CN110412178A - 一种生脉散主要成分含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生脉散主要成分含量测定方法，属于药物分析技术领域，色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3（2.1mm×100mm,1.8μm）；流动相：A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸乙腈；流速0.5mL/min；梯度洗脱程序：0~1min：流动相A：99%~80%；1~13min：流动相A：80%~30%；13~14min：流动相A：30%~1%；14~16min：流动相A：1%~1%；梯度变化曲线：6；柱温预设：45℃；样品仓温度预设：4℃；波长：190‑400nm全波长扫描；进样体积3μL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正、负离子扫描分析。本发明以12个指标进行全面、客观的评价生脉散的质量，为生脉散质量标准的建立提供了一定的参考。

Description

一种生脉散主要成分含量测定方法
技术领域
本发明涉及一种生脉散主要成分含量测定方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
生脉散作为治疗气阴两虚证的经典名方，国内外大量文献对于组成生脉散的各单味药人参、麦冬、五味子进行了系统而深入的研究，范畴涉及化学成分、药理作用、效应成分等；但对于生脉散整方的研究却相对滞后。尽管近30年科研工作者对其有较多研究，其中临床应用几乎占文献总量的70％，有关其药理作用的报道占15％，其他的研究主要包括成分分析，质量评价，体内行为研究以及文献考证等占15％。这些研究工作取得了一些成果，然而诸多问题仍未阐明，总结出几个重点问题如下：其一，药效物质基础依然不明；其二，对配伍规律缺乏科学合理的阐释；其三，至今未建立全面、客观的质量评价方法。
生脉散体外成分分析结果表明，其所含化学成分较复杂，而以往对其质量评价选择指标比较片面，且缺乏合理阐释，因此客观、全面的选择合适的含量测定指标以及适宜的方法对生脉散进行质量评价是非常必要的，且为后续的其它研究奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供了一种生脉散主要成分含量测定方法，该法以12个指标进行全面、客观的评价生脉散的质量，为生脉散质量标准的建立提供了一定的参考。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种生脉散主要成分含量测定方法，
色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)；
流动相：A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；
梯度洗脱程序：
柱温预设：45℃；
样品仓温度预设：4℃；
流速：0.5mL/min；
波长：190-400nm全波长扫描；
进样体积3μL；
色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正、负离子扫描分析。
所述质谱仪的质谱条件为：
正离子模式：
毛细管电压：2.4kv；锥孔采样电压：35v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：250℃；去溶剂气流量：600L/h；离子源温度：105℃；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽([M+H]+＝556.2771)溶液，校正溶液进样速度为100μL/min，校正频率为5s；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 100～1500；
负离子模式：
毛细管电压：2.2kv；锥孔采样电压：30v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流量：500L/h；离子源温度：115℃；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽([M-H]-＝554.2615)溶液，校正溶液进样速度为100μL/min，校正频率为5s；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 100～1500。
所述色谱仪为超高效液相色谱。
所述质谱仪为QTOF。
所述生脉散的主要成分包括五味子醇甲，五味子醇乙，五味子甲素，五味子乙素，五味子酯甲，人参皂苷Rf、Rg2、Ro，20(S)-Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1和麦冬皂苷D。
