KR20150075047A - 여주 유래 프로토카테큐산을 활성성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 신경세포 보호효과, 항노화 효과 및 인지능력 향상 활성을 갖는 여주 유래의 인지기능 개선용 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 건강기능식품이 제공된다.
또한 본 발명에서는 여주로부터 신경세포 보호효과, 항노화 효과 및 인지능력 향상 활성을 갖는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법이 제공된다.

Description

여주 유래 프로토카테큐산을 활성성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물 {Composition for ameliorating cognitive functions comprising protocatechuic acid derived from Momordica charantia}

본 발명은 인지기능 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 여주 유래 프로토카테큐산 (protocatechuic acid)을 활성성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

'인지'란 인간이 살아가면서 뇌를 이용해 생각하고, 말하고, 기억하고, 판단하고 실행하는 모든 과정을 말한다. 따라서 '인지기능'은 주의력, 지각력, 기억력, 언어능력, 집행능력 등을 포함한다.

'인지기능 저하'은 뇌의 노화 현상 중 가장 두드러진 현상으로, 학습과 기억 능력의 저하, 판단력의 저하로 특징 지워지는 생리적 현상이다. 특히, 이러한 인지기능의 저하는 '치매'라는 질환으로 진단하고 있다.

노인성 치매는 주로 알츠하이머 치매가 대부분을 차지하며, 알츠하이머 치매는 흔히 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)으로 불리며 아무런 치료 노력이 없으면 서서히 죽게 되는 질병이라고 할 수 있다. 이 질병은 1906년 독일의 신경병리학자인 Alois Alzheimer에 의해 알려졌다.

우리나라는 1960년에는 전체 인구 2,500만명 중 노인 인구가 72만 명으로 2.9%에 불과했지만 본격적인 고령화 사회가 되어 2026년 이후에는 65세 이상 고령인구가 전체 인구에 20%까지 증가할 것으로 예측되고 있다. 노인성 치매 환자의 수도 이에 비례하여 급격히 증가하는데 65세 이상의 연령대에서는 10%, 85세 이상의 경우에는 40 ~ 50% 정도가 노인성 치매에 시달리게 될 것으로 전문가들은 예측하고 있다.

한국특허 10-1429209호에는 노루궁뎅이 버섯, 노랑느타리 버섯 및 세송이 버섯에서 선택되는 버섯 2종 이상의 물 추출물을 유효성분으로 하는 인지기능 개선용 조성물에 대해 개시되어 있고, 한국특허 10-1345653호에는 산두근(Sophora subprostrata) 추출물 및 유칼리툽스 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물이 개시되어 있는 정도에 불과하며, 여전히 천연물로부터 인지기능 개선 활성이 있는 물질의 발굴이 요구되어 오고 있다.

여주는 박과의 덩굴식물로 영어명은 비터 멜론(bitter melon)이다. 정식 학명은 모모르디카 카란티아(Momordica charantia)이다. 원산지는 확실하게 알려져 있지 않으나 인도를 비롯한 열대 아시아 지역인 것으로 추정되고 있다. 세계적으로도 잘 알려진 장수지역인 일본의 오키나와에서도 예로부터 많이 먹고 있는 식품의 하나가 여주이며, 특히 오키나와 방언으로 고야라고 부르고 있다. 최근 구미 등 경제 선진국들에서 인기 높은 건강 농산물로 인정받으면서 국내에서도 재배와 관심이 차츰 증가하고 있다.

여주는 6 ~ 8월에 열매를 맺는 여름 야채로 한여름의 햇볕을 듬뿍 받고 자라며, 열매 맺은 것을 덜 익은 채로 수확한다. 녹색이 짙고 혹 같은 돌기가 총총하게 많을수록 쓴맛이 강하고 유효성분도 많이 들어 있다. 여주의 주요 성분으로는 열매에 포함되어 있으며 분자량 약 93.7 kDa 정도의 펩타이드성물질인 카란틴(charantin)을 들 수 있다. 이는 인슐린 분비에 결정적 역할을 하는 베타 세포를 활성화시키고 그 자체에 다수 함유된 인슐린과 같은 효능의 물질이 궁극적으로 혈당 조절에 기여하는 것으로 알려져 있다. 특히 여주에는 비타민 C가 100 그램 중 120 밀리그램이나 들어 있는데, 이는 딸기 (80 mg/100 g), 레몬 (90 mg/100 g), 양배추 (40 mg/100 g)보다 월등히 많은 양이다. 특히 다른 과실의 비타민 C와 달리 여주에 함유된 비타민 C의 경우는 열에 안정해서 열을 가해도 다른 과실보다는 비타민 C의 파괴가 잘 되지 않는다. 또한, 여주는 체내에서 비타민 A로 전환되는 베타 카로틴 및 철, 칼륨 등의 미네랄도 함유하고 있다. 한편 여주는 다양한 페놀산 및 플라보노이드 화합물을 함유하고 있어 혈당개선 이외에도 항바이러스, 면역증강, 항염증, 항비만 및 항암 활성을 지니고 있다.

