CN104726605A - 一种基于纳米金的分子信标及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于纳米金的分子信标及其制备与应用。所述基于纳米金的分子信标，包括依次排布的荧光基团、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和纳米金，所述环状区为与待测目标分子特异结合的核苷酸片段，所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补。用PolyA连接纳米金及荧光探针，避免了以往用巯基连接，合成复杂，成本高的缺点。且用PolyA连接方法简单，纳米金表面探针数量可调控，探针能保持直立构象，利于后续分子信标与待测目标分子的杂交。

Description

一种基于纳米金的分子信标及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于纳米金的多色分子信标及其制备与应用。

背景技术

1996年Tyagi和Kramer报道了一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针——分子信标(molecular beacon)，最初目的是能在液相中定量测定靶标的量。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。近来，人们通过改变经典分子信标的结构，设计出许多新型的分子信标，如用ssDNA链做环、用RNA-DNA双链做茎的RNA-DNA嵌合型分子信标，用PNA链代替ssDNA形成的PNA分子信标等。新型分子信标的出现为分子信标的进一步应用拓宽了领域。

分子信标的设计一般包括三个部分：

(1)环状区：一般为长度15～30碱基的序列，能与目标分子特异结合；

(2)信标茎干区：通常为长度5～8个碱基的互补序列，茎干区与杂交后环状区-目标分子的双链结构之间的热力学平衡关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针；

(3)荧光基团和猝灭基团，荧光基团一般联接在信标分子的5端；猝灭基团联接在3’端。图1为经典的分子信标结构，其中1-氨基萘-8-羧酸(EDANS)为荧光素，二甲氨基偶氮苯甲酰(DABSYL)为猝灭剂。分子信标中常用4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团，德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。

自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与猝灭分子靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。图2为分子信标的工作原理，当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大。根据Foerster理论,中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100％恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。分子信标中最常用的猝灭剂是DABSYL，它对多种荧光素都有较强的荧光猝灭效率。近来Dubertret等用金纳米粒子簇代替DABSYL做猝灭剂，人们还可以通过调节金属纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的猝灭剂。由于金纳米簇对荧光试剂有着更高的猝灭效率，所以用金纳米粒子代替DABSYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特异性。Demidov等人设计出DNA或PNA无茎分子信标，与经典分子信标结构类似，只是不再含有双链结构的茎杆区。由于DNA戊糖骨架或PNA聚酰胺骨架具有很好的柔韧性，在无靶标存在的情况下，荧光分子与猝灭分子间的疏水作用使得无茎分子信标近似于一个闭环结构。当分子信标与靶标结合后，探针和靶标形成的双链具有刚性结构使荧光分子和猝灭分子分开，荧光恢复。无茎分子信标与经典的分子信标相比，它的优点在于无茎分子信标不含有与靶标无关的序列，但缺点是自由状态时，无茎分子信标的荧光本底较高。

现有的检测miRNA的方法已有多种。如Northern blotting方法是一种直接检测的方法，不需要对miRNA样本进行预扩增，其原理是首用聚丙烯酰胺电泳分离出小的RNA，经洗膜、显影后对条带进行分析。虽然Northern bolt是当前miRNA分析的标准方法，但其操作繁琐、耗时长、灵敏度低和所需样品量过多，且对RNase污染非常敏感。微列阵芯片是实现miRNA表达谱分析和多种miRNA同时高通量检测的主要技术，该方法的优越性在于可实现高通量多组分同时检测，但微阵列芯片的制作成本和检测费用很高，芯片上可利用的样品体积很小，因而导致灵敏度不高，获得数据偏差较大。原位杂交是利用比色或荧光试剂等标记的核酸探针与组织或细胞中的miRNA进行杂交，通过荧光成像或显色来检测miRNA的表达情况，可直观地展现miRNA的时空表达模式，此方法成功应用于多种组织和细胞内miRNA原位分析，也提高了miRNA的检测灵敏度。然而由于miRNA序列较短，原位杂交技术需进一步提高杂交的亲和性，避免miRNA在杂交过程和洗脱过程中丢失。滚环扩增法模仿生物体唤醒DNA分子滚环式复制的方式，以循环实现DNA的连续扩增。但以miRNA为模板连接探针成环的特异性较差且效率低，需要通过电泳分离后利用放射性同位素检测。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于纳米金的分子信标及其制备与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面提供了一种基于纳米金的分子信标，包括依次排布的荧光基团、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和纳米金，所述环状区为与待测目标分子特异结合的核苷酸片段，所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补。