对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲，五味子醇乙，五味子甲素，五味子乙素，五味子酯甲，人参皂苷Rf、Rg2、Ro，20(S)-Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1，麦冬皂苷D适量，加入甲醇，分别配制成对照品溶液。
供试品溶液的制备：取生脉散冻干粉500mg，精密称定，置于25mL容量瓶中，加乙腈-水＝50：50混合液20mL，超声提取10min，再加溶剂至刻度，摇匀，离心10min，取上清液，为供试品溶液。
上述离心的条件为：13000rpm，4℃。
本发明的有益效果为：
本发明利用UPLC-HDMS以及Quanlynx等技术方法建立了生脉散的质量评价方法，其中含量测定指标包括具有较好的体内行为及良好的药理学活性的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素；君药人参中的人参皂苷Rf、Ro、20(S)-人参皂苷Rg2、Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1，以及臣药麦冬中的麦冬皂苷D；以上来源于人参以及麦冬的7个成分均具有良好的药理活性。本研究首次以12个指标进行全面、客观的评价生脉散的质量，为生脉散质量标准的建立提供了一定的参考。
附图说明
图1是本发明正离子模式下生脉散及5个对照品混合样品色谱图；
其中，A.生脉散色谱图；B.5个对照品混合样品色谱图，其中Ⅰ为五味子醇甲，Ⅱ为五味子醇乙，Ⅲ为五味子酯甲，Ⅳ为五味子甲素，Ⅴ为五味子乙素；
图2是本发明负离子模式下生脉散及7个对照品混合样品色谱图；
其中，A.生脉散色谱图；B.5个对照品混合样品色谱图，其中Ⅰ为人参皂苷Rf，II为人参皂苷Ro，III为人参皂苷Rg2，IV为20(R)-人参皂苷Rh1，V为20(S)-人参皂苷Rg3，VI为20(R)-人参皂苷Rg3，VII为麦冬皂苷D；
图3是本发明不同体积50％乙腈-水提取生脉散色谱图；
其中，A为12.5倍柱体积；B为25倍柱体积；C为50倍柱体积；D为100倍柱体积；
图4是本发明不同超声提取时间的生脉散样品色谱图；
其中，A为超声30min；B为超声20min；C为超声10min；
图5是本发明负离子扫描模式下不同色谱柱的色谱图；
其中，A为Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱；B为Waters ACQUITY UPLCTM BEHC18；
图6是本发明负离子模式下不同洗脱溶剂系统色谱图；
其中，A为甲醇-水；B为乙腈-水；C为甲醇(0.1％甲酸)-水(0.1％甲酸)；D为乙腈(0.1％甲酸)-水(0.1％甲酸)；
图7是本发明负离子模式下两种洗脱溶剂系统色谱图；
其中，A为乙腈(0.1％甲酸)-水(0.1％甲酸)；B为甲醇(0.1％甲酸)-水(0.1％甲酸)；
图8是本发明负离子模式下不同柱温色谱图；
其中，A为45℃柱温；B为40℃柱温；C为35℃柱温；D为30℃柱温。
图9是本发明生脉散不同梯度洗脱条件的色谱图；
其中，A为方法-1系统，流动相A为0.1％甲酸水；B为0.1％甲酸乙腈；流速0.5mL/min；梯度洗脱条件：0～10min：流动相A：99％～1％；10～12min：流动相A：1％～1％，梯度变化曲线：6；
B为方法-2系统，流动相A为0.1％甲酸水；B为0.1％甲酸乙腈；流速0.5mL/min；梯度洗脱条件：0～3min：流动相A：99％～95％；3～5min：流动相A：95％～80％；5～17min：流动相A：80％～30％；17～18min：流动相A：30％～1％；18～20min：流动相A：1％～1％；梯度变化曲线：6；
C为方法-3系统，方法-3系统为本发明采用的洗脱条件；
图10为本发明负离子扫描模式下不同浓度甲酸洗脱系统色谱图；
其中，A为0.2％甲酸；B为0.1％甲酸；C为0.05％甲酸；
图11为本发明正离子扫描模式下不同浓度甲酸洗脱系统色谱图；
其中，A为0.2％甲酸；B为0.1％甲酸；C为0.05％甲酸；
图12为本发明正离子模式下质谱条件优化参数图；
图13为本发明正离子模式下质谱条件优化色谱图；
图14为本发明正离子模式下不同离子源温度色谱图；
其中，A为125℃；B为120℃；C为115℃；D为110℃；E为105℃；F为100℃；
图15为本发明负离子模式下质谱条件优化参数图；
图16为本发明负离子模式下质谱条件优化色谱图；
图17为本发明负离子模式下不同离子源温度色谱图；
其中，A为125℃；B为120℃；C为115℃；D为110℃；E为105℃；F为100℃。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
