CN104730172B - 一种中药中赭曲霉毒素a的适体亲和柱净化新方法 - Google Patents
一种中药中赭曲霉毒素a的适体亲和柱净化新方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种以NHS活化的sephrose4FF为载体,赭曲霉毒素A特异性适体为配基制备的具有操作简单,偶联速度快,偶联效率高的适体亲和柱的制备方法。经系统考察后,该亲和柱在中药中适用性良好,能起到快速净化中药中赭曲霉毒素A的目的,且所建立的检测方法准确度好,灵敏度高,可用于中药中赭曲霉毒素A的快速筛查。此外,该适体亲和柱制备方法简便易行,生产成本较低,质量稳定可控,能满足中药中赭曲霉毒素A的快速检测,具有广阔的开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药中赭曲霉毒素A的净化新方法,特别是涉及适体亲和柱(AAC)的制备,AAC净化超高效液相荧光检测及液质联用检测中药中赭曲霉毒素A,其属于真菌毒素检测领域。
背景技术
赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是异香豆素联结L-苯丙氨酸的衍生物,由曲霉菌属和青霉菌属等产毒菌株产生的二级代谢产物,具有很强的肝肾毒性、神经毒性及免疫毒性等,故1993年国际癌症组织IARC已将其定义为2B类致癌物。OTA在全球污染范围较广,其广泛存在于各类食品及农作物中,且污染水平较高。近年来,一些诸如甘草、生姜、姜黄等中草药及其制品也被发现污染OTA,且污染状况不容小觑。但由于中药材种类繁多、基质复杂、加工和储藏尚存在不当之处加之OTA痕量(ppb)、pH敏感性等特点,实际检测困难重重。故目前除了欧盟(EU)对甘草和芳香植物做了相关的OTA限量规定外,其他国家尚处于摸索阶段,特别是我国相关组织对中药材OTA的限量还是空白。因而寻找一种简单、快速、准确、经济、特异性的前处理方法,消除中药基质干扰,对于研究中药中OTA的污染状况,制定中药中OTA的限量标准具有重要意义。
适体(aptamer)是通过指数富集配基系统进化技术(SELEX)体外筛选得到的一类与目标分子高特异性结合的寡聚核苷酸片段。作为靶物质识别元件,与抗体相比aptamer具有多重优势,如其合成往往可通过体外化学合成,而抗体则需在一定的生理条件下,故aptamer受环境的影响较小,易于修饰,且制备更为经济,此外aptamer对结构类似物的识别能力更强,可达到nM级别,而抗体往往存在交叉反应。因此其作为一个优于抗体的新型识别配基,已在食品快速检验、环境检测、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。
发明内容
本发明旨在提供一种制备方法简单、偶联速度快、偶联效率高、净化效果好可有效排除中药基质的干扰的AAC的制备方法,其优点在于以适体为特异性配基,NHS活化的sepharose4FF为载体,将这两者的优势联合起来,起到高效偶联,快速净化的目的,操作简单,价格低廉,能够应用于不同中药部位,消除不同中药成分的干扰,具有广阔的开发前景。
技术解决方案
本发明采用的技术方案是:优选、合成和末端修饰OTA适体序列,再在一定条件下混合NHS活化的sephrose 4FF,偶联上适体,制备出AAC;再以易污染真菌毒素的不同中药部位,不同次生代谢产物考察对柱效的影响;最后联合使用UPLC-FLR,UFLC-MS/MS等分析仪器建立AAC净化中药中OTA的检测方法。
技术路线图见图1
技术要点:
(1)AAC的制备方法,按照下述步骤进行:
a.OTA适体序列的筛选:查阅文献,合成相关适体DNA序列,考察不同序列的特异性,Apt-2对黄曲霉毒素B1,B2的吸附性较好,对黄曲霉毒素G1,G2及OTA也有一定的吸附,故特异性不强,因此优先OTA特异性序列为Apt-1(5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG-AGCATCGGACA-3’),选择合适的末端修饰方法-5’端C6间隔臂氨基修饰;
