CN110297083A - 三嵌段纳米金的构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Poly A介导的可调控纳米金探针的构建及其应用。所述Poly A介导的可调控的纳米金探针，包括纳米金颗粒，三嵌段DNA，报告序列和两个不同的荧光基团。所述三嵌段DNA包含Poly A和两段识别序列，Poly A用于与纳米金表面结合，两段识别序列可以用于不同的生物分子识别。所述的报告序列修饰所述的荧光基团。所述荧光基团淬灭在纳米金表面。与本发明首次在Poly A两端连接识别序列，并且通过组装探针实现两种分子的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Poly A介导的可调控纳米金探针的构建及其应用。
背景技术
核酸适配体(aptamer)是利用SELEX技术，在体外人工筛选的一段短的寡核苷酸序列。从理论上而言，任何靶物质，包括蛋白及各种小分子甚至是细胞都能筛选出与之对应的核酸适配体。目前，较常用的且成熟的核酸适配体有凝血配aptamer,钾离子aptamer，ATPaptamer,可卡因aptamer等。纳米金是指金的微小颗粒，尺寸在1nm～100nm之间，在水溶液中以胶体形式存在。纳米金具有独特的光学性质，作为荧光共振能量转移(FRET)的受体，纳米金吸收来自荧光分子的能量并且产生发射光。当发射光与纳米金颗粒表面氢离子带叠加时，荧光淬灭。纳米金的FRET效应可以用于构建众多基于荧光信号检测的球形核苷酸探针。基于高速发展的DNA纳米技术和纳米金的优良光学性质，DNA-纳米金结合产物用于生物检测受到广泛应用。
目前常见的探针设计策略通常是使用巯基将DNA序列组装在纳米金表面，这种组装方法存在着探针密度过高、探针空间位阻大且存在非特异性吸附等问题。另外，巯基修饰的DNA成本很高。随后，改进的策略使用多聚腺苷酸(polyA)用于探针组装。这种方法克服了巯基组装探针存在的弊端，能够防止探针特异性吸附和实现空间密度调控。然而，上述的探针设计策略仅仅能够实现一种识别序列的组装，并不能使用两种生物分子同时检测。而使用多种探针对样品进行检测需要多次重复工作。因此，我们很有必要设计一种可以同时识别两种生物分子的DNA，提高检测效率。
发明内容
本发明的目的是，构建一种可同时组装两个aptamer的生物探针，提高实际样本中的检测效率。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
为了解决上述问题，我们设计了一种以纳米金为核心的三嵌段DNA纳米金探针。所述的三嵌段包括一段多聚腺苷酸(polyA)序列用于DNA探针的组装，在所述的polyA序列的两端连接两种核酸适配体验(aptamer)用于两种不同的生物分子检测。另外，我们还根据不同核酸适配体设计了两段带有荧光标记的报告序列与aptamer序列杂交。杂交后的三嵌段组装在纳米金表面，纳米金与荧光分子发生能量共振转移现象导致荧光淬灭。当体系中加入目标分子时，特异性的aptamer能够识别并且与目标分子发生反应。aptamer构象发生变化后不再与报告序列发生杂交。FRET具有对于距离的敏感性，报告分子从识别序列上取代下来，导致荧光分子和纳米金颗粒表面的距离变远，FRET现象减弱甚至消失，荧光恢复。基于不同荧光信号的强度，我们可以获得相应目标分子的浓度。在此我们以ATP和K+为例证明三嵌段用于可用于两种生物分子同时检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一方面提供了一种纳米金探针，包括纳米金颗粒以及连接在所述纳米金颗粒上的三嵌段DNA探针。所述三嵌段DNA探针包括三条DNA链，所述第一条DNA链包括5’-3’依次排列的第一区段，第二区段和第三区段；所述第一区段和所述第二条链互补，所述第二区段为多聚腺苷酸区段，所述第三区段与第三条链互补；所述第二条链和所述第三条链分别为不同的荧光分子标记的不同目标分子的aptamer。
本发明提供的纳米金探针中的第一条链也成为三嵌段DNA，三嵌段DNA中的所述第一区段与第三区段也称为识别序列，分别与特定生物分子的aptamer部分互补。本发明提供的第二条链与第三条链也称为报告序列及特定生物的aptamer，分别于不同的荧光分子标记。
在一种可能的实现方式中，所述第一区段与所述第三区段分别与第二条链，第三条链互补
在一种可能的实现方式中，所述的第二条链与所述第三条链分别为ATP aptamer与K+aptamer。
在一种可能的实现方式中，所述荧光基团的激发波长与所述纳米金颗粒的发射波长有部分重叠或全部重叠。
在一种可能的实现方式中，第二条链用罗丹明类荧光染料ROX标记5’端，第三条链用花青素类荧光染料Cy5标记3’端。
当目标分子没有出现时，三嵌段DNA识别序列与报告分子杂交产物组装在纳米金表面，使荧光基团与纳米金表面靠近，此时发生荧光共振能量转移效应，荧光淬灭在纳米金表面。当三嵌段DNA识别序列即目标分子的aptamer与识别并且与相应的目标分子发生反应产生构象变化后，报告序列以及其携带的荧光分子离开纳米金表面。FRET现象减弱直至消失，最终荧光信号恢复。
本发明的第二方面还提供了一种制备前述三嵌段DNA纳米金探针的方法，所述方法包括步骤：
将所述第一条链的第一区段与第三区段分别于所述第二条链与所述第三条链杂交，得到双联探针；
将步骤(1)的到的双链探针和纳米金混合，得到混合液；
将步骤(2)得到的混合液的PH调制酸性，静置第一预设时间后，再调制中性。静置第二预设时间后，离心，去掉上清。获得所述探针。
在一种可能的实现方式中，所述步骤(2)中双链探针与与纳米金混合比例为500-1000.