여주로부터는 항당뇨 및 항비만 효과가 있는 카라틴(charantin)과 트리터펜 계열(triterpenes) 화합물이 추출된 바가 보고되어 있으나, 여주로부터 유래되는 인지기능 개선 효과가 있는 활성물질은 보고된 바는 없다.

종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 여주로부터 신경세포 보호효과, 항노화 효과 및 인지능력 향상 활성을 갖는 활성물질을 추출 및 분획하고 이 활성물질이 프로토카테큐산 (protocatechuic acid)임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 신경세포 보호효과, 항노화 효과 및 인지능력 향상 활성을 갖는 여주 유래의 인지기능 개선용 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 여주로부터 신경세포 보호효과, 항노화 효과 및 인지능력 향상 활성을 갖는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 여주 유래의 프로토카테큐산을 활성성분으로 포함하는 인지기능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 여주 유래의 프로토카테큐산은 프로토카테큐산을 함유하는 여주 추출물 또는 분획물, 또는 이들로부터 정제된 프로토카테큐산을 모두 포함하는 개념이다.

여주 추출물은 다양한 추출법을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 등의 유기 극성용매를 이용하여 추출할 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올을 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

여주 분획물은 상기 여주 추출물을 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 디클로로메탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매와 물을 이용하여 분획하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 유기용매로 디클로로메탄과 에틸아세테이트를 이용하여 분획할 수 있으며, 가장 바람직하게는 유기용매로 디클로로메탄으로 이용하여 분획할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는 본 발명의 인지기능 개선용 조성물의 활성성분인 여주 유래의 프로토카테큐산은 여주 분말을 메탄올로 추출한 후, 이 추출물을 헥산과 물을 이용하여 분획하고 물 분획물을 다시 디클로로메탄과 물로 분획하여 디클로로메탄 분획물에서 얻을 수 있다. 프로토카테큐산의 분리, 정제는 통상의 정제방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 정제 순환 고압액체크로마토그래피(Prep-recycling High Press Liquid Chromatograph, R-HPLC)를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 인지기능 개선용 조성물은 신경세포 보호효과, 항노화 효과, 뇌조직의 산화적 스트레스 완화 및 인지능력 향상 활성을 가져서 (시험예 1 ~ 5 참조) 인지기능 개선 효과를 나타내며, 기억력 상실, 기억력의 손상, 치매, 건망증, 허혈성 뇌질환, 알츠하이머병 등의 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 또는 기억력 개선제로써 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 인지기능 개선용 조성물은 약제학적 분야에서 공지의 방법의 의해 약제학적 조성물로 제제화될 수 있고, 상세하게는 그 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 약제학적으로 통상으로 허용되는 제제, 예를들면 액제, 시럽제, 캡슐제 등으로 제제화될 수 있으며, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 0.01~500mg/kg, 바람직하게는 0.1~200mg/kg으로 투여량으로, 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 인지기능 개선용 조성물은 건강기능식품으로 사용될 수 있으며, 건강기능식품은 정제, 캅셀제, 분말제, 과립제, 액상제, 환제 등의 형태로 제조 가공한 건강식품 또는 음료, 요구르트, 연질캡슐, 양갱 등의 기능성 식품을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은

ⅰ) 여주 분말을 제공하는 단계;

ⅱ) 여주 분말의 5 ~ 10 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 유기용매로 추출하는 단계;

ⅲ) 유기용매 추출물을 물에 현탁한 후 헥산으로 분획하고, 결과의 물 분획물을 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 및

ⅳ) 결과의 분획물로부터 프로토카테큐산을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 인지기능 개선 조성물의 제조방법을 제공한다.

필요에 따라서, 본 발명의 인지기능 개선 조성물의 제조방법은, 단계 ⅳ) 후에, 프로토카테큐산을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

단계 ⅰ) 여주 분말

여주 분말은 건조된 여주를 분쇄기로 분쇄하여, 약 80 메쉬 체로 걸러 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

건조된 여주는, 제한되지는 않지만, 미성숙 여주를 수확하여 흐르는 수돗물에 3회 세척하여 물기를 제거하고 여주를 직경 방향으로 4 ~ 6mm 두께로 절단 후, 45 ~ 55℃로 유지된 열풍건조기에 넣고 2 ~ 3일 건조하여 제조할 수도 있고, 자연 건조할 수도 있다.

단계 ⅱ) 유기용매 추출

여주 분말의 5 ~ 10 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 유기용매로 추출한다.

추출은 통상의 방식에 따라 행할 수 있으며, 바람직하게는 추출은 3시간 동안 5회 혹은 40℃에서 4시간 동안 2회 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단계 ⅲ) 분획

분획은 통상의 방식에 따라 단계 ⅱ)의 유기용매 추출물을 유기용매의 극성에 따라 물에 현탁한 후 헥산으로 분획하고, 결과의 물 분획물을 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 얻는다.

단계 ⅳ) 프로토카테큐산 분리

단계 ⅲ)으로부터의 분획물에서 프로토카테큐산을 분리한다.