OTA适体特异性图见图2
b.AAC的制备:主要包括适体复性,洗涤,偶联,封闭,洗涤,装柱。考察载体不同活化方式(CNBr、Expoxy、NHS),偶联pH值(6.0,7.0,8.0,9.0,10.0),偶联时间(0,1,2,3,4,6h)对偶联效率的影响,得到最佳偶联方式及相关参数;
偶联条件优化见图3
c.最大吸附量考察:在最佳偶联条件下,制备6个不同批次的AAC和对照柱(未偶联适体),确定最大吸附量,并与商业化的适体柱相比较。
最大吸附量考察见图4
(2)AAC适用性考察:以药用部位分类选择易被霉菌污染的中药材(种子果实类、根及根茎类、花类、叶及全草类、动物类),综合考虑中药材中所含相关次生代谢产物(糖类、淀粉、黄酮类、生物碱类、苯丙素类等),通过计算加样回收率方式考察这些中药材及所含成分对AAC柱效的影响,并考察AAC净化后对降低基质效应的影响。
a.种子果实类:肉豆蔻,胡椒,小茴香,酸枣仁,胖大海,桃仁,陈皮,柏子仁,莲子,使君子,槟榔,生麦芽,决明子,薏苡仁,大枣,白扁豆,杏仁,枳棋子,木瓜,淡豆豉;
b.根及根茎类:甘草,姜黄,生姜,远志,半夏,郁金,人参,西洋参,当归,葛根,黄芪,黄芩,白芍,天麻,麦冬,板蓝根,石斛,党参,延胡索,巴戟天;
c.花类:红花,菊花,金银花,槐花,金莲花,辛夷;
d.叶及全草类:淡竹叶,荷叶,桑叶,侧柏叶,银杏叶,薄荷,广藿香,芫荽,益母草,青蒿;
e.动物类:龟板,蜈蚣,水蛭,全蝎,僵蚕,地龙,乌梢蛇,土鳖虫,鸡内金。
(3)AAC实际应用性考察-基于AAC净化建立不同分析方法检测中药中OTA:考察不同影响因素(稀释缓冲液类型,总离子强度,pH值,体积等)对柱效的影响,获得最佳净化参数,以AAC为净化方法,建立不同检测方法(HPLC-FLD,UPLC-FLR,UFLC-MS/MS),并对比其它不同前处理方法,如QuEChERS、MSPD及各种SPE小柱在代表性中药中OTA的净化效果。
该制备方法的优点在于:适体能够与复杂基质中药中痕量的OTA特异性结合,净化效果好,且精确性高、重复性好、无批次间差异、检测成本低;AAC制备过程简便易行,生产成本低,质量稳定可控,易于实现机械化操作,能够满足工业化生产需求。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。
溶液配制:PBS:8g NaCl,1.2g Na2HPO4,0.2g KH2PO4,0.2g KCl溶解于1000mL水中(pH 7.0);BBS1:10mM Tris,120mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2(pH 7.5);BBS2:12.5mM Tris,150mM NaCl,6.25mM KCl,6.25mM MgCl2;EBS:10mM Tris,120mM NaCl,5mM KCl(pH 7.5)。运用2M HCl和2M NaOH调节pH值。
实施例1:AAC的制备
(1)制备步骤:
a.适体复性:取2.7nmol的5’氨基修饰的适体溶解于400μL缓冲液中(200mMNa2HPO45mM MgCl2,pH 8.0),75℃下复性5min,室温放置30min;
b.洗涤:取约200μL NHS-activated sephaorse 4FF凝胶用1mL HCl(1mM,pH 3.0)迅速反复洗涤5次;
c.偶联:移去多余盐酸,迅速加入复性好的适体缓冲液,调节pH至8.0,室温摇床震摇反应3h;
d.封闭:反应完成后,用3mL Na2HPO4(200mM,pH 8.0)洗涤,加入1mLTris-HCl缓冲液(0.1M,pH8.0)室温反应2h封闭剩余活性位点;
e.洗涤:用2mL Tris-HCl缓冲液(0.1M,pH 8.0,含0.5M NaCl)和2mL醋酸缓冲液(0.1M,pH4.0,含0.5M NaCl)先后交替洗涤5次;
f.装柱:取1mL柱管,垫好筛板,将Binding buffer B(10mM Tris,120mM NaCl,5mMKCl,5mM MgCl2,pH 7.5)悬浮的偶联胶装柱,至胶高度为0.5mL,用0.05%NaN3/BB(w/v)缓冲液冰箱4℃保存。
