CN106546724A - 一种分子信标探针快速检测赭曲霉毒素a的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分子信标探针快速检测赭曲霉毒素A的新方法,针对特异性识别OTA的DNA关键位点,设计了茎部6个互补碱基,环部8个碱基的分子信标。所述的分子信标序列为:5'-FAM-CCGGGTCCACCCACACCCGG-DABCYL-3',本探针性质稳定且易于合成,用于样品分析操作简单,20min内即可完成检测,准确度好,灵敏度高,可用于麦芽和啤酒等样品中的赭曲霉毒素A的快速筛查。
Description
技术领域
本发明涉及一种用分子信标探针检测赭曲霉毒素A(OTA)的新方法,特别是涉及针对特异性识别OTA分子的核苷酸序列Apt,人工设计分子信标探针MB,利用竞争结合Apt,适用于麦芽、啤酒等样品中OTA的定量检测,属于真菌毒素快速检测领域。
背景技术
麦芽,系禾本科植物大麦Hordeum vulgare L.的成熟果实经发芽干燥而成,广泛分布于我国各地。由于其极高的营养价值,不仅是酿造啤酒的绝好原料,而且也作为中药材在临床医疗保健中发挥着极其重要的作用。麦芽的生长需经淋水湿润,低温烘干,贮藏要求干燥低温条件,对环境要求颇为苛刻,一旦处理不当极易滋生霉菌,其类似于谷物类作物,尤其易受到赭曲霉毒素A的污染。赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)是一种主要由赭曲霉、碳黑曲霉和纯绿曲霉等产生的有毒次级代谢产物,具有很强的肝肾毒性、神经毒性及免疫毒性等,故1993年国际癌症组织IARC已将其定义为2B类致癌物。鉴于OTA的强毒性,以及全球污染的广泛性,欧盟(EU)规定谷物中OTA的含量不得超过5μg·kg-1,并且欧洲食品安全局(EFSA)规定人类每周OTA的摄入量不得超过0.12μg·kg-1。我国GB 13078.2-2006要求谷物及其制品、豆类及其制品的OTA最高限量为5μg·kg-1。麦芽还是啤酒酿造的原材料,欧盟对啤酒中OTA也作出了严格的限量标准(2μg·L-1),然而,近年来屡屡报道OTA污染啤酒的事件发生。因此,建立一种灵敏、快速、准确且适合现场检测的方法,以有效监控麦芽和啤酒中的OTA污染水平,确保麦芽和啤酒的品质以人类健康安全则尤为重要。
目前OTA监测主要依赖于液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)和超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS),其检测精度固然高,但耗资昂贵,且需多步前处理,费时费力。为了满足需求,基于适配体的OTA快速检测成为当前研究热点。
适配体(Aptamer)是一类新型生物识别分子,具有分子量小、可化学合成、稳定性好等优势。分子信标(molecular beacon,MB)则是一种茎环结构的适配体序列,其发卡结构的两端分别标记荧光基团和淬灭基团,环状结构为识别区,自然条件下,发卡结构的两端相互靠近荧光基团受淬灭基团作用,不产生荧光。当存在一段互补序列,能识别环状结构,则造成发卡结构的两端原理,荧光基团恢复荧光。针对能特异性识别靶物质的适配体序列人工设计MB,通过竞争结合适配体序列产生荧光强度的变化,建立灵敏度高、选择性好、抗基质干扰能力强的荧光生物探针,已在食品快速检验、环境检测、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。
发明内容
截至目前,国内外报道的基于适配体检测OTA的方法多采用比色法、荧光标记,电化学法,尚未见单分子信标报道应用于OTA检测,尤其是中药麦芽检测中。本发明的目的在于人工设计一种分子信标探针,建立基于分子信标的超灵敏荧光检测OTA水平的方法及应用。
本发明具体实施方法为:对照组,适配体Apt与分子信标MB反应,产生荧光强度F0;测试组,适配体Apt与OTA反应后,加入分子信标MB,荧光强度为F。计算荧光强度比F/F0,由于F/F0与OTA水平呈正相关,以OTA的浓度水平对F/F0作图,可求得线性方程。因此,根据荧光强度比值可定量检测实际样品OTA污染水平。其优点在于适配体Apt能特异性识别OTA,选择性好,抗基质干扰能力强,设计的分子信标MB探针,能成功与适配体Apt结合后开环,又能成功闭环,保障准确灵敏的监测OTA的水平,将MB探针和适配体Apt结合,建立一种超灵敏的快速检测OTA的方法,具有广阔的开发前景。
技术解决方案
