CN101358954A - 苦瓜皂甙高效液相色谱指纹图谱的建立 - Google Patents
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Abstract
一种苦瓜皂甙高效液相色谱指纹图谱测定方法，是通过超声－微波协同萃取技术，利用甲醇溶剂提取不同产地的苦瓜，再经水饱和的正丁醇萃取，浓缩冷冻干燥得苦瓜皂甙粗品，对粗品进行高效液相色谱指纹图谱的分析研究，得到苦瓜皂甙的指纹图谱。本发明优点：所得色谱指纹图谱能较全面反映苦瓜皂甙所含成分，能有效体现苦瓜皂甙成分的复杂性，能为不同产地样品间的鉴别提供科学依据；所建立的HPLC指纹图谱具有较大的稳定性和重现性，该研究为苦瓜的质量评价提供了一种手段，有利于进一步制定苦瓜皂甙的质量标准和对苦瓜皂甙产品的质量进行控制。
Description
技术领域
本发明涉及苦瓜皂甙高效液相色谱指纹图谱测定方法，属生物制品和中药制备技术领域。
背景技术
苦瓜皂甙是苦瓜的主要有效成分之一。
对苦瓜及其制品中苦瓜皂甙的检测已有大量报导。石雪萍等人(石雪萍，姚惠源，HPLC-ELSD测定苦瓜皂甙的含量，天然产物研究与开发，2006，18：471～473)采用HPLC-EISD法测定苦瓜中皂甙B的含量。色谱条件：色谱柱Zorbax SB C18，4.6×150mm；检测器ELSD(Evaporative Lisht Scattering Detector)；柱温30℃；流动相：甲醇和水(70∶30，V/V)；流速1.0mL/min，N2压力：2.0×105Pa。皂甙B的保留时间在为7.295min，在浓度为0.1058～5.290μg/μL之间有很好的线性关系(R＝0.9918)。平均加标回收率为100.27％(n＝3)，RSD＝2.83％。李健等人(李健，刘鑫等，高效液相色谱法检测苦瓜啤酒中的苦瓜皂苷，食品科学，2007，28(7)，438～441)建立了高效液相色谱法对苦瓜啤酒中功效成分—苦瓜皂苷检测的方法。以70％乙醇超声辅助提取苦瓜皂苷，大孔树脂纯化，得苦瓜皂苷纯品。以自制的苦瓜皂苷为标准品与苦瓜啤酒中的苦瓜皂苷进行比较，用ODS-3柱，在205nm下，乙腈和水(55∶45，V/V)为流动相，流速1.0ml/min，经反相液相色谱分析，以保留时间定性、峰面积定量。Wang S等人(Wang S；Tang L；et al，Determination ofmomordicoside A in bitter melon by high-performance liquid chromotography after solid-phaseextraction，CHROMATOGRAPHIA，2001，53(7-8)，372～374；Wang S；Tang L；et al，Rapidanalysis of momordicoside A in bitter melon by high performance liquid chromatographyfollowing solid phase extraction，Se Pu，2001，19(2)，128～131)采用HPLC法测定苦瓜中苦瓜皂甙A。
上述方法均检测苦瓜总皂甙中的一种或几种皂甙，未能完全检测苦瓜中的总皂甙，没有能整体反映苦瓜粗提物中的皂甙。
发明内容
为了能表述苦瓜皂甙的整体特征，本发明提供了一种苦瓜皂甙高效液相色谱指纹图谱的建立方法。本发明采用高效液相色谱分析检测的方法，对不同产地的苦瓜进行测定，建立苦瓜皂甙的指纹图谱，为以后对苦瓜的科学研究提供一个快速分析和检测的方法和手段。本发明是通过超声—微波协同萃取技术，利用甲醇溶剂提取不同产地的苦瓜，再经水饱和的正丁醇萃取，浓缩冷冻干燥得苦瓜皂甙粗提品，对粗提品进行高效液相色谱指纹图谱的分析研究，得到苦瓜皂甙的指纹图谱。
本发明的具体操作步骤如下：
a、苦瓜皂甙指纹图谱的研究方法
分别收集武汉、江苏、太原、临汾、大同、上海、唐山、衡水、北京、天津产地的苦瓜10份，所测样品见表1。
表1 苦瓜样品来源
供试品溶液的制备：苦瓜籽晒干，粉碎后过60目筛。准确称取一定量苦瓜干粉，加入1∶15(质量∶体积)的甲醇，60℃下超声处理三次，每次20min，过滤，回收甲醇，浸膏加10倍体积水溶解，用等量的水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浸膏加适量蒸馏水，进行冷冻干燥，得苦瓜皂甙粗品，精密称取一定量苦瓜皂甙的提取物，用1000倍(质量∶体积)甲醇溶解定容，混匀，过0.45μm膜过滤器滤过，滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：准确称取人参皂甙Rg1对照品5mg，加甲醇溶解定容至5mL，摇匀，配成1mg/mL，备用。
建立HPLC指纹图谱的色谱条件：色谱柱：Zorbax SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈和水梯度洗脱；流速：0.5-2.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：209nm；进样量：10-30μL；分析时间：50-80min。梯度洗脱程序见表2。