(2)最佳偶联条件:采用NHS活化活化的sepharose 4FF在pH8.0下与适体反应3h为最佳偶联条件。
(3)最大吸附量的考察:在最佳偶联条件下,上样250ng OTA标准品,测定对照组和实验组的柱下液,淋洗液,洗脱液中OTA含量,考察最大吸附量为188.96±10.56ng。
实施例2:AAC净化UPLC-FLR检测姜粉中OTA
1.样品提取:准确称取姜粉20.0g(精确至0.1g),加入60mL乙腈-水(60∶40,v/v)溶液,超声提取15min,用定量滤纸粗滤,取5mL滤液加45mL BBS2(pH 8.0),混匀,玻璃纤维滤纸过滤,滤液备用。
2.净化:取AAC柱用3mL BBS1活化,将上述稀释后的滤液用移液器精密移取3mL(相当于0.1g样品)过柱,调节流速1drops/s。用1mL BBS1清洗柱子,直至空气完全过柱。加入1mL纯甲醇,以1drops/s的流速洗脱,收集洗脱液。将洗脱液用氮气在45℃吹干,最后用甲醇-水(50∶50,v/v)定容至0.5mL,振荡混匀后,12000rpm下离心5min,取上清液供UPLC测定。
3.色谱条件:Waters ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪,荧光检测器(Waters,USA);WatersAcquity UPLC HSS T3(50mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱;进样量:5μL;柱温:35℃;激发波长λex 333nm,发射波长λem 460nm;流动相:甲醇/0.5%乙酸水(65/35,v/v);流速:0.2mL/min。
4.液质确证条件:Prominence UFLC-20A超高效液相色谱仪(日本岛津公司);ABSCIEX QTRAP 5500质谱仪(美国AB应用生物系统公司);Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(50mm×4.6mm,1.8μm)色谱柱;进样量:2μL;流动相:乙腈(含0.1%甲酸)/0.1甲酸水(70/30,v/v);流速:0.3mL/min。离子源为ESI电喷雾离子源,正离子方式检测,m/z 404.2→358.0和m/z404.2→239.1两对离子用来确证OTA,喷射电压为5.5kV,离子源温度550℃,雾化气,辅助气,气帘气为50,50,35psi,碰撞能量26/40eV,扫描方式为多反应监测(MRM)。
(1)前处理条件的优化:考察了总离子强度(0.5-BB,1.0-BB,1.25-BB,1.5-BB,2.0-BB),稀释缓冲液pH值(5.0,6.0,7.0,8.0,9.0),活化液(1,3,5mL)、上样液(3,6,9mL)、淋洗液(1,3,5mL)、洗脱液(0.5,1.0,1.5mL)用量的影响,获得姜粉中AAC的最佳净化方式为:取5mL滤液加45mL BBS2(pH 8.0),混匀,玻璃纤维滤纸过滤,AAC用3mL BBS1(pH 7.5)活化,上样3mL,淋洗1mL BBS1(pH 7.5),洗脱1mL纯甲醇。
净化优化见图5
(2)色谱条件的建立:对比不同色谱柱(WatersAcquity UPLC BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm),WatersAcquity UPLC BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm),Waters AcquityUPLC HSS T3(50mm×2.1mm,1.8μm)),发现T3柱在OTA的分离性能,峰的响应,出峰时间上更具优势;对比HPLC-FLD检测法,UPLC-FLR具有更高的灵敏度,更短的分析时间(表1)。
表1 HPLC-FLD与UPLC-FLR对比
注:HPLC-FLD进样量:100μL;UPLC-FLR进样量:5μL
