KR20160136855A - 법제 하수오 추출물을 함유하는 인지기능 개선용 조성물 - Google Patents
법제 하수오 추출물을 함유하는 인지기능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 법제 하수오(Polygoni Multiflori Radix) 추출물을 함유하는 인지기능 개선용 조성물 및 그 제조방법이 제공되며, 더 상세하게는 법제 하수오 유래 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 활성성분으로 함유하는 인지기능 개선용 건강기능성 식품 조성물이 제공된다.
Description
본 발명은 법제 하수오(Polygoni Multiflori Radix) 추출물을 함유하는 인지기능 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 활성성분으로 함유하는 인지기능 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
'인지'란 인간이 살아가면서 뇌를 이용해 생각하고, 말하고, 기억하고, 판단하고 실행하는 모든 과정을 말한다. 따라서 '인지기능'은 주의력, 지각력, 기억력, 언어능력, 집행능력 등을 포함한다.
'인지기능 저하'은 뇌의 노화 현상 중 가장 두드러진 현상으로, 학습과 기억 능력의 저하, 판단력의 저하로 특징 지워지는 생리적 현상이다. 특히, 이러한 인지기능의 저하는 '치매'라는 질환으로 진단하고 있다.
노인성 치매는 주로 알츠하이머 치매가 대부분을 차지하며, 알츠하이머 치매는 흔히 알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD)으로 불리며 아무런 치료 노력이 없으면 서서히 죽게 되는 질병이라고 할 수 있다. 이 질병은 1906년 독일의 신경병리학자인 Alois Alzheimer에 의해 알려졌다.
우리나라는 1960년에는 전체 인구 2,500만명 중 노인 인구가 72만명으로 2.9%에 불과했지만 본격적인 고령화 사회가 되어 2026년 이후에는 65세 이상 고령인구가 전체 인구에 20%까지 증가할 것으로 예측되고 있다. 노인성 치매 환자의 수도 이에 비례하여 급격히 증가하는데 65세 이상의 연령대에서는 10%, 85세 이상의 경우에는 40 ~ 50% 정도가 노인성 치매에 시달리게 될 것으로 전문가들은 예측하고 있다.
한국특허 10-1429209호에는 노루궁뎅이 버섯, 노랑느타리 버섯 및 새송이 버섯에서 선택되는 버섯 2종 이상의 물 추출물을 유효성분으로 하는 인지기능 개선용 조성물에 대해 개시되어 있고, 한국특허 10-1345653호에는 산두근(Sophora subprostrata) 추출물 및 유칼리툽스 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물이 개시되어 있는 정도에 불과하며, 여전히 천연물로부터 인지기능 개선 활성이 있는 물질의 발굴이 요구되어 오고 있다.
하수오는 다년생 덩굴성 초본으로 길이 5 ~ 10 cm, 지름 3 ~ 10 cm의 여뀌과(Polygonaceae)의 방추형 덩이뿌리로서, 간, 신을 보익하고 혈을 자양하며 풍을 제거하는 효능이 있다고 알려져 있으며 장기 복용 시 혈압강화의 방지효과를 나타내어 예로부터 민간요법에 많이 이용되어 왔다. 또한 하수오는 면역증강, 혈중 지질 강화에 의한 항노화 작용, 모발의 색소 침착을 유도하고 모발의 성장 효과 등이 보고된 바 있다 (등록특허 10-1424175호).
하수오의 생리적 활성은 하수오 중에 함유된 안트라퀴논 화합물, 식물성 스테롤, 각종 배당체화합물에서 유래할 것으로 추측되어 왔다. 또한 하수오의 장기 섭취 시 간 손상 등의 부작용이 있어 통상 법제 과정을 거쳐서 섭취되고 있다. 그러나 법제 과정에 의하여 상기 활성성분의 변화로 인하여 법제 하수오의 효능도 많은 변화가 있다고만 알려져 있을 뿐, 이에 대한 연구는 드문 실정이다.
특히 법제 하수오로부터 유래되는 기능성 활성성분 특히 인지기능 개선 효능을 갖는 활성성분에 대해서는 보고된 바는 없다.