本发明采用的技术方案是:人工设计合成分子信标MB;基于分子信标MB探针,考察影响本法检测的因素如反应时间;在最佳检测条件下,建立对照组和测试组,分别测定荧光强度;计算荧光强度比,对该检测进行方法学验证;将建立的方法应用于实际样品检测,并与LC-MS/MS检测结果进行对比,以进一步确证该方法的可行性。
技术要点:
(1)设计分子信标MB探针,按照下述步骤进行:
a.识别OTA适配体序列的选择:文献研究表明通过SELEX技术筛选所得的Apt(5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′)与OTA的亲和作用能力强,其核酸序列与OTA的解离常数Kd可低至50nM。此外,该适配体能高度特异性识别OTA,选择性好。基于适配体用于OTA的检测原理见图1。
分子信标探针检测原理见图1
b.MB序列的设计:MB核酸序列需要遵循的原则包括:①环状一般由15~30个核苷酸组成,是与靶适配体特异结合的关键位点;②信标的茎干通常为5~8个核苷酸的互补序列,形成发卡结构;③信标茎干的5′修饰荧光基团(如TMR、FAM、QDs等),3′修饰猝灭基团(如Dabcyl、AuNPs)。文献报道5′-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG GAGCATCGGACA-3′划线部位属于OTA的关键识别位点,根据该序列以及上述MB设计原则,我们设计并合成了本实验用分子信标序列5′-FAM-CCGGGTCCACCCACACCCGG-DABCYL-3′,利用该分子信标探针进行OTA的检测的可行性见图2。
分子信标检测可行性考察见图2
c.竞争方式考察:第一种将分子信标MB和适配体Apt反应之后,加入待测物OTA,测定荧光强度,平行制备不加入OTA的对照组,测定荧光强度,计算荧光强度比。第二种将适配体Apt与OTA反应之后,加入MB探针,测定荧光强度,同样平行制备不加入OTA的对照组,计算荧光强度比。考察两种方式的荧光强度比随反应时间的变化,确定最佳的竞争检测方式,见图3。
竞争方式的考察见图3
d.反应时间的考察:将适配体Apt与待测物OTA混合,通过考察不同反应时间(5,10,15,20,30,40,50,60min)条件下,加入分子信标探针后荧光强度的变化,从而确定最佳反应时间见图4;
反应时间优化见图4
e.选择性及抗基质干扰考察:选取OTA结构类似物(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2,ZAN,ZON,CIT,DON,FB1,FB2)考察本法的选择性,以麦芽和啤酒为研究对象,考察空白麦芽提取物和啤酒对适配体和分子信标检测的影响,通过考察荧光强度的变化,验证本法的选择性和抗基质干扰能力,结果见图5。
选择性和抗基质干扰考察见图5
(2)分子信标探针检测方法学考察:
标准曲线和范围:制备不同浓度的待测物OTA溶液,以浓度对荧光强度比作图,建立检测OTA的标准曲线,并确定线性范围,见图6;以荧光强度比0.95,测定MB探针检测OTA的检测限;对麦芽和啤酒的空白样品中分别平行加标计算本法检测的回收率,回收率考察结果采用LC-MS/MS方法进行验证。
OTA标准曲线见图6
(3)该MB探针实际应用性考察-检测市售样品中OTA的污染水平。
该检测技术的优点在于:适体能够与复杂基质中痕量的OTA特异性结合,选择性和抗基质干扰能力强,避免了常规分析中繁冗的前处理过程;采用本法灵敏度高,准确性好,无需大型仪器,适合现场分析;该方法操作简便易行,能够满足过程监控的需求。
附图说明:
图1为分子信标探针检测原理示意图
图2为分子信标检测可行性考察图
图3为反应时间优化见图
图4为竞争方式考察图
图5为选择性和抗基质干扰考察图
图6为OTA标准曲线图
具体实施方式
通过以下实施例对本发明进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。
溶液配制:
1、适配体溶解液(TE缓冲液,pH8.0)
①1M Tris-HCl(pH 8.0)50mL的配制:称取Tris碱6.06g,加超纯水40mL溶解,滴加浓HCl约2.1mL调pH至8.0,定容至50mL;
②0.5M EDTA(pH 8.0)50mL的配制:称取EDTA-Na2·2H2O 9.306g,加超纯水35mL,剧烈搅拌,用约1g NaOH调节pH至8.0,定容至50mL(EDTA二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时,才会溶解);