1实验材料
1.1仪器
Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪(Waters公司，美国)；
Waters SynaptTM High Definition MS(HDMS)System质谱分析系统(Waters公司，美国)；
KDC-160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，中国)；
SK-1快速混匀器(江苏金檀医疗器械厂，中国)；
METTLER TOLEDO AG135分析天平(METTLER公司，瑞士)；
Thermo Savant Modulyo D冷冻干燥机(杭州雷琪实验器材有限公司，中国)；
恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；
KQ-500DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；
Nichipet EX微量取样器(NICHIRYO公司，日本)。
1.2药品与试剂
乙腈，色谱级(Merck公司，德国)；
甲醇，色谱级(Fisher公司，美国)；
蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司，中国)；
甲酸，色谱级(天津科密欧化学试剂有限公司，中国)；
亮氨酸脑啡肽(SIGMA公司，美国)；
生脉散冻干粉为实验室自制；
对照品：人参皂苷Rf、Ro，20(S)-人参皂苷Rg2、Rg3，20(R)-Rg3、Rh1，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲，(四川维克奇生物有限公司，中国)，麦冬皂苷D(上海尚谊化工科技有限公司，中国)。
2实验方法
2.1分析条件
2.1.1色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)；流动相：A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱程序(见表5-1)；柱温预设：45℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.5mL/min；波长：190-400nm全波长扫描；进样体积3μL；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析。
表5-1超高效液相色谱洗脱程序
Table 5-1UPLC gradient elution program
A：0.1％甲酸水；B.0.1％甲酸乙腈
A:Water(0.1％formic acid)；B.Acetonitrile(0.1％formic acid)
2.1.2质谱条件
2.1.2.1正离子模式
毛细管电压：2.4kv；锥孔采样电压：35v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：250℃；去溶剂气流量：600L/h；离子源温度：105℃；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽(Leucine-Enkephalin，[M+H]+＝556.2771)溶液，校正溶液进样速度为100μL/min，校正频率为5s；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 100～1500。
2.1.2.2负离子模式
毛细管电压：2.2kv；锥孔采样电压：30v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流量：500L/h；离子源温度：115℃；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽([M-H]-＝554.2615)溶液，校正溶液进样速度为100μL/min，校正频率为5s；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 100～1500。
2.2对照品溶液的制备
精密称取五味子醇甲，五味子醇乙，五味子甲素，五味子乙素，五味子酯甲，人参皂苷Rf、Rg2、Ro，20(S)-Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1，麦冬皂苷D适量，加入甲醇，分别配制成对照品溶液。如图1所示，为本发明正离子模式下生脉散及5个对照品混合样品色谱图；如图2所示，为本发明负离子模式下生脉散及7个对照品混合样品色谱图；
2.3供试品溶液制备
取生脉散冻干粉500mg左右，精密称定，置于25mL容量瓶中，加50倍体积的乙腈-水(50:50)混合液，即加乙腈-水(50：50)混合液20mL左右，超声提取10min，再加溶剂至刻度，摇匀，离心10min(13000rpm，4℃)，取上清液，为供试品溶液。
