CN107782831A - 一种三七、人参和西洋参的辨别法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析医药化学领域,涉及一种三七、人参和西洋参分辨法方法。该方法以三种植物花HPLC指纹图谱作为判断标准,具有人参皂苷Rb3信号峰的花为三七花;Rb3信号峰相对于三七花信号峰不明显,且人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积等于37:10为西洋参花;不具有Rb3信号峰,且同时具有皂苷Re和人参皂苷Rg1信号峰为人参花。本发明第一次以花作为三七、人参和西洋参的辨别依据,在合理选择标准样品的基础上,根据三种植物HPLC指纹图谱差异性,可以准确、高效地将三种植物区分开。经过稳定性实验、重复性实验,确定本实验方法稳定性、精密度和重现性良好。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,涉及一种三七、人参和西洋参的分辨法方法,具体为一种基于三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱分析方法及用该方法进行三种植物辨别方法。
背景技术
三七花为五加科人参属植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)花序的干燥品;人参花,为五加科人参属植物人参(Panax ginseng C.A.Mey.)的花序;西洋参花是五加科人参属植物西洋参(Panax quinquefoliumL.)的花序;三者均以总花梗较短,身干,小花紧凑,体重个大,绿色者为佳。由于三者外观可分辨度低,且三七花价格较其余两者高,造成了市场上三七花质量的良莠不齐,三者混用的现象,为人们购买和食用三七花造成了困扰与不便。
目前,对三七花、人参花、西洋参花三者的鉴别尚未见报道。国内外对三七,人参,西洋参的研究多集中在根部,已有的一些报道也是多数关于三种花的药理作用以及化学成分等方面。因此,高效、快速、准确鉴别三七花、西洋参花和人参花的质量评价和品种成为当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种三七、人参和西洋参的分辨法方法,可高效、快速、准确地鉴别三七花、西洋参花和人参花,为日常生产、试验、种植三种植物提供参考依据。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种三七、人参和西洋参辨别法,该方法以三种植物花HPLC指纹图谱作为判断标准,以三七皂苷R1,人参皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb3、Rb2作为标准品:具有人参皂苷Rb3信号峰的花为三七花;Rb3信号峰相对于三七花信号峰不明显,且人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积等于37:10为西洋参花;不具有Rb3信号峰,且同时具有皂苷Re和人参皂苷Rg1信号峰为人参花;即通过相应花品种确定后即可判断对应植物品种。所述信号峰即经过HPLC测定后确定的色谱峰。
其中,三七皂苷R1浓度为0.54mg/ml,人参皂苷Rb1浓度为1.08mg/ml、人参皂苷Re浓度为1.83mg/ml、人参皂苷Rg1浓度为0.55mg/ml、人参皂苷Rb3浓度为0.95mg/ml、人参皂苷Rb2浓度为1.07mg/ml。以上皂苷均购买于中国药品生物制品检定所,各标准品浓度均由色谱甲醇定容。
上述辨别方法中,三七花判断标准为:具有人参皂苷Rb3信号峰,同时人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积比等于1:3。但人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积比等于1:3或具有人参皂苷Rb3信号峰并非要求同时具备,只要具备人参皂苷Rb3信号峰即可将三七花从三种花中分辨出来。
上述辨别方法中,西洋参花判断标准为:人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积等于37:10,且仅具有Re信号峰而不具有Rg1信号峰。以上条件并不要求同时具备,仅要求Rb3信号峰相对于三七花信号峰不明显,且人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积等于37:10,即可将西洋参花与人参花区别开来。
上述辨别方法中,人参花判断标准为:既具有Re也具有Rg1信号峰。该标准既可以作为人参花的分辨标准,也是进一步验证上述三七花和西洋参花判断正确性。
上述辨别方法中,HPLC指纹图谱紫外-分光光度法波长为203nm波长;试验样品在进行HPLC测定前进行如下处理:采用大孔吸附树脂D101吸附,60%乙醇溶液洗脱至完毕。
上述辨别方法中,HPLC色谱条件为:采用反相C18色谱柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm;A相流动相:B相有机相分别为乙腈(色谱纯)和水。