분리는 통상의 방식으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 정제 순환 고압액체크로마토그래피(Prep-recycling High Press Liquid Chromatograph, R-HPLC)를 이용하여 분리정제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다

필요에 따라서, 단계 ⅲ) 및 ⅳ)를 대체하여, 단계 ⅱ)로부터의 유기용매 추출물을 역상 크로마토그래피법을 이용하여 극성별 유기용매 조성물을 순차적으로 통과하여 분획물을 제조하여 박층크로마토그래피(TLC)로 확인하여 이로부터 프로토카테큐산을 분리한다.

단계 ⅴ) 추가 정제

단계 ⅳ) 후에, 프로토카테큐산을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법의 일례가 도 1에 도시되어 있으며, 본 발명에 따라 제조된 여주 유래의 프로토카테큐산의 구조식은 도 2의 B에 나타내었다.

본 발명에 따라 제조된 여주 유래 프로토카테큐산을 함유하는 조성물은 신경세포 보호효과, 항노화 효과, 뇌조직의 산화적 스트레스 완화 및 인지능력 향상 활성을 가져서 (시험예 1~5 참조) 우수한 인지기능 개선 조성물이다.

본 발명에 따른 여주 유래의 프로토카테큐산을 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물은 신경세포 보호효과, 항노화 효과, 뇌조직의 산화적 스트레스 완화 및 인지능력 향상 효과가 탁월하다.

따라서 본 발명에 따른 인지기능 개선 조성물은 기억력 상실, 기억력의 손상, 치매, 건망증, 허혈성 뇌질환, 알츠하이머병 등의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 인지기능 개선 조성물은 기억력 상실, 기억력의 손상, 치매, 건망증, 허혈성 뇌질환, 알츠하이머병 등의 질환의 개선용 건강기능성 식품으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산을 함유하는 인지기능 개선 조성물의 제조하는 공정의 일례이다.
도 2의 A는 여주 추출물과 분획물에 프로토카테큐산을 존재 여부를 확인하기 위한 TLC 결과를 나타내는 사진이며 도 2의 B는 디클로로메탄 분획물에서 분리 및 정제된 프로토카테큐산의 화학구조식이다.
도 3은 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 C6 신경교 세포에서 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 도 3a는 신경세포 생존율을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 신경세포내 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 C6 신경교 세포에서 A_25-35 에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 도 4a는 신경세포 생존율을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 신경세포내 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 전치리 또는 후처리에 의한 WI-38 세포에서 항노화 효과를 나타낸 그래프이다. 도 5a는 전처리 시의 세포생존율을 나타낸 그래프이며, 도 5b는 후처리 시의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 물체인지 실험을 통한 기억능력 손상 치료 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 T-maze 시험을 통한 공간 인지능력 향상 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8는 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 Morris water maze 시험을 통한 공간 기억능력 향상 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9은 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 Morris water maze 시험을 통한 공간단서 기억능력 향상 효과 및 도피대를 찾아가는 것이 공간 인지능력에 의한 것임을 나타낸 그래프이다. 도 9a는 공간단서 기억능력 향상을 나타낸 그래프이고, 도 9b는 마우스가 도피대를 찾아가는 능력이 운동능력 또는 시각능력 아닌 공간인지 기억능력에 의한 것임을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 뇌 조직에서의 NO 소거 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11는 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 뇌 조직에서의 지질과산화 생성 역제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테큐산의 간 독성 여부를 시험한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 12a는 ALT 측정치를 나타낸 그래프이고, 도 12b는 AST 측정치를 나타낸 그래프이다.

다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.

실 시 예

제조예: 여주 유래의 인지기능 개선능을 갖는 활성물질 제조

스트레인서 추출기에 여주 분말 (함양영농조합법인) 1 kg과 메탄올 7 리터를 첨가하여 3시간 추출하는 과정을 5회 반복하고 감압하에 농축하고 여과하여 메탄올 추출물 305.5 g을 얻었으며, 이 메탄올 추출물을 정제수에 현탁한 후 분핵깔대기를 이용하여 1차적으로 헥센 분획물과 물 분획물로 분획하고, 2차적으로 물 분획물은 다시 디클로로메탄 분획물과 물 분획물로 분획하고, 3차적으로 물 분획물은 다시 에칠아세테이트 분획물과 물 분획물로 분획하고, 최종적으로 물 분획물은 다시 부탄올 분획물과 물 분획물로 분획하였다 (도 1).

메탄올 추출물 (Me), 헥산 분획물 (Hx), 디클오로메탄 분획물 (Mc), 에칠아세테이트 분획물 (EA), 부탄올 분획물 (Bu) 각각을 박층크로마토그래피 (Tin Layer Chromatograph, TLC) 분석으로 프로토카테큐산의 존재 유무를 확인하였으며, 그 결과 디클오로메탄 분획물 (Mc), 에칠아세테이트 분획물 (EA) 및 부탄올 분획물 (Bu)에서 프로토카테큐산이 확인되었으며, 디클오로메탄 분획물 (Mc) 및 에칠아세테이트 분획물 (EA)에서 함량이 높았다 (도 2의 A).