生脉散水煎液冻干粉制备：生脉散的组方为：人参五钱；麦门冬三钱；五味子一钱五分；
按照原方比例称取三种药材，混匀。第一次加15倍量水浸泡1h，武火煎煮至沸腾调至文火保持微沸1h，16层纱布过滤，收集滤液；第二、三次滤渣分别加10倍量水，煎煮保持微沸1h，16层纱布过滤，收集滤液，合并3次滤液，浓缩至500mL左右，冷冻干燥，备用。生脉散出粉率为51.24％。
如图3所示，溶剂体积的考察：取生脉散冻干粉约50mg，4份，精密称定，分别加入12.5，25，50，100倍体积的乙腈-水(50:50)混合液溶解，超声10min，4℃，13000rpm离心10min，取上清液，进行UPLC-HDMS分析，选择最佳的溶剂体积。图3(A)，图3(B)中的某些色谱峰出现了平顶现象，说明溶液浓度过大，图3(C)，图3(D)则未出现这类现象，而图3(D)中由于样品浓度小，峰形较图3(C)中的略差。最终选择50倍体积作为样品溶解体积。故最终确定溶剂体积为50倍。
如图4所示，超声提取时间的考察：取生脉散冻干粉大约50mg，3份，精密称定，加入50倍体积的乙腈-水(50:50)混合液溶解，分别超声10min、20min、30min，13000rpm离心10min，取上清液，进行UPLC-HDMS分析，选择最适合的样品提取时间。不同超声时间的色谱图中峰强度无明显差别，表明超声时间对样品提取效率影响不大，综合经济以及效率因素，确定超声10min为最佳提取时间。故最终确定超声提取时间为10min。
如图5所示，色谱柱的优化：本实验过程中考察了Waters公司的ACQUITY UPLCTMBEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm)和ACQUITY UPLCTM HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)两种色谱柱，以确定适合的色谱柱，使用100mm HSS T3的色谱柱的色谱图中色谱峰峰数较多，分离效果明显优于50mm BEH C18色谱柱。故本实施例选用100mm HSS T3色谱柱。故最终确定了Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)。
如图6，图7所示，洗脱系统的优化：分别考察甲醇-水，乙腈-水，甲醇(0.1％甲酸)-水(0.1％甲酸)，乙腈(0.1％甲酸)-水(0.1％甲酸)4种洗脱溶剂系统，以确定适合本研究的洗脱溶剂系统。图6(A)，图6(B)中的色谱峰少且峰形差；图6(C)，6(D)中使用的流动相由于加入了甲酸，峰数增多；而乙腈较甲醇洗脱能力强，出峰较快，为准确衡量两者究竟谁更具优势，调整图6(D)色谱条件，使其出峰时间与图6(C)相似，再比较两者。结果见图7，图7(A)色谱峰数目明显多于图7(B)，并且分离效率高，故本实验选用乙腈(甲酸)-水(甲酸)洗脱系统。故最终确定了乙腈(0.1％甲酸)-水(0.1％甲酸)这个洗脱系统。
如图8所示，柱温优化：由于柱温对色谱分离也具有一定影响，因此选择30℃、35℃、40℃、45℃柱温进行考察，以确定最佳的柱温条件。柱温为45℃时，在2-3min及3.5-4min时分离效果较其它温度好，由于实验所用的色谱柱的柱温上限为45℃，未进行更高的柱温考察，故本实验选择柱温为45℃。故最终确定了45℃柱温。
如图9所示，洗脱梯度的优化：由于生脉散中的成分较复杂多样，欲获得良好的分离效果以及不影响成分的检出，则必须进行洗脱梯度条件的细致考察，本实验中进行了多种洗脱梯度方法考察，以达到预期目的。见图9(A)，由于洗脱梯度变化较快，色谱峰没有达到良好的分离；进行梯度调整，使用方法-2，结果见图9(B)，由于洗脱梯度变慢，虽获得了较好的分离度，但是在1.5-6min为无效洗脱；进一步优化洗脱条件，采用方法-3，结果见图9(C)，达到了良好的分离效果，且分析时间短，成本低，故本实验采用方法-3中的分离条件。
如图10，图11所示，洗脱系统加入甲酸量优化：酸性辅助溶剂(如甲酸)对ESI质谱峰属性以及质谱响应程度有较大改善，但是甲酸的用量会直接影响色谱峰的数量以及峰形，所以对甲酸浓度进行考察，以确定适合本实施例的甲酸浓度。本实施例选择0.05％，0.1％，0.2％三个甲酸浓度进行考察。综合正、负离子扫描模式结果可见，加入0.05％甲酸与0.1％甲酸的色谱图相比，峰形有所改善，而浓度为0.2％时，峰形变宽，基线漂移，并且过大酸浓度会使色谱柱寿命缩短。综合考虑，本实验选用0.1％作为最终流动相洗脱系统添加甲酸的浓度。
质谱条件优化：