上述辨别方法中,流动相梯度洗脱程序为:0-12min,A相:B相洗脱体积比=19:81;1ml/min匀速变化至60-90min,A相:B相洗脱体积比=36:64;1ml/min匀速变化至95min,A相:B相洗脱体积比=19:81,直至洗脱完毕。
本发明还提供一种三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱分析方法,该方法包括如下步骤:
(1)经色谱甲醇定容获得的:浓度为0.54mg/ml的三七皂苷R1、浓度为1.08mg/ml人参皂苷Rb1、浓度为1.83mg/ml人参皂苷Re、浓度为0.55mg/ml人参皂苷Rg1、浓度为0.95mg/ml人参皂苷Rb3、浓度为1.07mg/ml人参皂苷Rb2作为对照品,经过HPLC测定后获得标准色谱图;
(2)将获得的三七花、人参花、西洋参花供试品溶液经过与步骤(1)相同条件HPLC测定获得三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱;
(3)比较分析步骤(1)获得的标准色谱图和步骤(2)获得的HPLC指纹图谱信号峰保留时间和峰面积,判断分析三七花、人参花、西洋参花HPLC指纹图谱特征和差异。
上述分析方法,其特征在于:所述HPLC分析所用实验波长为203nm,试验样品在进行HPLC测定前进行如下处理:采用大孔吸附树脂D101吸附,60%乙醇溶液洗脱。
上述分析方法,其中,所述HPLC分析色谱柱为反相C18色谱柱,A相流动相和B相有机相分别为乙腈和水,流动相梯度洗脱程序为:0-12min,A相:B相洗脱体积比=19:81;1ml/min匀速变化至60-90min,A相:B相洗脱体积比=36:64;1ml/min匀速变化至95min,A相:B相洗脱体积比=19:81,直至洗脱完毕。
本发明具有如下优点:
1.本发明第一次以花作为三七、人参和西洋参的辨别依据,在合理选择标准样品的基础上,根据三种植物HPLC指纹图谱差异性,可以准确、高效地将三种植物区分开。经过稳定性实验、重复性实验,皂苷的保留时间稳定性、精密度和重复性相对标准偏差(RSD)均小于0.5%;峰面积相对标准偏差(RSD)均小于1.0%,说明本实验方法稳定性、精密度和重现性良好。
2.本发明通过对比分析,确定在203nm处三种植物花供试品及标准品特征峰干扰小、精密度和分离度良好,具有最佳的实验效果。
3.本发明以甲醇超声处理作为对照,确定在HPLC测定前,采用大孔吸附树脂(D101),用60%乙醇溶液进行洗脱,所得检测品出峰分离度好,主要成分特征性强、重现性、稳定性良好。
附图说明
图1光谱扫描曲线图
图2混合对照品HPLC色谱图
图3三七花HPLC指纹图谱
图4人参花HPLC指纹图谱
图5西洋参花HPLC指纹图谱
图6三七花、人参花和西洋参花HPLC指纹图谱叠加图
图7人参花和西洋参花HPLC指纹图谱叠加图
图8三七花和西洋参花HPLC指纹图谱叠加图
图9三七花和人参花HPLC指纹图谱叠加图
图10三七花、人参花和西洋参花三维HPLC色谱图
图中附图标记为:
1.人参花;2.三七花;3.西洋参花
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明。本发明中,所有物品为日常采用商品。
实施例1:
1仪器与材料
1.1仪器
日本岛津(LC-20AT)型高效液相色谱仪HPLC、SPD-20A紫外-可见检测器、恒温水浴锅(HH-4)。
1.2材料
药材:三七花、人参花、西洋参花,三种花经***教授鉴定为正品三七花、人参花、和西洋参花。
试剂:甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、大孔吸附树脂(D101)、95%乙醇、甲醇(分析纯)均为国药集团化学试剂有限公司产品、纯净水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱:反相C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:有机相:乙腈(A),水相:水(B);进样量:20μl;柱温:25℃;流动相梯度洗脱程序(见表1)。
表1 流动相梯度洗脱程序
Tab 1.The gradient of mobile phase in HPLC
2.2溶液的制备
2.2.1标准品溶液的制备
选择标准品:三七皂苷R1(批号:110745-201619,中国药品生物制品检定所)、人参皂苷Rb1(批号:110704-201625,中国药品生物制品检定所)、人参皂苷Rg1(批号:110703-201027,中国药品生物制品检定所)、人参皂苷Re(批号:110754-201525,中国药品生物制品检定所)、人参皂苷Rb3(批号:111686-201504,中国药品生物制品检定所)、人参皂苷Rb2(批号:111715-201203,中国药品生物制品检定所)。