디클오로메탄 분획물 (Mc)을 정제 순환 고압액체크로마토그래피를 이용하여 프로토카테큐산을 분리정제하였고, 핵자기공명기를 이용하여 프로토카테큐산임을 확인하였다 (도 2의 B).

시험예: 여주 유래 프로토카테큐산의 인지기능 개선효과 시험

상기 제조예에서 분리정제된 여주 유래의 프로토카테규산을 5, 10, 50 ㎍/mL 농도로 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 용매에 녹여 시료로 준비하여 인지기능 개선효과 시험에 사용하였다.

시험예 1: 신경세포 보호 효과

여주 유래의 프로토카테규산의 신경세포 보호효과 시험은 C6 신경교(glial) 세포에 과산화수소(H₂O₂) 또는 A_25-35 처리에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과 시험으로 검정하였다.

C6 신경교 세포를 100 units/ml의 페니실린과 스트렙토마이신 및 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 세포는 1~2일에 한번씩 재섭식(refeeding)시키고 세포분화가 최대에 도달하면 PBS(인산염 완충 염수)로 세척한 후 트립신-EDTA 용액 (0.05% 트립신과 0.02% EDTA 함유)으로 부착된 세포를 분리한 후 원심분리하여 집전시킨 후 세포를 골고루 분산되도록 혼합하여 계대 배양하며 사용하였다.

<과산화수소에 의한 산화적 스트레스 유발>

C6 신경교 세포가 전면생장(confluent) 상태가 되었을때 96 웰 플레이트에 5 x 10⁴ 세포/ml로 접종(seeding)하여 세포를 부착시킨 후 산화적 스트레스를 유발하기 위해 H₂O₂ (100 μM)을 처리하여 24시간 배양한다. 그리고 나서 준비해둔 본 발명의 따른 조성물의 농도별 시료 (5, 10, 50 μg/mL)를 각각 처리한 시험군과 처리하지 않은 대조군에 5 mg/ml MTT (Sigma) 용액을 각 웰에 주입하여 37℃에서 4시간 재배양한 후 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(Sigma)에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아울러 산화적 스트레스를 유발하지 않은 C6 신경교 세포 정상군에 대해서도 동일한 방식으로 흡광도를 측정하여, 정상군 대비 세포생존률을 산출하였고, 그 결과를 도 3a에 나타냈다.

도 3a에 도시된 바와 같이, 정상군의 세포생존율 100%에 대비하여 과산화수소를 처리한 대조군은 65.50%로 신경세포가 산화적 스트레스를 받은 것을 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산을 농도별로 처리한 시험군은 모두 대조군보다 높은 세포생존율을 보였으며 10 μg/mL의 농도에서도 80%이상의 세포생존율을 나타내었다. 따라서 여주 유래 프로토카테규산은 산화적 스트레스로 인해 유도된 신경세포를 사멸로부터 보호하는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

신경세포내 활성산소종(ROS) 억제효과를 알아보기 위해 C6 신경교 세포를 이용하여 DCF-DA 분석 (Byun et al., 2009)을 수행하였다. 구체적으로는 C6 신경교 세포가 전면생장(confluent) 상태가 되었을때 96 웰 플레이트에 5 x 10⁴ 세포/웰로 접종하여 2시간 동안 37℃에서 배양한 후 세포가 잘 부착되면 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 H₂O₂를 (100 μM)를 처리하여 24시간 배양하였다. 이와 같이 산화적 스트레스가 유발된 후, 준비해둔 본 발명의 따른 조성물의 농도별 시료 (5, 10, 50 μg/mL)를 각각 처리한 시험군과 처리하지 않은 대조군을 24시간 배양한 후, 80 μM의 DCFH-DA 용액을 각 웰에 주입하여 37℃에서 30분 동안 재배양한 후 형광리더기에서 여기 파장(ex) 480 nm, 방출 파장(em)-535 nm에서 형광강도를 측정하였고, 아울러 산화적 스트레스를 유발하지 않은 C6 신경교 세포 정상군에 대해서도 동일한 방식으로 형광강도를 측정하여, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b로부터, 대조군의 경우 정상군에 비해 ROS 생성량이 많았음을 알 수 있고, 이에 비하여 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산을 농도별로 처리한 시험군은 모두 대조군에 비하여 ROS 생성량이 감소된 경향을 보였으며, 특히 50 ㎍/mL 농도에서는 정상군에 대등한 ROS 소거율을 보였다. 따라서 여주 유래 프로토카테규산은 산화적 스트레스로 인해 유도된 신경세포를 ROS로부터 보호하는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

<A_25-35 에 의한 산화적 스트레스 유발>

과산화수소 대신에 A_25-35 (Amyloid (25-35) Peptide) 25 μM를 사용하여 C6 신경교 세포에 산화적 스트레스를 유발하는 것을 제외하고는 상기와 동일하게 시험하여 신경세포 생존율과 ROS 생성량을 측정하여 그 결과를 도 4a와 도 4b에 나타냈다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 대조군은 정상군에 대비 거의 50% 감소한 세포생존율(50.13%)을 보였으나, 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산을 농도별로 처리한 시험군은 모두 대조군보다 높은 세포생존율을 보였다.