正离子扫描模式质谱条件优化：取生脉散冻干粉约50mg，用50倍体积的乙腈-水(50:50)混合液溶解，超声10min，13000rpm离心10min，稀释10000倍，质谱直接进样，流速：15μL/min，按图12中的参数进行考察，如图13所示，比较峰强度，筛选出最佳的正离子质谱条件为：毛细管电压：2.4kv；锥孔采样电压：35v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：250℃；去溶剂气流量：600L/h。由于离子源温度升降时间较长，故对此参数进行单独筛选。离子源温度筛选结果见图14，可见当离子源温度为105℃时，离子强度是所筛选的温度中最高的，故选定离子源温度为105℃。
负离子扫描模式质谱条件优化：
取生脉散冻干粉约50mg，用50倍体积的乙腈-水(50:50)混合液溶解，超声10min，13000rpm离心10min，稀释1000倍，质谱直接进样，流速：15μL/min，按图15中的参数进行考察，由图16可见，筛选出的最佳负离子质谱条件为：毛细管电压：2.2kv；锥孔采样电压：30v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流量：500L/h。由于离子源温度升降时间较长，故对此参数进行单独筛选。离子源温度筛选结果见图17，可见当离子源温度为115℃时，离子强度是所筛选的温度中最高的，故选定离子源温度为115℃。
本实施例通过对供试品溶液制备方法、色谱条件、质谱条件的优化，建立了生脉散体外化学成分分析方法。利用超高效液相色谱技术在16min内即可完成数据采集，生脉散化学成分实现良好的色谱分离。通过质谱参数的优化，使生脉散总离子强度达到最高，对于检测到更多的成分提供了可靠的保障。本实施例采用的UPLC-HDMS技术，较以往采用的LC-UV，LC-ESLD等方法对生脉散的成分分析，具有更快的分析效率以及更全面的认识，将为后续研究奠定坚实的基础。
2.4方法学考察
2.4.1精密度实验
取五味子木脂素类成分以及人参皂苷与麦冬皂苷D的混合对照品溶液，在正离子模式下，连续进样5次，测定色谱TIC总离子流图中各对照品峰面积；取人参皂苷与麦冬皂苷D的混合对照品溶液，在负离子模式下，连续进样5次，测定色谱TIC总离子流图中各对照品峰面积；考察仪器精密度情况。
2.4.2稳定性实验
取同一批生脉散冻干粉，按“2.3”项下制备供试品溶液，每6小时进样分析，测定色谱TIC总离子流图中各对照品峰面积，考察样品在24小时内稳定性。
2.4.3重复性实验
取五批生脉散冻干粉，按“2.3”项下，平行制备5份供试品溶液，测定色谱TIC总离子流图中各对照品峰面积考察方法重现性情况。
2.4.4定量限与检测限
取已知浓度的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素，用甲醇逐级稀释定容，取2μL进UPLC-HDMS分析；人参皂苷Rf、Rg2、Ro，20(S)-Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1，麦冬皂苷D用甲醇逐级稀释定容，取5μL进UPLC-HDMS分析，确定信噪比(S/N＝10)时，被检测成分的可定量质量，即定量限(LOQ)；确定信噪比(S/N＝3)时，被检测成分的可检出质量，即检测限(LOD)。
2.4.5线性关系考察
精密吸取五味子木脂素类成分对照品混合溶液5mL，用甲醇定容于10mL容量瓶内，同法依次稀释2倍，共稀释6次，摇匀，配制成不同浓度的五味子木脂素类成分对照品混合溶液，分别取5μL进UPLC-HDMS分析；精密吸取人参皂苷类成分以及麦冬皂苷D对照品混合溶液5mL，用甲醇定容于10mL容量瓶内，同法依次稀释2倍，共稀释6次，摇匀，配制成不同浓度的人参皂苷类成分以及麦冬皂苷D对照品混合溶液，分别取5μL进UPLC-HDMS分析；以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线。
2.4.6加样回收率实验
精密称取已知含量的生脉散冻干粉约500mg，精密加五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲对照品混合溶液1mL，以及人参皂苷Rf、Rg2，Ro，20(S)-人参皂苷Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1、麦冬皂苷D对照品混合溶液1mL，按“2.3”项下制备5份样品溶液，进行回收率测定。
2.5样品测定
取生脉散冻干粉，按照“2.3”项下平行制备5批供试品溶液，按确定的色谱条件进行分析，测定各成分含量。
3结果与讨论
3.1含量测定指标的选择