(3)不同前处理方法对比:选择了QuEChERS,基质辅助固相微萃取(MSPD)及不同吸附类型的SPE萃取小柱(C18,Oasis HLB,Oasis MAX,Mysep 229,Pribofast 290,TC-M160,SPE Ochratoxin A,OchraTestTM免疫亲和柱),其中免疫亲和柱的净化效果最好,准确度与AAC相当,但是相比AAC,净化时间长,且检测成本昂贵。Pribofast 290处理后杂质不影响OTA的检测,但准确度不达标,其余前处理方法均未能有效除去干扰物,处理后的样品杂质峰多,干扰OTA的检出。
典型样品图见图6
(A:3ng/mL标品;B:IAC净化加标样品;C:AAC净化阴性样品;D:AAC净化加标样品)
(4)重复性利用性对比:基质:姜粉,加标水平15μg/kg,AAC再生:5mL甲醇EBS(20/80,v/v)+5mL EBS+5mL BBS1;5mL甲醇/水(80/20,v/v)+10mL水+20mL PBS。在姜粉样品中,AAC展示了更好的可重复利用性,在重复利用8次后,回收率仍大于70%。而IAC在使用4次后回收率就低于70%,且RSD增大,此外,1AC的再生需要更长的时间(12h),而AAC只需几分钟。
AAC与IAC重复利用性对比见图7
(5)方法学考察:
a.标准曲线的绘制:取不同浓度(0.5、1、2.5、5、10、25、50ng/mL)的OTA标准品溶液,分别进样,获得的色谱峰峰面积(A)对OTA的浓度(ng/mL)作回归曲线,OTA的线性回归方程为y=18367x+6221,变异系数(r2)为0.9999,线性范围为0.5-50ng/mL。
b.检测限与定量限:根据信噪比S/N≥3和S/N≥10确定OTA的最低检测限和定量限分别为0.5和1.5μg/kg。
c.精密度实验:取3.0ng/mL的OTA对照品溶液,在上述色谱条件下,分别在同一天内连续进样6次和在连续的6天进样测定,记录峰面积,结果分别见表2。OTA日内精密度(以RSD值表示)为1.37%,日间精密度为3.65%,表明仪器精密度良好。
表2精密度实验结果
e.稳定性实验:精密称取阴性姜粉20.0g,以15μg/kg的水平添加OTA对照品溶液,按上述方法制备供试品溶液,于配制后0、12、24、36、48、72h分别进样,记录峰面积并计算RSD值,结果见表3。OTA峰面积的RSD值小于7.0%,表明供试品溶液在72h内稳定。
表3稳定性实验结果
f.重复性实验:以15μg/kg的水平添加OTA对照品溶液,按上述供试品溶液制备方法平行制备样品共6份,分别进样测定,记录峰面积并计算含量,结果见表4。
表4重复性实验结果
g.加样回收率实验:精密称取姜粉20.0g,共9份,加入5、15、45μg/kg 3个浓度水平的对照品溶液。按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液,每个水平重复三次,计算平均回收率,结果见表5。OTA的加样回收率为81.40-98.36%,其RSD低于3.8%,表明该方法准确度好。
表5加样回收率实验结果(n=3)
(6)样品测定及确证:运用上述建立的方法测定了25批姜粉样品,测定结果见表6。在25批姜粉样品中,4批样品为阳性,污染水平在1.51-4.31μg/kg之间;8批样品低于定量限。所有阳性样品的污染量均未超过欧盟对生姜中OTA的限量标准(15μg/kg)。由于中药的成分复杂,测定阳性结果容易出现假阳性,因此采用UFLC-ESI-MS/MS法对上述阳性样品进行定性确证。经确证所有样品未出现假阳性结果,图8为4号姜粉阳性样品的UPLC-FLR及UFLC-MS/MS确认图。
表6 25批姜粉样品测定结果
*<LOQ为低于定量限;**ND为未检测到
4号姜粉阳性样品的UPLC-FLR及UFLC-MS/MS确认图见图8
实施例3:AAC净化UFLC-MS/MS检测中药中OTA
1.样品提取:准确称取药材粉末2.0g(精确至0.1g),加入8mL乙腈-水(60∶40,v/v)溶液,2400rpm下涡旋辅助提取2min,静置30min,4000rpm下离心10min,取3mL滤液用BBS2稀释至30mL,混匀,并用盐酸调节pH至7.5,玻璃纤维滤纸过滤,滤液备用。