在一种可能的实现方式中，所述步骤(3)中，所述步骤(2)得到的混合液的PH调至酸性，静置第一预设时间为10-15min，每100ul混合液中加入1.5～2.5ul PH＝3，浓度为500mM的柠檬酸三钠将PH调至酸性，静置5～15min。
在一种可能的实现方式中，所述步骤(3)中，所述调至中性，静置第二预设时间具体为10～20min，每100ul混合液加入16-20ulPH＝7.2 200mM的磷酸缓冲液将PH调至中性。
在一种可能的实现方式中，所述步骤(3)中具体离心条件为11500～12000g，14～17min。
本发明的第三方面公开了一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：先将待测目标分子和前述三嵌段纳米金探针混合，再进行荧光值检测。
在一种可能的实现方式中，所述目标分子为ATP与K+。
本发明第四方面还提供了前述PolyA介导的可调控纳米金探针在制备同时检测两种生物分子的检测试剂盒中的用途。
本发明第五方面，提供了一种试剂盒，包括前述三嵌段DNA-纳米金探针。
与现有技术相比，本发明的有益效果为:
本发明首次开发可以通过一次组装一种DNA探针实现两种目标分子的检测。
本发明采用Poly A来连接纳米金颗粒和识别序列，由于现有技术中识别序列通常使用-SH修饰连接在纳米金表面，解决了存在的识别序列存在非特异性吸附、识别序列与目标序列杂交空间位阻大等问题。
采用本发明三嵌段DNA-纳米金探针技术大大提高了光化学检测生物小分子的灵敏性。
采用本发明三嵌段DNA-纳米金探针技术大大提高了光化学检测生物小分子的特异性。
本发明三嵌段纳米金探针技术，不止针对一种目标分子，可以通过设计所述三条链的序列设计用于不同的生物分子，提高检测效率。
附图说明
图1：本发明实施例提供的三嵌段纳米金探针结构以及检测原理图。
图2：由实施例1组装成功的三嵌段纳米金探针的紫外吸收峰表征图。
图3：该发明三嵌段DNA纳米金探针用于不同浓度梯度的ATP与K+同时检测。
图4该发明三嵌段DNA-纳米金探针用于ATP和K+检测的特异性验证。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例一三嵌段DNA-纳米金探针的组装
材料及设备
试剂：柠檬酸三钠(C6H5Na3O7 2H2O),磷酸盐，NaCl，MgCl2，和KCl等试剂从中国国药集团公司购买。化学试剂都是分析纯，且没有进一步纯化。整个实验所用的水为Milli Q水。MilliQ水：18.2MΩ.cm(Millipore)。核苷酸DNA从上海生工生物公司订购，纯化等级为HPLC级。；透射电子显微镜(TEM)，紫外分光光度计(Hitachi U-3010)，荧光分光光度计(F-900,Edinburg)，PH计，冷冻高速离心机(Hitachi)；二嵌段DNA，报告分子以及靶标分子购于生工生物工程(上海)股份有限公司并使用高效液相色谱纯化。
序列如下表：
制备三嵌段DNA纳米金探针，主要分为以下四步：
(1)SEQ ID.1与SEQ ID.2SEQ ID.2按照1:1.2比例杂交；
(2)将杂交后的双链DNA按照1:500加入纳米金中，混匀孵育10min。
(2)将柠檬酸三钠(PH＝3，500mM)加入至上述溶液中，使其终浓度为10mM，快速涡旋，静置10分钟；
(3)将上述溶液PH调至中性，用200mM PB溶液(PH＝7.6)，使其终浓度为30mM，快速涡旋，静置15分钟；
(4)将上述纳米金溶液12000rpm离心洗涤三次，洗涤溶液为10mM PB(PH＝7.6)。将上述制备好的溶液溶于0.1M PBS杂交液中，并稀释成1nM，以备后续使用。(紫外分光光度计测发射峰在524nm,ε＝2.7×108L mol-1cm-1)。
(5)用紫外吸光光度法测定纳米金以及组装后的纳米金探针吸收峰，比较二者吸收峰位置。