通常制剂的质量评价是选取有效成分作为测定指标，由于生脉散的药效物质基础至今尚未明确，此方法受到了限制。然而药物的入血成分很有可能是有效成分，因此首先在生脉散入血成分中进行指标选择。尽管体内成分分析中检测到的大多是来源于五味子的木脂素类成分，而来源于人参的成分只检测20(R)-人参皂苷Rh1，20(S)-人参皂苷Rh1，Rk3，Rh4，未检测到来源于麦冬的成分，但人参以及麦冬作为方中的君药以及臣药的作用是不可以忽视的。因此在入血成分的基础上，首先选择具有较好的体内行为的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素，作为生脉散的质量评价指标；而为了系统而全面的把握各组成药材的质量信息，又选择了人参皂苷Rf、Ro，20(S)-人参皂苷Rg2、Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1，麦冬皂苷D作为质量评价指标，以上7个成分来源于生脉散的君药以及臣药，且具有良好的药理活性。共选择了12个成分作为生脉散的质量评价指标，尽可能全面的体现生脉散的质量情况。
3.2方法学考察结果
3.2.1精密度
按照“2.4.1”项下进行仪器精密度考察。结果见表5-2，各对照品峰面积RSD小于3％，表明仪器精密度良好。
3.2.2稳定性
按照“2.4.2”项下进行生脉散样品稳定性考察。结果见表5-3，各考察成分峰面积RSD小于4％，表明样品在24小时内稳定性良好。
3.2.3重复性实验
按照“2.4.3”项下进行生脉散样品重复性实验。结果见表5-4，各考察成分峰面积RSD小于5％，表明方法重现性良好。
3.2.4定量限与检测限
按照“2.4.4”项下进行各对照品定量限与检测限的测定。结果见表5-5，表5-6。
3.2.5线性关系考察
按照“2.4.5”项下进行各对照品线性关系考察，结果见表5-7。
3.2.6加样回收率实验
按照“2.4.6”项下进行加样回收率实验，结果见表5-8，表5-9，各成分的加样回收率在95.96～98.23之间，RSD小于4％，表明方法回收率较好。
3.3样品测定
按照“2.5”项下进行生脉散样品中12个成分的含量测定，结果见表5-10，表5-11以及图1，图2。
表5-2精密度实验结果
Table 5-2Result of precision experiment
表5-3稳定性实验结果
Table 5-3Result of stability experiment
表5-4重复性实验结果
Table 5-4Result of reproducibility experiment
表5-5生脉散中主要木脂素类成分定量限以及检测限
Table 5-5The LOQ and LOD of main ligans in SMS
表5-6生脉散中主要人参皂苷类成分以及麦冬皂苷D的定量限以及检测限
Table 5-6The LOQ and LOD of main ginsenosides and ophiopogonin D inSMS
表5-7对照品的标准曲线
Table 5-7The standard curves of reference substances
表5-8生脉散中主要木脂素类成分的回收率实验结果
Table 5-8The result of recovery of main ligans in SMS
表5-9生脉散中主要人参皂苷类成分以及麦冬皂苷D的回收率实验结果
Table 5-9The result of recovery of main ginsenosides and ophiopogoninD in SMS
表5-10生脉散中主要木脂素类各成分的含量
Table 5-10The content of omain ligans in SMS
表5-11生脉散中主要人参皂苷类成分以及麦冬皂苷D的含量
Table 5-11The content of main ginsenosides and ophiopogonin D in SMS
4小结
本发明利用UPLC-HDMS以及Quanlynx等技术方法建立了生脉散的质量评价方法，其中含量测定指标包括具有较好的体内行为及良好的药理学活性的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素；君药人参中的人参皂苷Rf、Ro、20(S)-人参皂苷Rg2、Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1，以及臣药麦冬中的麦冬皂苷D；以上来源于人参以及麦冬的7个成分均具有良好的药理活性。本研究首次以12个指标进行全面、客观的评价生脉散的质量，为生脉散质量标准的建立提供了一定的参考。
应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个发明方面中的一个或多个，在上面对本发明的示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本发明要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多特征。更确切地说，如权利要求书所反映的那样，发明方面在于少于前面公开的实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本发明的单独实施例。