优选地，所述纳米金通过PolyA与第二信标茎干区连接。

PolyA，亦即，多聚腺苷酸，为多个连续的腺苷酸A组成的核苷酸片段。

优选采用PolyA20或PolyA10。

所述PolyA20的核苷酸序列如SEQID NO.18所示，具体为：

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

所述PolyA10的核苷酸序列如SEQID NO.19所示，具体为：

AAAAAAAAAA。

更优选采用PolyA20。

优选地，所述环状区为含有15～30个碱基的核苷酸片段。所述环状区能与待测目标分子特异结合，所述环状区可以根据待测目标分子的核苷酸序列来设计。

优选地，所述第一信标茎干区和第二信标茎干区均为含有5～8个碱基的核苷酸片段。

所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补。

优选地，所述分子信标的5′端连接荧光基团，3′端连接纳米金。

优选地，所述荧光基团的激发波长与所述纳米金的发射波长有部分重叠。更优选地，所述荧光基团选自FAM、ROX、Cy3或Cy5。

优选地，所述纳米金的粒径为13～15nm。所述纳米金为现有技术，既可以参考现有的文献制备，也可以通过商业途径购买。

优选地，所述环状区的核苷酸序列以及任一信标茎干区的核苷酸序列均与待测目标分子的靶核苷酸序列互补。

自由状态时，分子信标的两个末端靠近，使荧光基团与纳米金靠近，此时发生荧光共振能量转移效应。当分子信标与序列完全互补的待测目标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光基团和纳米金距离增大，荧光共振能量转移效应减弱甚至消失。从而根据荧光强度变化来检测目标分子的含量。

本发明的第二方面还提供了一种制备前述基于纳米金的分子信标的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将由依次首尾连接的荧光基团、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和PolyA组成的荧光探针与纳米金混合；

(2)在步骤(1)中所得混合液中，加入PolyA5；

(3)调节PH至中性，离心，洗涤，重悬于杂交液，备用即可。

优选地，所述PolyA5的核苷酸序列如如SEQID NO.20所示，具体为：AAAAA。

优选地，所述荧光探针、纳米金以及PolyA5三者之间的摩尔比例为：(200～800)：1：(100～400)。

更优选地，三者之间的摩尔比例为：300：1：100。

优选地，所述荧光探针的浓度为：50uM～100uM。更优选地，所述荧光探针的浓度为100uM。

优选地，所述纳米金的浓度为3nM～10nM。更优选地，所述纳米金的浓度为3nM。

优选地，所述PolyA5的浓度为50uM～100uM。更优选地，所述PolyA5的浓度为100uM。

优选地，调节PH时，采用0.2M的PB溶液。

优选地，所述离心的速度为12000rpm，时间为20～30min。

优选地，洗涤时采用0.1M的PB溶液。

优选地，杂交液采用0.1M的PBS溶液。

本发明的第三方面公开了一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：先将待测目标分子和前述基于纳米金的分子信标混合，再进行荧光值检测。

优选地，所述目标分子包括DNA、miRNA、mRNA。

优选地，所述前述基于纳米金的分子信标如上所述。

本发明第四方面还提供了前述基于纳米金的分子信标在制备DNA、miRNA或mRNA检测试剂中的应用。

本发明第五方面，提供了一种试剂盒，包括前述基于纳米金的分子信标。

本发明检测原理如图1所示：

利用大粒径的纳米金颗粒(15nm)作为猝灭基团，通过PolyA连接多种带有不同荧光基团的DNA探针。当没有靶标存在时，分子探针自身碱基互补配对，荧光基团的荧光被淬灭基团淬灭。当有靶标存在时，靶标与分子探针互补配对，荧光基团发出荧光，通过检测荧光信号，实现检测。

本发明的技术关键点在于，用PolyA连接纳米金及荧光探针，避免了以往用巯基连接，合成复杂，成本高。且用PolyA连接方法简单，纳米金表面探针数量可调控，探针能保持直立构象，利于后续杂交。

本发明的有益效果为：

(1)分子信标探针设计：传统的分子信标设计方案，通常是分子信标的环状部位与靶基因互补配对，实现杂交。但针对纳米金连接的分子信标而言，该种杂交方式杂交效率差。故在设计分子信标序列时，让茎部的部分序列也与靶基因互补配对，既保持了分子信标的茎环结构，又保证检测的特异性，提高杂交效率。

(2)分子信标探针与纳米金的偶联：在偶联过程中，由于DNA没有完全覆盖纳米金表面，使得纳米金在盐溶液中极易聚沉变色，故应确定组装条件，避免纳米金聚沉。在传统的DNA-AuNPs偶联物制备方法中，通常需要将DNA作特殊修饰，如巯基(-SH)修饰，然后再Au-S键的作用下，将DNA组装到AuNPs表面。但这样的偶联方法，成本太高。同时研究发现：通过SH修饰的纳米金探针，在杂交效率和杂交动力学上表现不佳。在制备三明治结构的纳米金探针时，往往就需要过夜杂交。故本发明合成一段多聚A(poly A)的DNA序列，首次实现了免标记DNA序列在纳米金表面的组装。该方法更简单，成本更低。同时，还具有SH组装无法达到的效果：组装密度可控，杂交效率及动力学提高。