도 4b에 나타낸 바와 같이, 정상군에 비하여 대조군의 ROS 생성량은 많았으나, 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산을 농도별로 처리한 시험군은 농도의존적으로 우수한 ROS 감소 효과를 나타냈다. 특히 10 μg/mL 농도에서는 정상군에 대등한 ROS 생성량을 보였고, 50 μg/mL 농도에서는 정상군 보다 우수한 ROS 생성 억제 효과를 나타내었다.

따라서 여주 유래 프로토카테규산은 산화적 스트레스로 인해 유도된 신경세포를 사멸 및 ROS 생성으로부터 보호하는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

시험예 2: WI-38 세포 모델에서 항노화 효과

본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산의 WI-38 세포에 전처리 및 후처리한 후, 산화적 스트레스가 유발된 WI-38 세포의 세포생존율을 측정하여 항노화(노화 예방) 효과를 분석하였다.

WI-38 세포 (ATCC (Solon Ohio, USA))을 100 units/mL 페니실린 및 스트렙토마이신과 10% FBS가 함유된 BME(Basal medium eagle) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 세포는 1-2일에 한번 재섭식(refeeding)하며 플라스크가 전면생장(confluent) 상태가 되었을때 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신과 0.02% EDTA 혼합액으로 부착된 세포를 분리하여 원심분리하여 집적된 세포를 피펫으로 세포가 골고루 분산되도록 혼합하여 4-5일마다 계대 배양하면서 사용하였다.

WI-38 세포가 전면생장(confluent) 상태가 되었을때 96 웰 플레이트에 1 x 10⁶ 세포/mL로 접종하여 2시간 배양하였다.

그리고 나서 전처리의 경우는, 준비해둔 본 발명의 따른 조성물의 농도별 시료 (5, 10, 50 μg/mL)를 각각 처리하여 24시간 배양 후 산화적 스트레스에 의한 세포 노화를 유도하기 위해 H₂O₂ (300 μM)를 1시간 처리하였고, 후처리의 경우는 H₂O₂(50 μM)를 1시간 처리하여 노화를 유도한 후 본 발명의 따른 조성물의 농도별 시료 (5, 10, 50 μg/mL)를 각각 24시간 처리하였다. 이들 각각의 웰에 5 mg/mL의 MTT 용액(Sigma)을 주입하여 37℃에서 4시간 재배양한 후 생성된 포르마잔을 DMSO(Sigma)에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아울러 산화적 스트레스를 유발하지 않은 WI-38 세포 정상군에 대해서도 동일한 방식으로 흡광도를 측정하여, 정상군 대비 세포생존률을 산출하였고, 그 결과를 각각 도 5a (전처리) 및 도 5b (후처리)에 나타냈다.

도 5a에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우는 세포생존율이 55.02%로 정상군에 비해 45%정도 감소되어 세포 노화가 유도되었으나, 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산을 농도별로 처리한 시험군은 모두 대조군에 비해 세포생존율이 향상되었으며, 5 μg/mL의 낮은 농도에서도 70%이상의 세포생존율을 보였고 특히 10 μg/mL의 농도에서는 78.38%의 세포생존율을 나타내었다. 따라서 본 발명의 조성물의 전처리는 산화적 스트레스로부터 세포의 노화를 방지하는 효과 (항노화 효과)를 가짐을 알 수 있다.

또한 도 5b에 나타낸 바와 같이, WI-38 세포에 먼저 과산화수소를 처리하여 세포의 조기 노화(premature senescence)를 유도한 후 본 발명의 시료를 후처리한 경우에서는, 대조군은 노화가 진행됨에 따라 세포가 사멸하여 32.40%의 세포생존율을 보였으며, 이에 비하여 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산을 농도별로 처리한 시험군은 농도의존적으로 세포생존율이 증가하였으며 50 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 1.5배의 세포생존율을 나타내었다.

따라서 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스를 받은 세포의 노화를 진행을 방지하는 효과 (항노화 효과)를 가짐을 알 수 있다.

시험예 3: 인비보 (in vivo) 인지능력 개선 효과

마우스 모델을 사용하여 본 발명의 조성물의 인비보 인지능력 개선 효과를 검정하였다.

마우스는 5주령의 ICR mouse (25 g ~ 30 g, 수컷, 계통: CrljOri:CDI, 오리엔트(주))를 사용하였고, 물과 식이는 자유롭게 공급하였다. 사육실은 12시간 간격으로 낮-밤 사이클을 유지하였으며, 온도 20±2℃, 습도 50±10%의 환경에서 사육하였다. 사료로는 퓨리나(한국, 조단백질 21.1%, 조지방 3.5%, 조섬유 5.0%, 조회분 8.0%, 칼슘 0.6%, 인 0.6%)의 고형사료를 공급하였으며 음용수로 정수한 물을 공급하였다.