종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 법제 하수오의 추출물의 신경세포 보호효과 및 인지능력 향상 활성을 확인하고 또한 활성성분이 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 신경세포 보호효과 및 인지능력 향상 활성을 갖는 법제 하수오 유래의 인지기능 개선용 조성물 및 이를 포함하는 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 법제 하수오로부터 신경세포 보호효과 및 인지능력 향상 활성을 갖는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 활성성분으로 포함하는 인지기능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀은 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 함유하는 추출물 또는 분획물, 또는 이들로부터 정제된 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 모두 포함하는 개념이다.
법제 하수오 추출물은 다양한 추출법을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 메탄올 및 이소프로판올 등의 유기 극성용매를 이용하여 추출할 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올을 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
법제 하수오 분획물은 상기 법제 하수오 추출물을 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥센(hexane), 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 디클로로메탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기용매와 물을 이용하여 분획하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 유기용매로 헥센, 클로로포롬 및 메탄올을 이용하여 분획할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는 본 발명의 인지기능 개선용 조성물의 활성성분인 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀은 법제 하수오 분말을 메탄올로 추출한 후, 이 추출물을 헥센, 클로로포롬 및 메탄올로 분획하고, 이 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 헥센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획물을 얻는다. 활성성분인 4 종의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 분리, 정제는 통상의 정제방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 정제 순환고압액체크로마토그래피(Prep-recycling High Press Liquid Chromatograph, RHPLC), 역상크로마토그래피, 실리카 겔 프래시 CC 크로마토그래피 또는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 핵자기공명기 등의 분광학적 기기분석법를 이용하여 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 구조를 하기와 같이 동정하였다 (제조예 2 참조):
본 발명의 법제 하수오 추출물/분획물은 신경세포 보호효과, 뇌조직의 산화적 스트레스 완화 및 인지능력 향상 활성을 가져서 (시험예 1 ~ 4 참조) 인지기능 개선 효과를 나타내며, 기억력 상실, 기억력의 손상, 치매, 건망증, 허혈성 뇌질환, 알츠하이머병 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물 및 기억력 개선용 건강기능식품 조성물로써 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 인지기능 개선용 조성물은 건강식품 분야에서 공지의 방법의 의해 건강기능식품 조성물로 제제화될 수 있고, 법제 하수오 추출물 분말 자체 또는 건강기능식품으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 건강식품으로 통상으로 허용되는 제제, 예를 들면 환, 과립, 타블렛, 액상음료, 시럽, 연질캡슐 등으로 제제화될 수 있으며, 건강기능식품으로 섭취할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은
ⅰ) 법제 하수오 분말을 제공하는 단계;
ⅱ) 법제 하수오 분말에 20 ~ 30 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매로 추출하는 단계;
ⅲ) 유기용매 추출물을 물에 현탁한 후 헥센, 클로로포롬 및 메탄올으로 분획하고, 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 헥센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획물을 얻는 단계; 및
ⅳ) 결과의 분획물로부터 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
필요에 따라서, 본 발명의 인지기능 개선 조성물의 제조방법은, 단계 ⅳ) 후에, 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단계 ⅰ): 법제
하수오
분말 제공
법제 하수오 분말은 건조된 법제 하수오를 분쇄기로 분쇄하여, 약 80 메쉬 체로 걸러 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
하수오의 법제화는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는 하수오를 95 ~ 100℃에서 30 ~ 60 분간 증자한 후 자연 건조하거나 45 ~ 55℃로 유지된 열풍건조기에 넣고 2 ~ 3일 건조하여 법제 하수오를 제조할 수도 있고, 또는 건조 하수오를 생막걸리에 하루 정도 침지시킨 후 이를 다시 건조하고 다시 검정콩물에 하루 정도 침지시킨 후 건조하여 법제 하수오를 제조할 수도 있다.
하수오는 3년 이상된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 3년 이하의 경우 생리활성물질 함량이 적고 수확량(무게)가 적은 단점이 있으며, 하수오 뿌리 부분을 사용하는 것이 좋다.
단계 ⅱ): 유기용매 추출
법제 하수오 분말에 20 ~ 30 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매로 추출한다.
추출은 통상의 방식에 따라 행할 수 있으며, 바람직하게는 추출은 12시간 동안 3회 혹은 50℃에서 5시간 동안 2회 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 ⅲ): 분획
분획은 통상의 방식에 따라 단계 ⅱ)의 유기용매 추출물을 유기용매의 극성에 따라 물에 현탁한 후 헥센, 클로로포롬 및 메탄올로 분획하고, 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 헥센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획물을 얻는다.