(3)本发明以纳米金为分子信标淬灭基团，可连接带有不同荧光基团的探针组装成多色纳米分子信标，用于同时检测多种目标分子。方法简单，且纳米金与荧光探针用PolyA连接，合成成本大大降低。

附图说明

图1：本发明检测原理图。

图2：本发明实施例1制备的纳米金表征图。

图3：对实施例2形成的分子信标与待测目标分子miR155进行杂交前后的荧光进行检测，获得对应的荧光图谱：由上到下，上面一条曲线为分子信标未与待测目标分子miR155进行杂交时的荧光曲线，下面一条曲线为分子信标未与待测目标分子miR155进行杂交后的荧光曲线，可以发现，杂交后的荧光曲线反而比杂交前的荧光曲线荧光值低，说明采用短的T序列和PolyA连接纳米金和荧光探针这种方式不成功。

图4：对形成的分子信标3-1和3-2进行紫外检测，获得对应的紫外图谱，由上到下，最上面一条为单纯的AuNPs紫外曲线；中间一条为PolyA20+Au形成的分子信标3-2的紫外曲线，最高峰值A523＝0.412，分子信标3-2的浓度为1.53nM；最下面一条为PolyA10+Au形成的分子信标3-1的紫外曲线，最高峰值A523＝0.385，分子信标3-1的浓度为1.43nM。

图5：分子信标3-1所对应荧光探针的标准曲线。

图6：分子信标3-2所对应荧光探针的标准曲线。

图7：分子信标3-1所对应荧光探针以及分子信标3-1经MCH取代后所获得的荧光曲线图，从上到下，第一条曲线表示浓度为100uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第二条曲线表示浓度为80uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第三条曲线表示浓度为60uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第四条曲线表示浓度为40uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第五条曲线表示经MCH取代后分子信标3-1上连接的荧光探针所对应的荧光曲线，其最高峰(520nm处)对应的荧光值为1873593；第六条曲线表示浓度为20uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第七条曲线表示浓度为10uM的荧光探针所对应的荧光曲线。

图8：分子信标3-2所对应荧光探针以及分子信标3-2经MCH取代后所获得的荧光曲线图，由上到下，第一条曲线表示浓度为100uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第二条曲线表示浓度为80uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第三条曲线表示浓度为60uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第四条曲线表示浓度为40uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第五条曲线表示经MCH取代后分子信标3-2上连接的荧光探针所对应的荧光曲线，其最高峰(520nm处)对应的荧光值为1425361.5；第六条曲线表示浓度为20uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第七条曲线表示浓度为10uM的荧光探针所对应的荧光曲线。

图9：对分子信标3-1和分子信标3-2分别与待测目标分子miR155进行杂交后进行荧光检测，获得对应的荧光图谱，由上到下，第一条曲线表示分子信标3-1与miR155杂交后所得的荧光曲线，第二条曲线表示分子信标3-2与miR155杂交后所得的荧光曲线。说明：两条曲线均已扣除了未杂交时的背景荧光值。可以看出，连有PolyA20的分子信标3-2荧光值更高。

图10：新设计的分子信标4-1与案例3中分子信标3-2的荧光图谱进行比较，由上到下，第一条曲线是分子信标4-1与miR155进行杂交所得的荧光曲线；第二条曲线是分子信标3-2与miR155进行杂交所得的荧光曲线。说明：待测靶miRNA 155浓度均用200nM，两条曲线均已扣除未杂交时背景荧光值。可以看出，新改良后的分子信标4-1荧光值明显升高(大约2倍)。证明新设计的分子信标4-1探针有效。

图11：由上到下，第一条曲线代表快速组装调PH法所制备的分子信标与待测目标分子miR155杂交后所得的荧光图普，第二条曲线表示加盐老化法所制备的分子信标与待测目标分子miR155杂交后所得的荧光图谱。

图12：图a)表示原始分子信标3-2即只有环部序列与靶序列杂交，以及改进后的分子信标4-1即茎环部同时与靶序列杂交所得的荧光图；b)表示没有A5共组装获得的4-1，及有A5共组装获得的4-2的荧光值。

图13：对分子信标MB-1、MB-2、MB-3进行TEM表征，可看出连接了荧光探针的AuNPs颗粒分散性良好，大小均一，说明连接荧光探针与纳米金颗粒连接成功。

图14：对分子信标MB-1、MB-2、MB-3进行紫外表征，其中，曲线1表示未连接荧光探针前的AuNPs颗粒紫外图谱(最大吸收峰518nm)，曲线2表示连接荧光探针形成了分子信标后的紫外图谱(红移至525nm)；可以看出两条线稍有红移，证明AuNPs颗粒与荧光探针连接成功。