表2 梯度洗脱程序表
b、方法学考察
为了考虑分析方法的可靠性，对仪器的精密度，方法的重复性和供试品的稳定性进行方法学考察。
空白试验：吸取甲醇空白溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
对照试验：吸取参照物溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
精密度试验：取同一批次供试品溶液，按色谱条件连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间和峰面积比值进行考察。
稳定性试验：取同一份供试品溶液，在室温下放置，按照色谱条件进行，分别在0、4、8、12、24h进样分析，考察共有峰的相对保留时间和峰面积比值。
c、供试品测定：按照色谱条件，测定10批次供试品HPLC色谱图，并对所得图谱数据进行分析，即得苦瓜皂甙高效液相色谱图，见附图。
方法a建立HPLC指纹图谱的色谱条件中，流速最好为1.0mL/min；进样量最好为20μL；分析时间最好为65min。梯度洗脱时间最好依次为0、15、55、65min。
本发明与现有的技术相比具有的优点：(1)本发明苦瓜皂甙高效液相色谱指纹图谱建立的测定方法，所得色谱指纹图谱能较全面反映苦瓜皂甙所含成分，能有效体现苦瓜皂甙成分的复杂性，能为不同产地样品间的鉴别提供科学依据；(2)所建立的HPLC指纹图谱具有较大的稳定性和重现性，该研究为苦瓜的质量评价提供了一种手段，有利于进一步制定苦瓜皂甙的质量标准和对苦瓜皂甙产品的质量进行控制。
附图说明
附图1为10批次苦瓜皂甙指纹图谱的共有模式图。
图2人参皂甙Rg1的色谱图。
具体实施方式
实施例1：
a、苦瓜皂甙指纹图谱的研究方法
分别收集武汉、江苏、太原、临汾、大同、上海、唐山、衡水、北京、天津产地的苦瓜10份，所测样品见表1。
表1苦瓜样品来源
供试品溶液的制备：苦瓜籽晒干，粉碎后过筛。准确称取10g苦瓜干粉，置250mL量瓶中，加入150mL甲醇，60℃下超声处理三次，每次20min，过滤，回收甲醇，浸膏加100mL水溶解，用等量的水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浸膏加适量蒸馏水，进行冷冻干燥，得苦瓜皂甙粗品，精密称取0.025g苦瓜皂甙的提取物，用甲醇溶解，定容至25mL，混匀，过0.45μm膜过滤器滤过，滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：准确称取人参皂甙Rg1对照品5mg，加甲醇溶解定容至5mL，摇匀，配成1mg/mL，备用。
建立HPLC指纹图谱的色谱条件：色谱柱：Zorbax SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈和水梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：209nm；进样量：10μL；分析时间：80min。梯度洗脱程序见表2。
表2梯度洗脱程序表
b、方法学考察
为了考虑分析方法的可靠性，对仪器的精密度，方法的重复性和供试品的稳定性进行方法学考察。
空白试验：吸取甲醇空白溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
对照试验：吸取参照物溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
精密度试验：取同一批次供试品溶液，按色谱条件连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间和峰面积比值进行考察。
稳定性试验：取同一份供试品溶液，在室温下放置，按照色谱条件进行，分别在0、4、8、12、24h进样分析，考察共有峰的相对保留时间和峰面积比值。
c、供试品测定：按照色谱条件，测定10批次供试品HPLC色谱图，并对所得图谱数据进行分析，即得苦瓜皂甙高效液相色谱图。
实施例2：
a、苦瓜皂甙指纹图谱的研究方法
分别收集武汉、江苏、太原、临汾、大同、上海、唐山、衡水、北京、天津产地的苦瓜10份，所测样品见表1。
表1 苦瓜样品来源
供试品溶液的制备：苦瓜籽晒干，粉碎后过筛。准确称取10g苦瓜干粉，置250mL量瓶中，加入150mL甲醇，60℃下超声处理三次，每次20min，过滤，回收甲醇，浸膏加100mL水溶解，用等量的水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浸膏加适量蒸馏水，进行冷冻干燥，得苦瓜皂甙粗品，精密称取0.025g苦瓜皂甙的提取物，用甲醇溶解，定容至25mL，混匀，过0.45μm膜过滤器滤过，滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：准确称取人参皂甙Rg1对照品5mg，加甲醇溶解定容至5mL，摇匀，配成1mg/mL，备用。