从图2可以看出，组装后纳米金探针的吸收峰红移大约5nm，证明探针成功组装。
实施例二ATP和K+同时检测
(1)对于三嵌段分子信标，包含ROX、Cy5两段荧光探针。
(2)将组装好的三嵌段分子信标与ATP和钾离子进行杂交孵育。条件为37℃，孵育1小时；
(3)各种ATP浓度分别为：0,2,20,200,2000uM；
(4)各种钾离子浓度分别为：0,1,10,100,1000mM；
(5)孵育毕后检测各组荧光强度。每组实验均重复三次。
图3说明，三嵌段DNA-纳米金探针可以同时用于ATP(上)和钾离子(下)检测，且得到的荧光信号强度随着浓度的增加依次增加。说明探针灵敏性优良。
实施例三三嵌段DNA-纳米金探针特异性研究
(1)将终浓度为2uM的ATP,UTP,CTP,GTP分别与组装好的三嵌段(1nM)杂交，杂交条件为室温孵育2小时；
(2)将终浓度为1mM钠离子，镁离子，钾离子分别与组装好的三嵌段(1nM)杂交，杂交条件为室温孵育2小时；
(3)孵育结束后，离心测上清液荧光，使用588nm波长激发ROX，647nm波长激发Cy5。
图4结果说明，三嵌段DNA探针能够有效区分各种相似的生物小分子，说明三嵌段DNA-纳米金探针具有优良的特异性。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纳米金探针，其特征在于，包括纳米金颗粒以及连接在所述纳米金颗粒上的双链探针、所述双链探针包括第一条链，第二条链和第三条链。所述第一条链包括5'-3'依次排列的第一区段，第二区段和第三区段；所述第一区段和所述第二条链部分互补，所述第二区段为多聚腺苷酸区段，用于纳米金表面锚定，所述第三区段和所述第三条链链部分互补。所述第二条链与所述第三条链分别用不同的荧光分子修饰。
2.根据权利要求1所述的三嵌段纳米金探针，其特征在于，所述双链探针通过Poly A连接在所述纳米金颗粒上。
3.根据权利要求2所述的纳米金探针，其特征在于，所述双链探针的第一条链包括5'-3'依次排列的第一区段，第二区段和第三区段，所述Poly A结合在所述纳米金颗粒表面。
4.根据权利要求2或3所述的纳米金探针，其特征在于，所述Poly A的长度为30-50nt。
5.根据权利要求1所述的纳米金探针，其特征在于，所述荧光基团修饰于所述第二条链的5’端和第三条链的3’端。
6.一种权利要求1-5任一项所述的纳米金探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将所述第一条链和所述第二条链，第三条链杂交，得到双链探针；
(2)将步骤(1)得到的所述双链探针和纳米金颗粒混合，得到混合液；
(3)将步骤(2)得到的混合液的pH调至酸性，静置第一预设时间后，再调至中性，静置第二预设时间后，离心，去掉上清，获得所述纳米金探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，第二条链与第三条链与加入的第一条链的比值为1.2～1.5；所述将步骤(2)得到的双链探针和纳米金颗粒混合为，将每500～1000摩尔的双链探针和1摩尔的纳米金颗粒混合；所述步骤(3)中的第一预设时间为5～15min，第二预设时间为15～20min；所述步骤(3)中离心条件为11500～12000rmp，
14～17min。
8.一种非疾病诊断目的的检测目标分子的方法，包括如下步骤：将目标分子和如权利要求1-6任一项所述的纳米金探针混合，再进行荧光值检测。
9.如权利要求1-6任一项所述的纳米金探针在制备生物小分子检测试剂中的应用。
10.一种核酸检测试剂盒，包括如权利要求1-6任一项所述的纳米金探针。
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