图15：图a)为分子信标MB-1荧光探针标准曲线；图b)为分子信标MB-2荧光探针标准曲线；图c)为分子信标MB-3荧光探针标准曲线。

图16：图a)中，曲线1表示分子信标MB-1与Target DNA1杂交后的荧光曲线；曲线2表示分子信标MB-1与Target DNA 1’杂交后的荧光曲线；曲线3表示未与任何物质杂交的分子信标MB-1自身的本底荧光曲线；图b)中，曲线1表示分子信标MB-2与Target DNA2杂交后的荧光曲线；曲线2表示分子信标MB-2与Target DNA 2’杂交后的荧光曲线；曲线3表示未与任何物质杂交的分子信标MB-2自身的本底荧光曲线；图c)中，曲线1表示分子信标MB-3与Target DNA3杂交后的荧光曲线；曲线2表示分子信标MB-3与Target DNA 3’杂交后的荧光曲线；曲线3表示未与任何物质杂交的分子信标MB-3自身的本底荧光曲线。

图17：为采用分子信标检测不同浓度靶miRNA(0,0.01,0.05,0.1,0.5,1,10,50,100,150及200nM)所对应的荧光值；图a)为采用分子信标MB-1检测TargetmiRNA1(miRNA155 segment)所得荧光曲线图；图b)为采用分子信标MB-2检测TargetmiRNA2(miRNA196a segment)所得荧光曲线图；图c)为采用分子信标MB-3检测TargetmiRNA3(miRNA210 segment)所得荧光曲线图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

(1)材料及设备

氯金酸(HAuCl4·4H2O，99.99％)，柠檬酸三钠，磷酸盐，NaCl，MgCl2，KCl，Milli-Q水；透射电子显微镜(TEM)，紫外分光光度计(Hitachi U-3010)，荧光分光光度计(F-4500,Hitachi)，PH计，冷冻高速离心机(Hitachi)；分子信标购于生工生物工程(上海)股份有限公司并使用高效液相色谱纯化，靶标分子(miRNA)购于英潍捷基(上海)贸易有限公司。

(2)纳米金(AuNPs)的制备及表征

可参照下述文献中所记载的方法来制备纳米金(AuNPs)，参考文献：

K.C.Grabar,R.G.Freeman,M.B.Hommer,M.J.Natan,Analytical

Chemistry 1995,67,735。

亦即，用柠檬酸还原法合成纳米金。基本步骤如下：99mL水中加入1mL HAuCl4(1％，M/V)溶液，加入圆底烧瓶。然后再油浴中搅拌加热至沸腾，接着加入3.5mL柠檬酸钠(1％，M/V)溶液，加热搅拌反应20min。最后搅拌冷却至室温。该方法制备的纳米金浓度为2.3nM，通过高速离心机离心(12000rpm，20min)浓缩至11.5nM备用。不同浓度的纳米金溶液，通过加入不同体积的水稀释11.5nM纳米金溶液得到。制备好的纳米金表征如图2所示。

此外，也可通过商业途径购买纳米金。

实施例2

最初设计针对miR155的分子信标，所述分子信标的环状区能与miR155特异结合，所述分子信标的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接PolyA10(亦即，10个连续的A碱基)。为了让分子信标形成二级茎环结构后，荧光探针与与纳米金表面有一定距离，使其构象保持直立，以利于杂交，在PolyA10与荧光探针的3’端之间连接5个连续的T碱基。

将3’端连接有5个连续的T碱基和PolyA10的荧光探针

5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGTTTTTAAAAAAAAAA-3’(100uM,1.8uL)与AuNPs(3nM,200uL)共组装后孵育16h。加盐(1M NaCl,100mM PB)22ul，静置孵育24h.离心洗涤(0.1M PBS)。

最终形成的分子信标为：

5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGTTTTTAAAAAAAAAA-Au-3’(SEQ ID NO.1)

对形成的分子信标与待测目标分子miR155进行杂交前后的荧光进行检测，获得对应的荧光图谱，结果如图3所示，由上到下，上面一条曲线为分子信标未与待测目标分子miR155进行杂交时的荧光曲线，下面一条曲线为分子信标未与待测目标分子miR155进行杂交后的荧光曲线，可以发现，杂交后的荧光曲线反而比杂交前的荧光曲线荧光值低，说明采用短的T序列和PolyA连接纳米金和荧光探针这种方式不成功。分析原因：短的T序列有可能和PolyA10结合，从而影响PolyA10与纳米金的结合，导致纳米金与荧光探针连接不理想。

实施例3

(1)然后采用其他方式设计针对miR155的分子信标，所述分子信标的环状区能与miR155特异结合，所述分子信标的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接PolyA10(亦即，10个连续的A碱基)或PolyA20(亦即，20个连续的A碱基)。在PolyA10、PolyA20与荧光探针3’端之间直接连接，无T碱基。

将3’端连接PolyA10的荧光探针

5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3’(100uM,1.8uL)与AuNPs(3nM,200uL)共组装后孵育16h.加盐(1M NaCl,100mM PB)22ul，静置孵育24h.离心洗涤(0.1M PBS)。