2.净化:取AAC柱用3mL BBS1活化,将上述稀释后的滤液用移液器精密移取2mL(相当于50mg样品)过柱,调节流速1drops/s。用1mL BBS1清洗柱子,直至空气完全过柱。加入1mL纯甲醇,以1drops/s的流速洗脱,收集洗脱液。将洗脱液用氮气在45℃吹干,加入内标工作液(100ng/mL)5μL,最后用甲醇-水(50∶50,v/v)定容至0.5mL,振荡混匀后,12000rpm下离心15min,取上清液供UFLC-MS/MS测定。
3.液质条件:Prominence UFLC-20A超高效液相色谱仪(日本岛津公司);AB SCIEXQTRAP 5500质谱仪(美国AB应用生物系统公司);液相条件:Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(50mm×4.6mm,1.8μm)色谱柱;柱温:25℃;进样量:2μL;流动相:乙腈(含0.1%甲酸)/0.1甲酸水(70/30,v/v);流速:0.3mL/min。质谱条件:离子源为ESI电喷雾离子源;正离子方式检测;m/z 404.2→239.1,404.2→358.0分别为OTA定量和定性离子对,扫描方式为多反应监测(MRM);子离子扫描:信息关联采集(IDA),动态背景扣除(DBS);增强型子离子扫描(EPI):扫描范围100-500Da,扫描速度10000Da/s,CE和CES为30和10eV,具体参数见表7。
表7 OTA及内标丁螺环酮质谱参数
(1)前处理条件的优化:考察了缓冲液类型(纯水,Tris,PBS)(均内含5mM MgCl2),上样pH值(4.5,5.5,6.5,7.5,8.5),对柱效的影响,获得中药中AAC的最佳净化方式:取3mL滤液用BBS2稀释至30mL,混匀,并用盐酸调节pH至7.5,玻璃纤维滤纸过滤,AAC用3mL BBS1(pH 7.5)活化,上样2mL,淋洗1mL BBS1(pH 7.5),洗脱1mL纯甲醇。
优化过程图见图9
(2)65种易污染中药材适用性的考察:分别取阴性样品-种子果实类(20种),根及根茎类(20种),花类(6种),叶及全草类(10种),动物类(9种),以20μg/kg的水平添加OTA对照品溶液,按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液,探讨AAC适用性,实验结果见表8,AAC在基质相对较为简单的种子果实类药材中适用性良好,这类中药材在种植和储藏的时候较易受到霉菌的污染,从而产生真菌毒素,在65种不同中药材中的总体适用性良好(72.3%),故具有良好的开发价值。
表8 AAC柱净化65种中药中OTA的适用性(n=3)
*在此回收率范围内未有中药
(3)65种易污染中药材经AAC净化后的基质效应的评价:分别取上述65种阴性中药材,按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液,用空白样品净化液配制2ng/mL OTA溶液(内含IS 1ng/mL),探讨AAC净化后基质评价,实验结果见表9,中药成分复杂,基质效应明显,未经净化直接进样,大部分中药材在m/z 404.2/358.0通道中OTA出峰处出现干扰峰,经AAC净化后,干扰明显降低,基质效应符合检测标准(70-120%),RSD<10%。
表9 65种易污染中药基质效应考察(n=3)
(4)方法学考察:
a.标准曲线的绘制:取不同浓度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0ng/mL)的OTA标准品溶液(均内含IS 1ng/mL),按上述色谱条件分别进样,以各种对照品与内标峰面积的比值对对照品的浓度(ng/mL)作线性回归,权重因子为1/X2,得到相应的回归方程为y=29724x+339,变异系数(r2)为0.9987,线性范围为0.2-20ng/mL。