尽管根据有限数量的实施例描述了本发明，但是受益于上面的描述，本技术领域内的技术人员明白，在由此描述的本发明的范围内，可以设想其它实施例。此外，应当注意，本说明书中使用的语言主要是为了可读性和教导的目的而选择的，而不是为了解释或者限定本发明的主题而选择的。因此，在不偏离所附权利要求书的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。对于本发明的范围，对本发明所做的公开是说明性的，而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书限定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，
色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTMHSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)；
流动相：A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；
梯度洗脱程序：
柱温预设：45℃；
样品仓温度预设：4℃；
流速：0.5mL/min；
波长：190-400nm全波长扫描；
进样体积3μL；
色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正、负离子扫描分析。
2.根据权利要求1所述的一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，所述质谱仪的质谱条件为：
正离子模式：
毛细管电压：2.4kv；锥孔采样电压：35v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：250℃；去溶剂气流量：600L/h；离子源温度：105℃；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽([M+H]+＝556.2771)溶液，校正溶液进样速度为100μL/min，校正频率为5s；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 100～1500；
负离子模式：
毛细管电压：2.2kv；锥孔采样电压：30v；锥孔提取电压：3.0v；去溶剂气温度：300℃；去溶剂气流量：500L/h；离子源温度：115℃；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽([M-H]-＝554.2615)溶液，校正溶液进样速度为100μL/min，校正频率为5s；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z 100～1500。
3.根据权利要求1所述的一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，所述色谱仪为超高效液相色谱。
4.根据权利要求2所述的一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，所述质谱仪为QTOF。
5.根据权利要求1所述的一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，所述生脉散的主要成分包括五味子醇甲，五味子醇乙，五味子甲素，五味子乙素，五味子酯甲，人参皂苷Rf、Rg2、Ro，20(S)-Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1和麦冬皂苷D。
6.根据权利要求5所述的一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲，五味子醇乙，五味子甲素，五味子乙素，五味子酯甲，人参皂苷Rf、Rg2、Ro，20(S)-Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3、Rh1，麦冬皂苷D适量，加入甲醇，分别配制成对照品溶液。
7.根据权利要求6所述的一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备：取生脉散冻干粉500mg，精密称定，置于25mL容量瓶中，加乙腈-水＝50：50混合液20mL，超声提取10min，再加溶剂至刻度，摇匀，离心10min，取上清液，为供试品溶液。
8.根据权利要求7所述的一种生脉散主要成分含量测定方法，其特征在于，离心的条件为：13000rpm，4℃。
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