마우스는 정상군 (Normal), 대조군 즉, A_25-35 처리군 (Control), 시험군 즉, Aβ_25-35 처리 후 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)으로 나누어 실험하였다.

기억 손상 유발(Aβ_25-35 처리)은 마우스를 에테르로 마취시킨 후 Laursen과 Belknap 방법에 따라 Aβ_25-35를 주입하여 수행하였다. 구체적으로는 Aβ_25-35를 생리식염수에 5 nM의 농도로 용해시킨 후 37 ℃에서 72 시간 배양 후, 26-게이지 바늘이 달려있는 10 μl 해밀턴 마이크로리터 주사기를 사용하여 각 마우스의 정수리 [bregma (두계골 계측점)에서 caudal (꼬리쪽) 방향으로 0.5 mm, midline (정준선)에서 오른쪽으로 1.0 mm]에 2.2 mm 깊이로 준비된 Aβ_25-35를 5 μl를 약 30 초 동안 천천히 주입하였다. 정상군의 마우스는 동일한 시술과정으로 Aβ_25-35를 주입하는 대신 같은 양의 생리식염수를 주입하였다.

정상군과 대조군에는 음용수를 (100 μl/일), 시험군은 음용수에 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 및 200 mg/kg를 각각 녹인 후 100 μl/일의 양을 존대와 주사기를 이용하여 14일간 일정한 시간에 경구 투여하였다.

마우스의 체중은 3일 간격으로 동일한 시간에 측정하였다. 장기적출은 마우스를 에테르로 마취시켜 즉시 개복 후 관류시켜 장기의 혈액을 제거한 후 간과 뇌를 적출하여 생리식염수로 씻은 다음 여과지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다. 적출한 장기는 장기보관용 팩에 담아 밀봉하여 -80℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

<물체인지 시험 - 기억능력 손상 치료 효과>

물체인지 시험은 내부에서 외부가 보이지 않도록 제작된 박스 (40 x 40 x 40 cm)에서 실시되었다. 두 개의 모양과 크기가 같은 물체 (A1, A2)를 상자 안에 고정시킨 후, 각 군의 마우스를 상자의 중심에서 출발시키고 10분간 마우스가 두 물체를 만지는 횟수를 기록했다. 24시간이 지난 다음 두 개의 물체 중 하나를 새로운 물체로 바꾼 후, 기존 물체와 새로운 물체를 만지는 횟수를 기록하여 수치화 하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, Aβ_25-35 주입으로 인해 뇌 손상이 유발된 대조군은 기존의 물체와 새로운 물체를 만지는 비율이 각각 50.55%, 49.45%로 새로운 물체에 대한 인지도 차이를 보이지 않았다. 반면 정상군은 새로운 물체를 만지는 비율이 70.49%이며 시험군인 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)은 각각 63.32%, 59.55%로 새로운 물체에 대한 호기심으로 접촉빈도가 높은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산은 기억능력 손상에 대한 치료 효과가 있다는 것을 확인할 수 있다.

<T-maze 시험 - 공간 인지능력 향상 효과>

T-maze 시험은 Montagomery의 방법에 따라 수행하였다. 외부가 보이지 않도록 검정색 아크릴로 제작된 T-maze는 T자 모양으로 출발상자, 왼쪽 팔, 오른쪽 팔로 (폭 12 cm, 높이 20 cm, 출발부 76 cm, 오른팔왼팔 각 각 31.5 cm) 구성하여 오른쪽 팔 통로부분은 분리가 가능한 차단문을 설치하였다. 훈련 기간에는 오른쪽 팔을 차단문으로 막고 각 군의 마우스를 출발점에 놓아 출발시켜 10분 동안 왼쪽으로 들어가는 횟수를 기록했다. 24시간 후 오른쪽의 차단문을 제거한 후, 각 군의 마우스를 같은 지점에서 출발시켜 왼쪽 팔과 오른쪽 팔로 들어가는 횟수를 기록하여 새로운 길에 대한 호기심을 비율로 나타내었고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군은 53.99%이였으나 대조군은 48.61%로 새로운 길에 대한 호기심 비율이 낮았다. 반면에 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)은 각각 56.59%와 56.23%로 정상군을 능가하는 수치를 보여, 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산은 공간학습 기억능력에 대한 보호(향상) 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<Morris water maze 시험 - 공간 기억능력 향상 효과>

Morris water maze 시험을 통한 공간기억 능력 향상 효과를 알아보았다. Morris water maze 시험은 동물의 공간학습과 그에 대한 기억을 검사하기 위하여 하는 실험으로, 훈련을 통해 사분면에 있는 공간단서를 기억하고 도피대를 찾아가는 실험이다.