b.检测限与定量限:根据信噪比S/N≥3和S/N≥10确定莲子、党参、龟板代表基质中OTA的最低检测限和定量限分别为0.5-0.8和1.5-2.5μg/kg。
c.精密度实验:取洁净EP管,加入三个不同浓度的OTA标准溶液,同时制备随行曲线,按样品制备方法制备。每天配制一批及一条随行曲线,连续做3天,共3批,每批每个浓度平行做6份样品,记录OTA以及内标的色谱峰面积,代入线性方程算出相应浓度,计算日内和日间精密度和仪器的进样的准确度。低、中、高三个浓度的日内和日间精密度均<9%,三个浓度的准确度在79.90-102.81%之间。结果见表10。
表10 UFLC-MS/MS测定中药中OTA的精密度和准确度结果(n=6)
e.稳定性实验:、精密称取阴性莲子,党参,龟板代表性中药粉末2.0g,以4、20、100μg/kg的水平添加OTA对照品溶液,按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液,于配制后0、4、8、12、24h分别进样,记录峰面积并计算各个时间点测定的含量,考察样品在进样板上放置的稳定性,结果见表11。样品各个时间含量的RSD值小于9.0%,表明供试品溶液在24h内稳定。
表11样品稳定性实验结果(n=3)
f.重复性实验:精密称取阴性莲子粉末2.0g,以20μg/kg的水平添加OTA对照品溶液,按上述供试品溶液制备方法平行制备样品共6份,分别进样测定,记录峰面积并计算含量,考察方法的重复性,由表12可知,方法的重复性良好。
表12重复性实验结果
g.加样回收率实验:精密称取阴性莲子,党参,龟板代表性中药粉末2.0g,共27份,加入3个浓度水平的对照品溶液分别为4、20、100μg/kg。按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液,每个水平重复三次,计算平均回收率,结果见表13。OTA的加样回收率为80.26-96.64%,其RSD低于6.0%,表明该方法准确度好。
表13加样回收率实验结果(n=3)
典型样品UFLC-MS/MS图见图10
(a:1ng/mL内标丁螺环酮;b:2ng/mLOTA;c:莲子阴性样品图;d:莲子加标样品图;c:党参阴性样品图;d:党参加标样品图;c:龟板阴性样品图;d:龟板加标样品图)
(5)样品测定及确证:应用上述建立的方法测定了25批中药样品,测定结果见表14。在25批中药样品中,2批样品为阳性,污染水平在2.61-3.41μg/kg之间;6批样品低于定量限。所有阳性样品的污染量均未超过5μg/kg。图11为生姜22号阳性样品的UFLC-MS/MS色谱图。
表14 25批中药样品UFLC-MS/MS的测定结果
*ND为未检测到:**<LOQ为低于定量限
22号阳性样品UFLC-MS/MS图见图11
附图说明:
图1为本发明技术路线图
图2为OTA适体DNA序列特异性考察图
图3为适体亲和柱制备条件的优化图
图4为适体亲和柱最大吸附量考察图
图5为适体亲和柱净化姜粉中OTA条件的优化图
图6为适体亲和柱及免疫亲和柱净化-UPLC-FLR检测姜粉中OTA图
图7为适体亲和柱及免疫亲和柱重复利用性对比图
图8为4号姜粉阳性样品的UPLC-FLR及UFLC-MS/MS确认图
图9为适体亲和柱净化中药中OTA条件的优化图
图10为典型样品UFLC-MS/MS图
图11为22号阳性样品UFLC-MS/MS图
Claims (2)
1.一种中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化方法,其特征在于:
1)以NHS活 化的sepharose 4FF为载体,OTA适体特异性DNA配基为吸附剂制备适体亲和柱;
OTA 适体亲和柱的制备步骤:
a.OTA适体序列的筛选:合成相关适体DNA序列,考察不同序列对黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2及OTA的特异性,选定OTA特异性序列为5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG-AGCATCGGACA-3’,选择合适的末端修饰方法-5’端C6间隔臂氨基修饰;