最终形成的分子信标为：

5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-Au-3’(SEQID NO.2)，记为分子信标3-1。

将3’端连接PolyA20的荧光探针

5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(100uM,1.8uL)与AuNPs(3nM,200uL)共组装后孵育16h.加盐(1M NaCl,100mM PB)22ul，静置孵育24h.离心洗涤(0.1M PBS)。

最终形成的分子信标为：

5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Au-3’(SEQ ID NO.3)记为分子信标3-2。

将上述制备好的分子信标溶于100mM PBS杂交溶液中，备用。

对形成的分子信标3-1和3-2进行紫外检测，获得对应的紫外图谱，并用紫外定量分子信标的浓度，计算公式为：C分子信标＝A_520nm*2.2*10^-8M。

如图4所示，由上到下，最上面一条为单纯的AuNPs紫外曲线；中间一条为PolyA20+Au形成的分子信标3-2的紫外曲线，最高峰值A₅₂₃＝0.412，分子信标3-2的浓度为1.53nM；最下面一条为PolyA10+Au形成的分子信标3-1的紫外曲线，最高峰值A₅₂₃＝0.385，分子信标3-1的浓度为1.43nM。

(2)计算AuNPs表面荧光探针组装密度

1)绘制标准曲线：

将两种荧光探针(带FAM荧光，初始浓度均为100uM)分别进行浓度梯度稀释。稀释所用的溶液为100mM PBS，稀释的浓度分别为100uM，80uM，60uM，40uM，20uM，10uM。将不同浓度的稀释液用荧光分光光度计进行荧光检测，得出520nm(FAM发射光波长)处荧光值，绘制标准曲线。标准曲线横坐标为荧光探针浓度，纵坐标为每种荧光探针浓度对应的荧光值。

注：标准曲线是在同的离子强度、pH、ME浓度缓冲溶液下绘制的。

结果：

分子信标3-1所对应荧光探针

(5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3’)的标准曲线如图5所示；

分子信标3-2所对应荧光探针

(5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’)的标准曲线如图6所示。

2)将分子信标3-1和3-2进行巯基乙醇(MCH)取代，计算荧光探针组装量：将分子信标3-1和3-2分别加入巯基乙醇MCH(MCH终浓度为20mM)，室温下摇动过夜，接着离心法收集上清中荧光标记的探针，检测荧光强度。最后将520nm处荧光值代入各自所对应的标准曲线，计算荧光标记探针浓度。

(5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3’)以及MCH取代后分子信标3-1所获得的荧光曲线图如图7所示：从上到下，第一条曲线表示浓度为100uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第二条曲线表示浓度为80uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第三条曲线表示浓度为60uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第四条曲线表示浓度为40uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第五条曲线表示经MCH取代后分子信标3-1上连接的荧光探针所对应的荧光曲线，其最高峰(520nm处)对应的荧光值为1873593；第六条曲线表示浓度为20uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第七条曲线表示浓度为10uM的荧光探针所对应的荧光曲线。实验结果经标准曲线方程计算后，得出分子信标3-1上连接的荧光探针浓度约为32.4nM，结合紫外结果(3-1分子信标浓度为1.53nM)，计算分子信标3-1上每个纳米金上所对应荧光探针的组装量为21条。

(5’-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’)以及分子信标3-2取代后所获得的荧光曲线图，如图8所示：由上到下，第一条曲线表示浓度为100uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第二条曲线表示浓度为80uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第三条曲线表示浓度为60uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第四条曲线表示浓度为40uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第五条曲线表示经MCH取代后分子信标3-2上连接的荧光探针所对应的荧光曲线，其最高峰(520nm处)对应的荧光值为1425361.5；第六条曲线表示浓度为20uM的荧光探针所对应的荧光曲线；第七条曲线表示浓度为10uM的荧光探针所对应的荧光曲线。实验结果经标准曲线方程计算后，得出分子信标3-2上连接的荧光探针浓度约为35.6nM，结合紫外结果(3-2分子信标浓度为1.30nM)，计算分子信标3-2上每个纳米金上所对应荧光探针的组装量为27条。

3)对分子信标3-1和分子信标3-2分别与待测目标分子miR155进行杂交后进行荧光检测，获得对应的荧光图谱，结果如图9所示，由上到下，第一条曲线表示分子信标3-1与miR155杂交后所得的荧光曲线，第二条曲线表示分子信标3-2与miR155杂交后所得的荧光曲线。说明：两条曲线均已扣除了未杂交时的背景荧光值。可以看出，连有PolyA20的分子信标3-2荧光值更高。

综上所述，采用PolyA20连接纳米金及荧光探针来构建分子信标，效果更好。

实施例4

此后，为了进一步提高分子信标与待测目标分子的杂交效率，对分子信标进行进一步的改进。亦即，拟将分子信标的其中一端的茎干区序列也与待测目标分子的靶序列互补配对。

(1)设计针对miR155的分子信标：

所述分子信标的环状区和其中一端的茎干区均能与miR155特异结合，所述分子信标的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接PolyA20(亦即，20个连续的A碱基)。