구체적으로는 지름이 150 cm, 높이 30 cm의 수조를 4분면으로 나누고 한 분면에 지름 8 cm의 도피대를 수면 1cm 아래에 위치시켰다. 물의 온도는 22 ± 1℃로 유지시키고 물에 흰색물감 (Poster color, ShinHan)를 타서 각 군의 마우스가 수영할 때 직접 도피대를 보고 찾아갈 수 없도록 하였다. 각각의 분면에는 각 군의 마우스가 공간 단서 (visual clue)를 이용하여 도피대를 찾아가도록 서로 다른 표식을 붙였다. 실험은 2단계로 실행하였다. 첫 번째 단계에서는 도피대를 찾아가는 학습단계로 3일간 관찰하였고, 두 번째 단계에서는 4일째 되는 날 기억검사를 실시하였다. 실험은 각 군의 마우스를 수조벽에 따라 수조에 넣는 것으로 시작되었고, 수조에 넣을 때 출발점은 각 사분면의 중앙 벽으로, 출발된 사분면은 정해진 순서 없이 무작위로 선택하고 실험기간동안 도피대의 위치는 변경하지 않았다. 각 군의 마우스는 하루 3번 (4시간 간격으로 12시간 이내에 실시), 3일 동안 훈련하는데 한 사분면에서 출발시켜 60초 안에 도피대를 찾아가는 시간을 기록하였다. 60초가 경과하도록 도피대를 찾지 못하면 실험자가 마우스를 도피대로 유도한 후 15초 동안 도피대 위에서 공간단서를 인지시켜 도피대가 있는 위치를 인식시키고 60초 이내에 도피대를 찾을 경우 반응에 대한 보상으로 15초 동안 도피대 위에서 쉬게 하였다.

4일째 되는 날 3가지 실험을 실시하였다. 첫 번째는 흰색물감을 타서 도피대를 보이지 않게 한 후 공간단서를 이용하여 60초 이내에 도피대에 도달하는 시간의 변화를 기록하였고, 두 번째는 도피대를 치운 후 60초 동안 도피대가 있던 사분면에 머무는 빈도(%)를 측정하였고, 세 번째는 흰색물감을 타지 않은 수조에서 숨겨진 도피대와 노출된 도피대 도피대를 60초 이내에 찾아가는 시간을 측정하였으며, 그 결과를 각각 도 8, 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.

도 8은 각 군의 마우스들이 도피대에 도달하는 시간의 변화를 나타낸 것으로, Aβ_25-35투여로 인한 기억손상을 유도한 대조군은 훈련기간이 길어져도 도피대에 도달하는 시간의 감소폭이 가장 적었다. 반면 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)은 정상군과 비슷한 감소폭을 보였다. 따라서 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산은 공간인지 능력 향상에 큰 효과가 있는 것을 알 수 있다.

도 9a는 도피대를 치우고 도피대가 있던 사분면에 마우스들이 60초 이상 머문 빈도(%)를 나타낸 것으로, 대조군은 머문 빈도가 11.64%인 반면에, 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)은 각각 20.83%와 20.22%로 도피대가 있던 4분면에 머문 빈도가 많이 증가함을 나타냈다. 따라서 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산은 마우스의 사분면에 있던 공간단서를 기억하는 능력을 향상시켰다는 것을 확인할 수 있다.

도 9b는 도피대를 찾아가는 것이 운동능력에 의한 것인지, 시각능력으로 의한 것인지, 또는 공간기억능력에 의한 것인지를 알아보기 위해 숨겨진 도피대와 노출된 도피대로 실시한 시험 결과를 나타낸 것이다. 도 9b에 나타난 바에 의하면, 숨겨진 도피대로 실시한 경우, 대조군 보다 시험군인 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)의 마우스가 도피대를 찾아가는 시간이 감소하여 공간기억 능력이 향상되었음을 알 수 있다. 노출된 도피대를 실시한 경우, 정상군, 대조군, 시험군의 마우스 모두 도피대를 찾아가는 시간에 유의한 차이가 없는 것으로 보아 사분면의 공간단서를 기억하여 도피대를 찾아가는 것이 아닌 노출된 도피대를 시각적으로 인지하여 찾아간 것이므로 기억능력에 의한 것이 아님을 알 수 있다. 결국 공간단서를 기억하여 숨겨진 도피대를 찾아가는 것은 운동능력이나 시간능력이 아닌 공간인지능력인 것임을 확인할 수 있다.

시험예 4: 뇌 조직에서 NO 소거 효과

뇌 조직에서 Aβ_25-35를 주입함에 따라 유발된 NO 생성을 억제하는 효과를 시험하였다.

NO 생성 억제 측정은 Schmidt 등의 방법에 따라 조직의 NO 함량을 측정하는 것으로, 구체적으로는 균질화시킨 뇌조직을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액 150 μl와 증류수 130 μl를 혼합한 후에 1% 술파닐산(sulfanilic acid)을 함유한 5% 인산과 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아미드디하이드로클로라이드 용액을 사용 식전에 1:1 (v/v)로 혼합하여 만든 그리스 시약(griess reagent)를 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 농도로 환산하였다. 표준곡선은 NaNO₂를 농도별로 조제하여 사용하였다. 그 결과를 도 10에 나타냈다.