이온크로마토그래피법 컬럼을 이용하여 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는다.
단계 ⅳ): 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀 분리
단계 ⅲ)으로부터의 분획물에서 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리한다.
분리는 통상의 방식으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 정제 순환고압액체크로마토그래피(Prep-recycling High Press Liquid Chromatograph, RHPLC), 역상크로마토그래피, 실리카 겔 프래시 CC 크로마토그래피 또는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라서, 단계 ⅲ) 및 ⅳ)를 대체하여, 단계 ⅱ)로부터의 유기용매 추출물을 역상 크로마토그래피법을 이용하여 극성별 유기용매 조성물을 순차적으로 통과하여 분획물을 제조하여 고압액체크로마토그래(HPLC)로 확인하여 이로부터 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리할 수 있다.
단계 ⅴ): 추가 정제
단계 ⅳ) 후에, 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
정제는 통상의 방법으로 행할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법의 일례가 도 1에 도시되어 있으며, 본 발명에 따라 제조되고 동정된 법제 하수오 유래의 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 구조식은 도 3에 나타내었다.
본 발명에 따라 제조된 법제 하수오 유래 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 함유하는 조성물은 신경세포 보호효과, 뇌조직의 산화적 스트레스 완화 및 인지능력 향상 활성을 가져서 (시험예 1 ~ 4 참조) 우수한 인지기능 개선용 조성물이다.
본 발명에 따른 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O--D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선용 조성물은 신경세포 보호효과, 항노화 효과, 뇌조직의 산화적 스트레스 완화 및 인지능력 향상 효과가 탁월하다.
또한 본 발명에 따른 인지기능 개선 조성물은 기억력 상실, 기억력의 손상, 치매, 건망증, 허혈성 뇌질환, 알츠하이머병 등의 질환의 증상 개선용 건강기능성 식품으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 법제 하수오 유래 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 함유하는 인지기능 개선용 조성물의 제조하는 공정의 일례이다.
도 2는 3년산 법제 하수오 추출물의 HPLC 크로마토그램이다. 일련 번호 1에서 4는 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드 (1), 레인 (2), 에모딘 (3) 및 크리소파놀 (4) 이다.
도 3은 법제 하수오 추출물 및 분획물에서 분리 및 정제되어 구조가 동정된 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 화학구조식이다.
도 4는 본 발명에 따른 4종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 C6 신경교 세포에서 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 도 4a는 신경세포 생존율을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 신경세포내 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물의 C6 신경교 세포에서 Aβ25-35에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 도 5a는 신경세포 생존율을 나타낸 그래프이며, 도 5b는 신경세포내 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물의 물체인지 실험을 통한 기억능력 손상 치료 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물의 T-maze 시험을 통한 공간 인지능력 향상 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 조성물의 Morris water maze 시험을 통한 공간 기억능력 향상 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 조성물의 Morris water maze 시험을 통한 공간단서 기억능력 향상 효과 및 도피대를 찾아가는 것이 공간 인지능력에 의한 것임을 나타낸 그래프이다. 도 9a는 공간단서 기억능력 향상을 나타낸 그래프이고, 도 9b는 마우스가 도피대를 찾아가는 능력이 운동능력 또는 시각능력 아닌 공간인지 기억능력에 의한 것임을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 조성물의 뇌 조직에서의 NO 소거효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 조성물의 뇌 조직에서의 지질과산화 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 3년산 법제 하수오 추출물의 HPLC 크로마토그램이다. 일련 번호 1에서 4는 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드 (1), 레인 (2), 에모딘 (3) 및 크리소파놀 (4) 이다.
도 3은 법제 하수오 추출물 및 분획물에서 분리 및 정제되어 구조가 동정된 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 화학구조식이다.