将3’端连接PolyA20的荧光探针

5’-FAM-ACCCCTATCACGATTAGCATTAAGGGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(100uM,1.8uL)与AuNPs(3nM,200uL)共组装后孵育16h.加盐(1M NaCl,100mM PB)22ul，静置孵育24h，离心洗涤(0.1M PBS)。

最终形成的分子信标为：

5’-FAM-ACCCCTATCACGATTAGCATTAAGGGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--Au-3’(SEQ ID NO.4)，记为分子信标4-1。

如图10所示，新设计的分子信标4-1与案例3中分子信标3-2的荧光图谱进行比较，由上到下，第一条曲线是分子信标4-1与miR155进行杂交所得的荧光曲线；第二条曲线是分子信标3-2与miR155进行杂交所得的荧光曲线。待测靶miRNA 155浓度均用200nM，两条曲线均已扣除未杂交时背景荧光值。可以看出，新改良后的分子信标4-1荧光值明显升高(大约2倍)。证明新设计的分子信标4-1探针有效。

(2)连接方法探索

用PolyA来连接纳米金颗粒与荧光探针时，主要有两种连接方法。一种是“加盐老化”法，另一种是“调PH值快速组装”法。两种方法的具体步骤如下：

1)加盐老化法

a:荧光探针(100uM,1.8uL)+AuNPs(3nM,200uL)，快速涡旋；

b:共组装后孵育16h。加盐(1M NaCl,100mM PB)22ul，静置孵育24h；

c:离心洗涤三次(0.1M PB洗涤液)；

d:重悬于杂交液0.1M PBS中。

2)快速组装调PH法

a:纳米金(3nM,200uL)和荧光探针(100uM，1uL)按体积比例1：200混合，3min后加入pH＝2.0浓度为500mM的柠檬酸三钠缓冲液，快速涡旋，使柠檬酸三钠缓冲液终浓度为10mM；

b:3min后加入0.2M的PB溶液调节pH到约为7，使得PB的终浓度约为50mM；

c:离心(12000rpm，20～30min)洗涤三次，除去游离荧光探针，洗涤溶液为0.1M的PB溶液；

d:重悬于杂交液0.1M的PBS溶液中。

实验结果对比如图11所示：由上到下，第一条曲线代表快速组装调PH法所制备的分子信标与待测目标分子miR155杂交后所得的荧光图普，第二条曲线表示加盐老化法所制备的分子信标与待测目标分子miR155杂交后所得的荧光图谱。说明：待测靶miRNA 155浓度均用200nM，两组结果均是扣除本底即未杂交后的荧光曲线。

从上述实验结果可以看出，快速组装法实验结果更好。故实验选用快速组装法进行。

(3)共组装方法的探讨

为获得更好的杂交效率，本课题拟采用荧光探针和短Poly序列(A5)共组装的方法。

亦即，将3’端连接PolyA20的荧光探针

5’-FAM-ACCCCTATCACGATTAGCATTAAGGGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(100uM)与AuNPs(3.6nM)以体积比300:1的比例混合，然后再加入短序列A5，快速涡旋，所述A5(100uM)与MB1(100uM)的体积比为1:3；加入pH＝2.0浓度为500mM的柠檬酸三钠缓冲液，快速涡旋，使柠檬酸三钠缓冲液终浓度为10mM；

2)3min后加入0.2M的PB溶液调节pH到约为7，使得PB的终浓度约为50mM；

3)离心(12000rpm，20～30min)洗涤三次，除去游离荧光探针，洗涤溶液为0.1M的PB溶液；

4)重悬于杂交液0.1M的PBS溶液中。

最终形成的分子信标为：

5’-FAM-ACCCCTATCACGATTAGCATTAAGGGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Au-3’(SEQ ID NO.5)，记为分子信标4-2。

结果如图12所示，其中上图a)表示原始分子信标3-2即只有环部序列与靶序列杂交，以及改进后的分子信标4-1即茎环部同时与靶序列杂交所得的荧光图；b)表示表示没有A5共组装获得的4-1，及有A5共组装获得的4-2的荧光值。

两组图均扣除未杂交时的本底荧光值。

从上面结果可以看出，有A5共组装时，获得的MB-1的杂交效率更高。

自此，本实验得出以下结论：在设计分子信标时，我们采用荧光探针一端茎干序列及环部序列同时与靶序列碱基互补配对；在组装方法上采用快速组装法；用荧光探针与A5共组装的方法，以实现更高的杂交效率。

实施例5

根据实施例1～4的优化实验方法，设计分子信标，并对待测目标分子进行检测。

(1)设计针对miR155的分子信标：

所述分子信标的环状区和其中一端的茎干区均能与miR155特异结合，所述分子信标的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接PolyA20(亦即，20个连续的A碱基)。