建立HPLC指纹图谱的色谱条件：色谱柱：Zorbax SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈和水梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：209nm；进样量：10μL；分析时间：65min。梯度洗脱程序见表2。
表2 梯度洗脱程序表
b、方法学考察
为了考虑分析方法的可靠性，对仪器的精密度，方法的重复性和供试品的稳定性进行方法学考察。
空白试验：吸取甲醇空白溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
对照试验：吸取参照物溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
精密度试验：取同一批次供试品溶液，按色谱条件连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间和峰面积比值进行考察。
稳定性试验：取同一份供试品溶液，在室温下放置，按照色谱条件进行，分别在0、4、8、12、24h进样分析，考察共有峰的相对保留时间和峰面积比值。
c、供试品测定：按照色谱条件，测定10批次供试品HPLC色谱图，并对所得图谱数据进行分析，即得苦瓜皂甙高效液相色谱图。
Claims (3)
1、一种苦瓜皂甙高效液相色谱指纹图谱的建立方法。其特征在于，采用高效液相色谱分析检测的方法，对不同产地的苦瓜进行测定，建立苦瓜皂甙的指纹图谱。具体研究方法为：
a、苦瓜皂甙指纹图谱的研究方法
分别收集武汉、江苏、太原、临汾、大同、上海、唐山、衡水、北京、天津产地的苦瓜10份，所测样品见表1。
表1苦瓜样品来源
供试品溶液的制备：苦瓜籽晒干，粉碎后过60目筛。准确称取一定量苦瓜干粉，加入1∶15(质量∶体积)的甲醇，60℃下超声处理三次，每次20min，过滤，回收甲醇，浸膏加10倍体积水溶解，用等量的水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，回收正丁醇，浸膏加适量蒸馏水，进行冷冻干燥，得苦瓜皂甙粗品，精密称取一定量苦瓜皂甙的提取物，用1000倍(质量∶体积)甲醇溶解定容，混匀，过0.45μm膜过滤器滤过，滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：准确称取人参皂甙Rg1对照品5mg，加甲醇溶解定容至5mL，摇匀，配成1mg/mL，备用。
建立HPLC指纹图谱的色谱条件：色谱柱：Zorbax SB-C18柱(150×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈和水梯度洗脱；流速：0.5-2.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：209nm；进样量：10-30μL；分析时间：50-80min。梯度洗脱程序见表2。
表2梯度洗脱程序表
b、方法学考察
为了考虑分析方法的可靠性，对仪器的精密度，方法的重复性和供试品的稳定性进行方法学考察。
空白试验：吸取甲醇空白溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
对照试验：吸取参照物溶液20μL，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
精密度试验：取同一批次供试品溶液，按色谱条件连续进样5次，分别对共有峰的相对保留时间和峰面积比值进行考察。
稳定性试验：取同一份供试品溶液，在室温下放置，按照色谱条件进行，分别在0、4、8、12、24h进样分析，考察共有峰的相对保留时间和峰面积比值。
c、供试品测定：按照色谱条件，测定10批次供试品HPLC色谱图，并对所得图谱数据进行分析，即得苦瓜皂甙高效液相色谱图。
2、根据权利要求1所述的步骤a建立HPLC指纹图谱的色谱条件，其特征在于流速为1.0mL/min；进样量为20μL；分析时间为65min。
3、根据权利要求1所述的步骤a建立HPLC指纹图谱的色谱条件，其特征在于梯度洗脱时间依次为0、15、55、65min。
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|---|---|---|---|---|
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| CN106174696A (zh) * | 2016-08-17 | 2016-12-07 | 福建中烟工业有限责任公司 | 制备苦瓜提取物的方法、苦瓜提取物及其用途 |
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2008
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