도 4는 본 발명에 따른 4종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 C6 신경교 세포에서 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 도 4a는 신경세포 생존율을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 신경세포내 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물의 C6 신경교 세포에서 Aβ25-35에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 도 5a는 신경세포 생존율을 나타낸 그래프이며, 도 5b는 신경세포내 활성산소종(ROS) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물의 물체인지 실험을 통한 기억능력 손상 치료 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물의 T-maze 시험을 통한 공간 인지능력 향상 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 조성물의 Morris water maze 시험을 통한 공간 기억능력 향상 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 조성물의 Morris water maze 시험을 통한 공간단서 기억능력 향상 효과 및 도피대를 찾아가는 것이 공간 인지능력에 의한 것임을 나타낸 그래프이다. 도 9a는 공간단서 기억능력 향상을 나타낸 그래프이고, 도 9b는 마우스가 도피대를 찾아가는 능력이 운동능력 또는 시각능력 아닌 공간인지 기억능력에 의한 것임을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 조성물의 뇌 조직에서의 NO 소거효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 조성물의 뇌 조직에서의 지질과산화 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
실 시 예
제조예 1: 법제 하수오 추출물 제조
스트레인서 추출기에 3년산 법제 하수오 건조 분말 (지리산하수오 영농조합법인) 10 kg과 메탄올 20 L를 첨가하여 320 rpm에서 12시간 추출하는 과정을 3회 반복하고 0.45 μm 여과 필터로 여과하여 모은 후 여과액을 감압농축기(EYELA, Tokyo, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 50 ℃에서 감압 농축하여 법제 하수오 추출물 380 g을 얻었다.
제조예 2: 법제 하수오 유래의 활성물질 제조 및 구조 동정
제조예 1에서 제조된 법제 하수오 추출물 건조물 100 g을 정제수에 현탁한 후, 분핵깔대기를 이용하여 헥센 분획물, 클로로포롬 분획물 및 메탄올 분획물로 분획한 후, 메탄올 분획물을 다시 분획물 A(메탄올), B(클로로포롬), C(핵센), D(부탄올), E(아세토니트릴)로 순차적으로 분획한 후, 다시 분획물 A1(물 : 메탄올 = 100 : 0) ~ A9(물 : 메탄올 = 0 : 100), B1(메탄올 : 클로로포롬 = 100 : 0) ~ B7(메탄올 : 클로로포롬 = 0 : 100), C1(메탄올 : 헥센 = 100 : 0) ~ C7(메탄올 : 헥센 = 0 : 100), D1(메탄올 : 부탄올 = 100 : 0) ~ D5(메탄올 : 부탄올 = 0 : 100), E1(물 : 아세토니트릴 = 100 : 0) ~ E4(물 : 아세토니트릴 = 0 : 100)로 농도구배 분획을 하였다 (도 1).
A1 ~ E4 분획물을 정제 순환 고압액체크로마토그래피를 이용하여 2,3,5,4' -테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리하여 정제하였다: 분석 칼럼은 Lichrophore 100 RP C18 column(4.6×250 mm, 5 μm, Merck & Co., Kenilworth, NJ, USA)을 사용하였고, 이동상 용매는 1.0% glacial 아세트산(solution A)와 100% 아세토니트릴(solution B)로 분석하였고, 이동상 조건은 solvent B 기준으로 각각 20, 10, 10 및 10분 동안 10%, 20%, 25% 및 35%로 유지시켰다. 분획물 시료는 20 μL를 주입하였고 이동상의 속도는 30℃에서 1 mL/min로 유지하였고 생리활성물질은 diode array UV detector(Agilent 1200 series, Agilent Co.)의 흡광도 280 nm에서 정량하였다.
HPLC 분석 결과, 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드 (화합물 1), 레인 (화합물 2), 에모딘 (화합물 3) 및 크리소파놀 (화합물 4)이 확인되었으며 (도 2), 정량된 각각의 성분의 함량을 환산하여 표 1에 나타냈다.
| 활성물질 | 함량 (mg/kg) |
| 2,3,5,4' -테트라하이드록시스틸벤 2-0-β-D-글루코사이드 (화합물 1) | 11.02±3.6 |
| 레인 (화합물 2) | 0.03±0.00 |
| 에모딘 (화합물 3) | 2.08±0.02 |
| 크리소파놀 (화합물 4) | 0.51±0.01 |
또한 핵자기공명기의 분광학적 기기분석법를 이용하여 2,3,5,4-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 구조식을 동정하였으며 그 결과를 도 3에 나타냈다.
시험예: 법제 하수오 유래 조성물의 인지기능 개선효과 시험
상기 제조예 1에서 제조된 본 발명에 따른 4종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물을 농축하여 분말을 제조하고 메탄올에 각각 10, 25 및 50 μg/mL 농도와 100 μg/mL(H100) 및 200 μg/mL(H200) 농도로 용해시켜 하기 시험예들의 법제 하수오 유래 조성물 시료로 사용하였다.