③1×TE(10mM Tris-HCl,pH 8.0;1mM EDTA,pH 8.0)的配制:移取1M Tris-HCl(pH 8.0)1mL和0.5M EDTA(pH 8.0)0.2mL,加超纯水定容至100mL。
2、退火缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 8.0),50mM NaCl,1mM EDTA。
3、检测缓冲溶液:10mM Tris-HCl(pH 8.5),120mM NaCl,5mM KCl,20mM CaCl2。
实施例1:检测条件的选择
(1)准备过程:
a.适配体Apt溶液的制备:取2.7nmol的适配体溶解于270μL适配体溶解液中(10mMTris-HCl,pH 8.0;1mM EDTA,pH 8.0),备用;
b.分子信标MB溶液的制备:取5.4nmol的适配体加入540μL退火溶解液(50mM NaCl,1mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH 8.0),95℃复性3min,室温放置30min,使其缓慢降温至室温。
(2)最佳检测条件的选择:
a.竞争方式:
①试验组:精密移取检测液350μL,分别加入50μL的10μM Apt溶液和10μM MB溶液,反应2min,加入1μg·mL-1OTA溶液50μL,记录荧光强度:对照组:精密移取检测液350μL,分别加入50μL的10μM Apt溶液和10μM MB溶液50μL,反应2min,加入检测液50μL,记录0~60min内的荧光强度;
②精密移取检测液350μL,分别加入50μL的10μM Apt溶液和1μg·mL-1OTA溶液,反应15min,加入10μM MB溶液50μL,记录荧光强度;对照组:精密移取检测液350μL,分别加入50μL的10μM Apt溶液和检测液,放置15min,再加入10μM MB溶液50μL,反应2min,加入检测液50μL,记录0~60min内的荧光强度;
实验考察结果显示,竞争方式②条件下,OTA的加入,引起荧光强度的变化更灵敏,有助于提高本法的检测灵敏度,OTA与Apt优先反应,剩余的Apt与MB反应,更有利于实现痕量OTA测定。
b.反应时间的考察:分别精密移取适配体Apt与OTA 50μL室温下反应5,10,15,20,30,40,50,60min后,再加入MB,反应2min测定荧光强度,平行制备对照组,考察F/F0随反应时间测变化,确定15min为最佳反应时间;
c.选择性及抗基质干扰考察:①分别将Apt与4种AF总、ZAN、ZON、CIT、DON、FB1、和FB2反应15min,加入MB,记录荧光强度,平行制备对照组。结果显示Apt对OTA的结构类似物没有识别能力,进一步将类似物与OTA混合后,与Apt反应,结果显示,OTA结构类似物不干扰OTA的检测。②制备麦芽和啤酒的空白提取液,将Apt分别与提取物和OTA-提取物混合物反应,结果显示基质不干扰OTA的检测。
实施例2:MB探针检测麦芽和啤酒中的OTA
1.样品提取:
麦芽样品:准确称取麦芽粉末(过二号筛)2.0g(精确至0.1g),加入5mL乙腈-水(80∶20,v/v)溶液,涡旋辅助提取1min,超声提取5min后,4000rpm下离心10min。精密上清液1mL,加入检测液稀释至10mL,混匀,过022μm滤膜,取续滤液即得。
啤酒样品:将市售的罐装啤酒,开盖,超声除气,精密量取10mL置于100mL容量瓶,加检测液定容至刻线,混匀,过0.22μm滤膜,取续滤液即得。
2.荧光检测条件:F7000荧光分光光度仪(日立公司,日本)。仪器参数设置包括激发波长495nm,发射波长500-630nm;扫描速度240nm/s;增益电压400V;狭缝宽度5nm,数据采集间隔0.2nm。
3.液质确证条件:
色谱条件:Prominence UFLC-20A超高效液相色谱仪(日本岛津公司),SHISEIOCAPCELL CORE C18色谱柱(50mm×2.1mm,2.7μm);流动相为0.1%甲酸乙腈(A相)-0.1%甲酸水溶液(B相),梯度洗脱,0~4min,70%~40%B;4~5min,40%~5%B;5~7min,5%B;7~8min,5%~70%B;8~10min,70%B;流速0.3mL·min-1;柱温25℃;进样量2μL。