b.适体亲和柱的制备:其步骤主要包括适体复性,洗涤,偶联,封闭,洗涤,装柱;最佳的载体活化方式为NHS,偶联pH值6.0-10.0,偶联时间0-6h;
c.最大吸附量:在最优偶联条件下,制备不同批次适体亲和柱,其最大吸附量高达188.96±10.56ng;
2)以适体亲和柱为净化方法,结合UPLC-FLR技术建立姜粉中OTA的检测方法;
其中,样品提取与净化:称取姜粉20.0g,加入60mL体积比为60∶40的乙腈-水溶液,超声提取15min,定量滤纸粗滤,取5mL滤液加45mL pH范围在5.0-9.0之间的BBS2,浓度为0.5-2.0倍的BBS1;
其中BBS1:10mM Tris,120mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH7.5;
BBS2:12.5mM Tris,150mM NaCl,6.25mM KCl,6.25mM MgCl2;
混匀,玻璃纤维滤纸过滤,取AAC柱用1-5mL BBS1活化,将稀释后的滤液移取3-9mL过柱,用1-5mL BBS1淋洗,直至空气完全过柱,加入0.5-1.5mL纯甲醇洗脱,将洗脱液用氮气在45℃吹干,最后用体积比为50∶50甲醇-水定容至0.5mL,振荡混匀后,12000rpm下离心5min,取上清液供UPLC测定;
3)以适体亲和柱为净化方法,结合UFLC-MS/MS技术建立中药中OTA的检测方法;
其中,样品提取与净化:取药材粉末2.0g,加入体积比为60∶40,的乙腈-水8mL,2400rpm下涡旋提取2min,静置30min,4000rpm下离心10min,取3mL滤液用BBS2稀释至30mL,混匀,调节pH至4.5-8.5,玻璃纤维滤纸过滤,取AAC柱用3mL BBS1活化,将稀释后的滤液取2mL过柱,用1mL BBS1淋洗,加入1mL纯甲醇洗脱,洗脱液用氮气在45℃吹干,加入浓度为100ng/ml的内标工作液5μL,最后用体积比为50∶50的甲醇-水定容至0.5mL,振荡混匀后,12000rpm下离心15min,取上清液供UFLC-MS/MS测定。
2.根据权利要求1所述中药中赭曲霉毒素A的适体亲和柱净化方法,其特征在于,该方法包括下列步骤:
步骤2)中,适体亲和柱净化-UPLC-FLR检测姜粉中OTA:
a.不同前处理方法及检测技术的对比:对比了QuEChERS、基质辅助固相微萃取、C18萃取小柱、Oasis HLB萃取小柱、Oasis MAX萃取小柱、Mysep 229萃取小柱、Pribofast 290萃取小柱、TC-M160萃取小柱、SPE Ochratoxin A萃取小柱及OchraTestTM免疫亲和柱对样品的净化效果,结果发现只有经免疫亲和柱和适体亲和柱净化后的样品能达到检测的目的,而且UPLC-FLR较HPLC-FLD技术在灵敏度、分析时间方面更具快速、灵敏的检测优势;
b.重复利用性对比:以回收率在70-110%之间为标准,适体亲和柱可达到8次,免疫亲和柱4次;
步骤3)中,适体亲和柱净化-UFLC-MS/MS检测中药中OTA:
a.65种易污染中药材适用性的考察:以20μg/kg的添加水平,考察适体亲和柱在20种种子果实类,20种根及根茎类,6种花类,10种叶及全草类,9种动物类中的适用性,其中种子果实类中药材包括肉豆蔻、胡椒、小茴香、酸枣仁、胖大海、桃仁、陈皮、柏子仁、莲子、使君子、槟榔、生麦芽、决明子、薏苡仁、大枣、白扁豆、杏仁、枳棋子、木瓜和淡豆豉;根及根茎类中药材包括甘草、姜黄、生姜、远志、半夏、郁金、人参、西洋参、当归、葛根、黄芪、黄芩、白芍、天麻、麦冬、板蓝根、石斛、党参、延胡索和巴戟天;花类中药材包括红花、菊花、金银花、槐花、金莲花和辛夷;叶及全草类中药材包括淡竹叶、荷叶、桑叶、侧柏叶、银杏叶、薄荷、广藿香、芫荽、益母草和青蒿;动物类中药材包括龟板、蜈蚣、水蛭、全蝎、僵蚕、地龙、乌梢蛇、土鳖虫和鸡内金。
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