分别精密量取标准品三七皂苷R1和人参皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb3、Rb2适量,各用色谱甲醇定容,得到浓度分别为三七皂苷R1(0.54mg/ml),人参皂苷Rb1(1.08mg/ml)、Re(1.83mg/ml)、Rg1(0.55mg/ml)、Rb3(0.95mg/ml)、Rb2(1.07mg/ml)的标准品贮备液。再分别精密量取上述对照品贮备液各1ml置于容量瓶中,作为混合标准品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
精密称取三种花药材粗粉各1g,置于250ml锥形瓶中,精密加入水20ml,置水浴锅上水浴加热1h,放冷过滤,收集滤液,通过D101型大孔吸附树脂,水洗脱至无色,再用60%乙醇洗脱50ml,收集60%乙醇洗脱液,滤液浓缩至干,加甲醇溶解定容到10ml,从中精密吸取1ml,再定容至10ml容量瓶,稀释液用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得供试品溶液。
2.3标准品HPLC指纹图谱的分析
精密量取“2.2.1”中的标准品溶液,依照“2.1”项下色谱条件在203nm波长处进行测定,进样量20μl,HPLC色谱图如图2所示:
2.4三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱分析
分别量取依照“2.2.2”制备方法而制的三种花的供试品溶液,依照“2.3”项下色谱条件进行测定,进样量20μl,保存所得HPLC色谱图,见图3-10。由图3-10三种花的HPLC指纹图谱结合图2可以看出人参花和西洋参花共有峰5(Rb2),人参花中有独有峰2(Rg1),三七花中独有峰4(Rb1)。
2.5数据分析
依据对照品保留时间并结合所查阅的文献资料,与样品的保留时间作比较,来确定所测样品中的色谱峰的性质及峰面积,见表2。
表2.三七皂苷、人参皂苷对照品、三七花、人参花及西洋参花的保留时间(Tr)和峰面积(Area)
2.6指纹图谱的鉴别
通过本实验证明了三七花中含有较高的人参皂苷Rb3,为其HPLC色谱图主要特征,通过对比人参花和西洋参花HPLC色谱图发现在与对照品Rb3相同位置的地方,人参花和西洋参花均有一小峰出现,但色谱峰不明显,峰面积也非常小,对于这种现象还有待进一步研究,不过可以以此与人参花、西洋参花作区别;同时从对照品Rb2和Rb3可以看出,人参花没有峰6(Rb3)的出现,并且西洋参花和三七花中皂苷Rb2和皂苷Rb3的峰面积比值有着很明显的差异,故也可作为西洋参花和三七花鉴别的指标之一,比值分别为西洋参花Rb2:Rb3=37:10;三七花Rb2:Rb3=1:3。从HPLC色谱图中可知人参花和西洋参花中含有较高的人参皂苷Re,且人参花的皂苷Re邻近位置有人参皂苷Rg1,而西洋参花中皂苷Re附近没有检测到皂苷Rg1,所以可用于区别西洋参花和人参花。
3方法学考察
3.1精密度实验
分别精密量取三种花的供试品溶液,依照“2.3”项下色谱条件测定,三种花分别连续进样5次,以人参皂苷Re、Rb3为对照峰分析三种花所得色谱图中特征峰的保留时间和峰面积,并计算RSD。其三七花中Rb3峰保留时间RSD为0.15%,峰面积RSD为0.85%;人参花中Re峰保留时间RSD为0.23%,峰面积RSD为0.76%;西洋参花中Re峰保留时间RSD为0.21%,峰面积为0.73%,表明仪器精密度良好。
3.2稳定性实验
分别精密量取三种花的供试品溶液,三种花各搁置0h、12h、24h、36h、48h后,依照“2.3”项下的色谱条件进行指纹图谱测定,以人参皂苷Re、Rb3为对照峰分析三种花所得色谱图中特征峰的保留时间和峰面积,并计算RSD。其三七花中Rb3峰保留时间RSD为0.12%,峰面积RSD为0.61%;人参花中Re峰保留时间RSD为0.17%,峰面积RSD为0.55%;西洋参花中Re峰保留时间RSD为0.15%,峰面积RSD为0.47%,表明供试品溶液在48h内稳定性良好。
3.3重复性实验
分别精密称取同一批三种花各6份,依照“2.2.2”制备方法分别对三种花进行供试品溶液的制备,并分别依照“2.3”项下的色谱条件测定,以人参皂苷Re、Rb3为对照峰分析三种花所得色谱图中特征峰的保留时间和峰面积,并计算RSD。其三七花中Rb3峰保留时间RSD为0.21%,峰面积RSD为0.90%;人参花中Re峰保留时间RSD为0.33%,峰面积RSD为0.97%;西洋参花中Re峰保留时间RSD为0.31%,峰面积RSD为0.85%,表明本方法重现性良好。
3.4波长的选择
实验开始前,对波长范围的选择进行了预实验,分别进行选择波长200nm、203nm、210nm进行紫外光谱扫描,比较三个波长下的色谱图,综合分析发现三种花对照品及供试品在203nm处的峰信号强度大而且出峰多,主要特征峰干扰小、精密度和分离度均良好。因而确定本实验检测波长定为203nm。
3.5样品的处理
实验中先试用了甲醇超声处理,进样结果显示杂质峰很多且特征峰分离效果不好,后又采用大孔吸附树脂(D101),用60%乙醇溶液进行洗脱。比对发现经洗脱后所得的供试品溶液图谱出峰分离度好,主要成分峰特征性强,重现性、稳定性都良好。