1)将3’端连接PolyA20的荧光探针

5’-FAM-ACCCCTATCACGATTAGCATTAAGGGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(100uM)与AuNPs(3.6nM)以体积比300:1的比例混合，然后再加入短序列A5，快速涡旋，所述A5(100uM)与MB1(100uM)的体积比为1:3；加入pH＝2.0浓度为500mM的柠檬酸三钠缓冲液，快速涡旋，使柠檬酸三钠缓冲液终浓度为10mM；

2)3min后加入0.2M的PB溶液调节pH到约为7，使得PB的终浓度约为50mM；

3)离心(12000rpm，20～30min)洗涤三次，除去游离荧光探针，洗涤溶液为0.1M的PB溶液；

4)重悬于杂交液0.1M的PBS溶液中。

最终形成的分子信标为：

5’-FAM-ACCCCTATCACGATTAGCATTAAGGGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Au-3’(SEQ ID NO.6)，记为分子信标MB-1。

(2)设计针对miR196a的分子信标：

所述分子信标的环状区和其中一端的茎干区均能与miR196a特异结合，所述分子信标的5’端连接ROX荧光基团，3’端连接PolyA20(亦即，20个连续的A碱基)。

1)将3’端连接PolyA20的荧光探针

5’-ROX-CCCAACAACATGAAACTACCTATTGGG-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(100uM)与AuNPs(3.6nM)以体积比300:1的比例混合，然后再加入短序列A5，快速涡旋，所述A5(100uM)与MB1(100uM)的体积比为1:3；加入pH＝2.0浓度为500mM的柠檬酸三钠缓冲液，快速涡旋，使柠檬酸三钠缓冲液终浓度为10mM；

2)3min后加入0.2M的PB溶液调节pH到约为7，使得PB的终浓度约为50mM；

3)离心(12000rpm，20～30min)洗涤三次，除去游离荧光探针，洗涤溶液为0.1M的PB溶液；

4)重悬于杂交液0.1M的PBS溶液中。

最终形成的分子信标为：

5’-ROX-CCCAACAACATGAAACTACCTATTGGG-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Au-3’(SEQ ID NO.7)，记为分子信标MB-2。

(3)设计针对miR210的分子信标：

所述分子信标的环状区和其中一端的茎干区均能与miR210特异结合，所述分子信标的5’端连接Cy3荧光基团，3’端连接PolyA20(亦即，20个连续的A碱基)。

1)将3’端连接PolyA20的荧光探针

5’-Cy3-CAGTGTGCGGTGGGCAGGGCTCACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(100uM)与AuNPs(3.6nM)以体积比300:1的比例混合，然后再加入短序列A5，快速涡旋，所述A5(100uM)与MB1(100uM)的体积比为1:3；加入pH＝2.0浓度为500mM的柠檬酸三钠缓冲液，快速涡旋，使柠檬酸三钠缓冲液终浓度为10mM；

2)3min后加入0.2M的PB溶液调节pH到约为7，使得PB的终浓度约为50mM；

3)离心(12000rpm，20～30min)洗涤三次，除去游离荧光探针，洗涤溶液为0.1M的PB溶液；

4)重悬于杂交液0.1M的PBS溶液中。

最终形成的分子信标为：

5’-Cy3-CAGTGTGCGGTGGGCAGGGCTCACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Au-3’(SEQ ID NO.8)，记为分子信标MB-3。

(4)对本实施例所得到的分子信标MB-1、MB-2、MB-3进行TEM表征，结果详见图13，可看出连接了荧光探针的AuNPs颗粒分散性良好，大小均一，说明连接荧光探针与纳米金颗粒连接成功。

(5)对本实施例所得到的分子信标MB-1、MB-2、MB-3进行紫外表征，所得紫外图谱如图14所示。其中，曲线1表示未连接荧光探针前的AuNPs颗粒紫外图谱(最大吸收峰518nm)，曲线2表示连接荧光探针形成了分子信标后的紫外图谱(红移至525nm)。可以看出两条线稍有红移，证明AuNPs颗粒与荧光探针连接成功。

AuNPs表面荧光探针组装密度计算：

具体方法参照本发明实施例3(2)中所述方法。

标准曲线如图15所示。其中，图a)为分子信标MB-1荧光探针标准曲线；图b)为分子信标MB-2荧光探针标准曲线；图c)为分子信标MB-3荧光探针标准曲线。

(6)检测待测靶DNA及碱基错配DNA

MB-1所针对的靶DNA，记为Target DNA1，其核苷酸序列如SEQID NO.9所示，具体为：

TTAAT GCTAA TCGTG ATAGG GGT。

MB-1所针对的碱基错配DNA，记为Target DNA 1’(single-base mismatched)，其核苷酸序列如SEQID NO.10所示，具体为：