质谱条件:AB SCIEX QTRAP 5500质谱仪(美国AB应用生物系统公司)配备Analyst 1.6.2数据采集及处理软件,离子源为电喷雾离子源(ESI),扫描模式为多反应离子监测;碰撞气(CAD)为Medium;雾化气(Gas 1)为50Psi;辅助加热气(Gas 2)为50Psi;气帘气(CUR)为35Psi;离子源温度(TEM)为550℃;喷雾电压(IS)为+5500V。两对定性定量监测离子对分别为m/z 404.2→239.1和m/z 404.2→358.0用来确证OTA,碰撞能分别为30和26eV。
4.方法学考察
a.标准曲线:精密移取OTA储备液1mg·mL-1,加入检测液,配制系列浓度(1,0.1,0.01,0.001,0.0001μg·mL-1)的OTA标准品溶液,以不加OTA的空白溶液为对照,计算相对荧光强度,以荧光强度比值为纵坐标,OTA标准品浓度为横坐标,进行线性拟合,得到标准曲线F/F0=-0.17502LogC+0.27383,相关系数R2=0.984,表明在0.0001~1μg·mL-1范围内,线性关系良好。
b.检测灵敏度:以LOD(最低检测限)为荧光抑制率5%(即F/F0×100=95%)时OTA的浓度,可得MB探针检测OTA的LOD为0.05ng·mL-1,表明该法灵敏度高。
c.加标回收试验:准确称取不含OTA的麦芽样品,按照250μg·kg-1,25μg·kg-1和5μg·kg-1的浓度水平添加OTA标品,混匀静置30min,按照样品提取方法处理,采用MB探针检测,每个浓度水平重复三次,测定结果见表1,三个水平的回收率为81.0%-95.2%,其RSD低于5.4%,表明该法用于麦芽测定准确度好。分别精密移取空白啤酒样品9份,按照100μg·L-1,10μg·L-1和2μg·L-1三个水平添加OTA标品,混匀,按照样品制备方法处理,采用MB探针检测,每个浓度水平重复三次,测定回收率在83.7%-97.6%,RSD为4.3%-6.2%,表明该法准确度好,重复性满足要求。
加标回收样品,同时采用LC-MS/MS方法进行验证,结果见表1,测定回收率在(92.5%-117.7%)范围内,RSD低于3.6%,该结果进一步验证了MB探针检测OTA新方法的准确度。
表1分别采用本法和LC-MS/MS方法测定加样回收率结果(n=3)
d.样品测定:运用上述建立的探针方法对2批OTA污染的麦芽样品进行了测定,每个样品平行测定三次,检测结果表明该2批麦芽中OTA污染水平分别为4.48±0.24μg·kg-1和6.28±0.31μg·kg-1。基于MB探针的快速筛查方法,所需样量少,操作简便,快速灵敏,能应用于实际样品检测。
Claims (4)
1.一种分子信标MB探针用于样品中的OTA检测的技术,其特征在于:
针对特异性识别OTA的DNA关键位点,设计了茎部6个互补碱基,环部8个识别碱基的,5’标记FAM,3’标记DABCYL的分子信标,所述的分子信标序列为:
5'-FAM-CCGGGTCCACCCACACCCGG-DABCYL-3’。
2.根据权利要求1所述的OTA的分子信标MB探针,其特征在于:
(1)采用荧光检测手段,激发波长495nm,发射波长500-650nm,检测波长520nm。
(2)所述适配体Apt和分子信标浓度均为10μM。
(3)检测缓冲液:10mM Tris-HCI(pH 8.5),120mM NaCl,5mM MgCl2,20mM CaCl2。
(4)MB探针检测,最佳竞争方式Apt与OTA反应15min,再加入MB,记录荧光强度。
3.以该MB为荧光探针,快速检测OTA的方法,其特征在于:
(1)对照组:吸取检测液350μL,分别加入50μL的Apt和检测液,加入OTA溶液50μL,记录荧光强度F0。
(2)实验组:精密移取检测液350μL,分别加入50μL的Apt溶液和OTA溶液,反应后,加入MB溶液50μL,记录荧光强度F。
(3)相对荧光强度F/F0与溶液中OTA的浓度呈负相关,从而定量测定OTA的污染水平。
4.以该MB探针为检测手段,建立了麦芽和啤酒中的OTA检测方法。
(1)麦芽样品:准确称取麦芽粉末(过二号筛)2.0g(精确至0.1g),加入5mL乙腈-水(80:20,v/v)溶液,涡旋辅助提取1min,超声提取5min后,4000rpm下离心10min;精密上清液1mL,加入检测液稀释至10mL,混匀,过022μm滤膜,取续滤液供测定;啤酒样品:将市售的罐装啤酒,开盖,超声除气,精密量取10mL置于100mL容量瓶,加检测液定容至刻线,混匀,过0.22μm滤膜,取续滤液供测定。
(2)该分子信标MB探针检测麦芽和啤酒中的OTA选择性好,且不受基质干扰。
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