以上所述三种花HPLC色谱图检测方法经过方法学的考察,其人参皂苷Rb3和Re的保留时间的稳定性、精密度和重复性相对标准偏差(RSD)均小于0.5%;峰面积的相对标准偏差(RSD)均小于1.0%,说明本实验方法稳定性、精密度和重现性均良好,可用于三种花HPLC指纹图谱的鉴别研究。
可以知道,上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式,然而本发明不仅限于此,本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下,可以做出各种改进和变更,这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种三七、人参和西洋参的辨别法,其特征在于,该方法以三种植物花HPLC指纹图谱作为判断标准,具有人参皂苷Rb3信号峰的花为三七花;Rb3信号峰相对于三七花信号峰不明显,且人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积等于37:10为西洋参花;不具有Rb3信号峰,且同时具有皂苷Re和人参皂苷Rg1信号峰为人参花;即通过相应花品种确定后即可判断对应植物品种;
其中,三七皂苷R1浓度为0.54mg/ml,人参皂苷Rb1浓度为1.08mg/ml、人参皂苷Re浓度为1.83mg/ml、人参皂苷Rg1浓度为0.55mg/ml、人参皂苷Rb3浓度为0.95mg/ml、人参皂苷Rb2浓度为1.07mg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种三七、人参和西洋参的辨别法,其特征在于,三七花判断标准为:具有人参皂苷Rb3信号峰,同时人参皂苷Rb2和Rb3信号峰面积比为1:3。
3.根据权利要求1所述的一种三七、人参和西洋参的辨别法,其特征在于,西洋参花判断标准为:人参皂苷Rb3信号峰相对于三七花信号峰不明显,Rb2和Rb3信号峰面积等于37:10,且仅具有Re信号峰而不具有Rg1信号峰。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,人参花判断标准为:不具有Rb3信号峰,具有Re和Rg1信号峰。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种三七、人参和西洋参的辨别法,其特征在于,HPLC指纹图谱紫外-分光光度法波长为203nm波长;试验样品在进行HPLC测定前进行如下处理:采用大孔吸附树脂D101吸附,60%乙醇溶液洗脱。
6.根据权利要求5所述的一种三七、人参和西洋参的辨别法,其特征在于,色谱条件为:采用反相C18色谱柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm;A相流动相:B相有机相分别为乙腈和水。
7.根据权利要求6所述的一种三七、人参和西洋参辨别法,其特征在于,流动相梯度洗脱程序为:0-12min,A相:B相洗脱体积比为19:81;1ml/min匀速变化至60-90min,A相:B相洗脱体积比为36:64;1ml/min匀速变化至95min,A相:B相洗脱体积比为19:81,直至洗脱完毕。
8.一种基于三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱分析方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)经色谱甲醇定容获得的:浓度为0.54mg·ml-1的三七皂苷R1,浓度为1.08mg/ml人参皂苷Rb1、浓度为1.83mg/ml人参皂苷Re、浓度为0.55mg/ml人参皂苷Rg1、浓度为0.95mg/ml人参皂苷Rb3、浓度为1.07mg/ml人参皂苷Rb2作为对照品,经过HPLC测定后获得标准色谱图;
(2)将获得的三七花、人参花、西洋参花供试品溶液经过与步骤(1)相同条件HPLC测定获得三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱;
(3)比较分析步骤(1)获得的标准色谱图和步骤(2)获得的HPLC指纹图谱信号峰保留时间和峰面积,判断分析三七花、人参花、西洋参花HPLC指纹图谱特征和差异。
9.根据权利要求8所述的一种基于三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱分析方法,其特征在于:所述HPLC分析所用实验波长为203nm,试验样品在进行HPLC测定前进行如下处理:采用大孔吸附树脂D101吸附,60%乙醇溶液洗脱。
10.根据权利要求8所述的一种基于三七花、人参花、西洋参花的HPLC指纹图谱分析方法,其特征在于:所述HPLC分析色谱柱为反相C18色谱柱,A相流动相和B相有机相分别为乙腈和水,流动相梯度洗脱程序为:0-12min,A相:B相洗脱体积比为19:81;1ml/min匀速变化至60-90min,A相:B相洗脱体积比=36:64;1ml/min匀速变化至95min,A相:B相洗脱体积比为19:81,直至洗脱完毕。
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