出来，所得的指纹图谱出峰多、各峰分离度良好，方法重复性好、精密度高，从而可以简便、快速、全面、准确、可靠地监控苦瓜叶药材的质量，为全面监控苦瓜叶的药材质量提供了有效的保障。

Claims (10)

1.苦瓜叶的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取苦瓜叶药材粉末，50％甲醇提取，过滤，得苦瓜叶对照品溶液；

(2)参照物溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品，加入甲醇，得到参照物溶液；

(3)对照指纹图谱的建立：

分别取参照物溶液和由不同批次苦瓜叶药材制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪检测，得到各批次药材和参照物的色谱数据；色谱条件如下：

检测波长：250nm；

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈；

梯度洗脱程序如下：

对所得色谱数据进行处理，建立苦瓜叶的对照指纹图谱；

(4)供试品溶液的制备：取待测药材，按照步骤(1)相同的方法制备得到供试品溶液；

(5)按照步骤(3)相同的色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所得色谱图与对照指纹图谱进行比对，可鉴别出苦瓜叶及其质量状况。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取是超声提取或回流提取。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述回流提取的时间为1-2小时，超声提取的时间为0.5-1小时；优选超声提取0.5小时。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取的温度是40℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述药材与50％甲醇溶液的重量体积比为1g:25mL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述C18色谱柱为迪马C18色谱柱，色谱柱的规格为250mm×4.6mm，5μm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为25～35℃。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述柱温为30℃。

9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的流速为1.0mL/min。

10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于：所述对照指纹图谱如图8中的R所示。