도 10에 나타낸 바에 의하면, NO 생성량이 대조군 뇌 조직에서는 17.78 μmol/L/mg단백질인 반면에, 정상군의 뇌 조직에서는 12.89 μmol/L/mg단백질을 나타내어, Aβ_25-35 주입으로 인해 NO 생성량이 증가했음을 알 수 있다. 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)의 뇌 조직에서는 각각 14.07, 13.16 μmol/L/mg단백질로 대조군에 비해 NO 생성량이 현저히 감소함을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 뇌 조직에서 NO 생성을 억제하는 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.

시험예 5: 뇌 조직에서의 지질과산화 생성 억제 효과

뇌 조직의 지질과산화 생성 억제 측정은 Ohkawa 등의 방법을 이용하여 MDA (Malondialdehyde) 함량을 측정하여 수행하였다.

각 군의 마우스의 뇌 조직을 호모게나이저를 이용하여 생리식염수로 균질화시킨 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리시켜 얻은 조직 상층액과 1% 인산과 0.67% 티오바르비투르산(thiobarbituric acid; TBA)를 혼합하여 95℃에서 45분간 반응시킨 후 냉각하여 1-부탄올을 2ml 첨가하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤에 상층액을 535nm, 520nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA를 농도별로 제조하여 얻은 표준 곡선을 이용하여 지질과산화 정도를 산출하여, 그 결과를 도 11에 나타냈다.

도 11에 의하면, MDA의 농도가 정상군의 뇌 조직에서는 25.60 nmol/mg 단백질이었으나, 대조군은 40.95 nmol/mg단백질로 Aβ_25-35 주입으로 인해 지질과산화가 더 많이 생성됨을 확인할 수 있다. 이에 비하여 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)의 뇌 조직에서는 각각 31.99, 26.65 nnmol/mg단백질로 지질과산화 억제 효과가 나타났고, 특히 P200군은 정상군에 필적하는 지질과산화 억제 효과를 나타냈다. 따라서 본 발명의 조성물은 뇌 조직에서 지질과산화 생성 억제효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.

시험예 6: 간 독성 시험

ALT (Alanine aminotransferase)와 AST (Aspartate aminotransferase)는 간 손상의 지표로써 간 조직이 손상을 받으면 혈중 효소로 유출이 증가하게 되어 혈청내 활성이 증가하게 된다. 따라서 인비보에서의 AST와 ALT에 의한 간독성 판정은 정상군의 AST 및 ALT 활성을 기준으로 하여 유의적으로 증가하였을 때 간 독성이 있다고 판단할 수 있다.

혈청내 ALT와 AST 활성은 Retiman-Frankel의 방법에 따라 조제된 시약 키트 (아산제약)를 사용하여 측정하였다. ALT와 AST 기질액 1ml를 37 ℃에서 5분간 반응시킨 후 각 군의 마우스의 혈청 0.2 ml를 첨가하여 혼합하였다. 혼합액에 ALT 측정용액은 37 ℃에서 30분, AST 측정용액은 동일한 온도에서 60분 동안 반응시켰다. 정색시액 1 ml를 첨가한 후 20분간 방치하고 0.4N NaOH용액 10 ml를 넣어 실온에서 10분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. ALT와 AST 기준액을 농도별로 위의 방법과 동일하게 반응시켜 표준곡선을 계산하였고, 그 결과를 각각 도 12a와 12b에 나타냈다.

도 12a와 12b에 나타난 바에 의하면, 본 발명에 따른 여주 유래 프로토카테규산 100 mg/kg 투여군(P100)과 200 mg/kg 투여군(P200)의 ALT와 AST 수치가 대조군에 비하여 낮고, 정상군의 수치에 필적하였던바, 본 발명의 조성물은 간독성이 없는 것을 확인할 수 있다.

Claims (9)

1. 여주 유래의 프로토카테큐산을 활성성분으로 포함하는 인지기능 개선용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 여주 유래의 프로토카테큐산은 프로토카테큐산을 함유하는 여주의 유기용매 추출물 또는 분획물인 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 여주 유래의 프로토카테큐산은 여주 유기용매 추출물 또는 분획물에서 정제된 프로토카테큐산인 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용 조성물.
   
4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 따른 인지기능 개선 조성물을 포함하여 이루어지는 치매 또는 알츠하이머병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
   
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 인지기능 개선 조성물을 포함하여 이루어지는 건강기능식품.
   
6. 제 5항에 있어서, 건강기능식품은 기억력 개선 또는 건망증 개선용인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
   
7. 제 5항에 있어서, 정제, 캅셀제, 분말제, 과립제, 액상제 및 환제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 가공된 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
   
8. ⅰ) 여주 분말을 제공하는 단계;
   ⅱ) 여주 분말의 5 ~ 10 부피배의 메탄올, 에탄올, 글로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 유기용매로 추출하는 단계;
   ⅲ) 유기용매 추출물을 물에 현탁한 후 헥산으로 분획하고, 결과의 물 분획물을 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 및
   ⅳ) 결과의 분획물로부터 프로토카테큐산을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 인지기능 개선 조성물의 제조방법.
   
9. 제 8항에 있어서, 단계 ⅳ)에서 분리는 정제 순환 고압액체크로마토그래피로 수행되는 것을 특징으로 하는 인지기능 개선 조성물의 제조방법.

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