TTAAT GCTAA TAGTG ATAGG GGT。

MB-2所针对的靶DNA，记为Target DNA2，其的核苷酸序列如SEQID NO.11所示，具体为：

AGCCC CTGCC CACCG CACAC TG。

MB-2所针对的碱基错配DNA，记为Target DNA 2’(single-base mismatched)，其核苷酸序列如SEQID NO.12所示，具体为：

AGCCC CTGCC TACCG CACAC TG。

MB-3所针对的靶DNA，记为Target DNA3，其核苷酸序列如SEQID NO.13所示，具体为：

TAGGT AGTTT CATGT TGTTG GG。

MB-3所针对的碱基错配DNA，记为Target DNA 3’(single-base mismatched)，其核苷酸序列如SEQID NO.14所示，具体为：

TAGGT AGTTT GATGT TGTTGGG。

取组装好的分子信标MB-1、MB-2、MB-3稀释至1nM。分别加入200nM等量的靶DNA及碱基错配DNA，进行检测，并比较结果。

如图16所示，

图a)中，曲线1表示分子信标MB-1与Target DNA1杂交后的荧光曲线；曲线2表示分子信标MB-1与Target DNA 1’杂交后的荧光曲线；曲线3表示未与任何物质杂交的分子信标MB-1自身的本底荧光曲线；

图b)中，曲线1表示分子信标MB-2与Target DNA2杂交后的荧光曲线；曲线2表示分子信标MB-2与Target DNA 2’杂交后的荧光曲线；曲线3表示未与任何物质杂交的分子信标MB-2自身的本底荧光曲线；

图c)中，曲线1表示分子信标MB-3与Target DNA3杂交后的荧光曲线；曲线2表示分子信标MB-3与Target DNA 3’杂交后的荧光曲线；曲线3表示未与任何物质杂交的分子信标MB-3自身的本底荧光曲线。

(7)检测待测miRNA

MB-1所针对的靶miRNA，记为Target miRNA1(miRNA155 segment)，其核苷酸序列如SEQID NO.15所示，具体为：

UUAAU GCUAA UCGUG AUAGG GGU。

MB-2所针对的靶DNA，记为Target miRNA2(miRNA196a segment)，其的核苷酸序列如SEQID NO.16所示，具体为：

AGCCC CUGCC CACCG CACAC UG。

MB-3所针对的靶miRNA，记为Target miRNA3(miRNA210 segment)，其核苷酸序列如SEQID NO.17所示，具体为：

UAGGU AGUUU CAUGU UGUUG GG。

取组装好的分子信标MB-1、MB-2、MB-3稀释至1nM。分别加入200nM等量的靶miRNA，用荧光分光光度计测量荧光值的变化，并比较结果。

如图17所示，为采用分子信标检测不同浓度靶miRNA(0,0.01,0.05,0.1,0.5,1,10,50,100,150及200nM)所对应的荧光值；

图a)为采用分子信标MB-1检测Target miRNA1(miRNA155 segment)所得荧光曲线图；

图b)为采用分子信标MB-2检测Target miRNA2(miRNA196a segment)所得荧光曲线图；

图c)为采用分子信标MB-3检测Target miRNA3(miRNA210 segment)所得荧光曲线图；

可得出MB-1、MB-2和MB-3的检测限低至10pM，检测范围10pM-200nM。

由此可见，本发明的分子信标克服了现有技术中的种种缺陷，具有很好的应用前景。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种基于纳米金的分子信标，包括依次排布的荧光基团、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和纳米金，所述环状区为与待测目标分子特异结合的核苷酸片段，所述第一信标茎干区的核苷酸序列与第二信标茎干区的核苷酸序列互补。

2.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于，所述纳米金通过PolyA与第二信标茎干区连接。

3.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于，所述环状区为含有15～30个碱基的核苷酸片段。

4.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于，所述第一信标茎干区和第二信标茎干区均为含有5～8个碱基的核苷酸片段。

5.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于，所述荧光基团的激发波长与所述纳米金的发射波长有部分重叠。

6.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于，所述环状区的核苷酸序列以及任一信标茎干区的核苷酸序列均与待测目标分子的靶核苷酸序列互补。

7.一种制备如权利要求1～6任一权利要求所述分子信标的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将由依次首尾连接的荧光基团、第一信标茎干区、环状区、第二信标茎干区和PolyA组成的荧光探针与纳米金混合；

(2)在步骤(1)中所得混合液中，加入PolyA5；

(3)调节PH至中性，离心，洗涤，重悬于杂交液，备用即可。

8.一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：先将待测目标分子和如权利要求1～6任一权利要求所述的基于纳米金的分子信标混合，再进行荧光值检测。

9.如权利要求1～6任一权利要求所述的基于纳米金的分子信标在制备DNA、miRNA或mRNA检测试剂中的应用。

10.一种试剂盒，包括如权利要求1～6任一权利要求所述的基于纳米金的分子信标。