시험예 1: 법제 하수오 유래 조성물의 신경세포 보호 효과
법제 하수오 유래 조성물의 신경세포 보호효과 시험은 C6 신경교(glial) 세포에 과산화수소(H2O2) 또는 Aβ25-35 처리에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과 시험으로 검정하였다.
C6 신경교 세포를 100 units/ml의 페니실린과 스트렙토마이신 및 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃ , 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
배양된 세포는 1~2일에 한번씩 재섭식(refeeding)시키고 세포분화가 최대에 도달하면 PBS(인산염 완충 염수)로 세척한 후 트립신-EDTA 용액 (0.05% 트립신과 0.02% EDTA 함유)으로 부착된 세포를 분리한 후 원심분리하여 집전시킨 후 세포를 골고루 분산되도록 혼합하여 계대 배양하며 사용하였다.
<과산화수소에 의한 산화적 스트레스 유발>
C6 신경교 세포가 전면생장(confluent) 상태가 되었을때 96 웰 플레이트에 5 x 104 세포/ml로 접종(seeding)하여 세포를 부착시킨 후 산화적 스트레스를 유발하기 위해 H2O2 (100 μM)을 처리하여 24시간 배양한다. 그리고 나서 상기에서 준비해둔 본 발명의 따른 법제 하수오 유래 조성물의 농도별 시료 (10, 25, 50 μg/mL)를 각각 처리한 시험군과 처리하지 않은 대조군에 5 mg/ml MTT (Sigma) 용액을 각 웰에 주입하여 37℃에서 4시간 재배양한 후 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(Sigma)에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아울러 산화적 스트레스를 유발하지 않은 C6 신경교 세포 정상군에 대해서도 동일한 방식으로 흡광도를 측정하여, 정상군 대비 세포생존률을 산출하였고, 그 결과를 도 4a에 나타냈다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 세포 생존율은 정상군 100% 대비 H2O2를 처리한 대조군 (control)에서는 42.81% 생존율을 나타내어 신경세포가 손상을 받은 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 따른 법제 하수오 유래 조성물의 농도별 시료 (10, 25, 50 μg/mL)를 각각 처리한 시험군에서는 각각 51.06, 51.35, 55.69% 세포 생존율을 보여 인체 내에서 발생하는 활성산소종의 생성을 억제/제거함으로써 신경세포 보호효과를 나타내었음을 알 수 있다.
한편 신경세포내 활성산소종(ROS) 억제효과를 알아보기 위해 C6 신경교 세포를 이용하여 DCF-DA 분석 (Byun et al., 2009)을 수행하였다.
구체적으로는 C6 신경교 세포가 전면생장(confluent) 상태가 되었을때 96 웰 플레이트에 5 x 104 세포/웰로 접종하여 2시간 동안 37℃에서 배양한 후 세포가 잘 부착되면 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 H2O2를 (100 μM)를 처리하여 24시간 배양하였다. 이와 같이 산화적 스트레스가 유발된 후, 상기에서 준비해둔 본 발명의 따른 법제 하수오 유래 조성물의 농도별 시료 (10, 25, 50 μg/mL)를 각각 처리한 시험군과 처리하지 않은 대조군을 24시간 배양한 후, 80 μM의 DCFH-DA 용액을 각 웰에 주입하여 37℃에서 30분 동안 재배양한 후 형광리더기에서 여기 파장(ex) 480 nm, 방출 파장(em)-535 nm에서 형광강도를 측정하였고, 아울러 산화적 스트레스를 유발하지 않은 C6 신경교 세포 정상군에 대해서도 동일한 방식으로 형광강도를 측정하여, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.
도 4b (왼쪽 그래프)로부터, 60분 동안 ROS 생성량을 측정한 결과 과산화수소를 처리한 군에서 시간이 지남에 따라 산화적 스트레스가 증가함을 알 수 있었고, 시험군에서는 활성산소종의 생성이 대조군에 비해 억제됨을 알 수 있다. 도 4b (오른쪽 그래프)로부터, 60분을 기준으로 대조군을 100%로 하였을 때 정상군 (normal)은 94.24%를 보였으며, 시험군의 각각은 대조군 (control) 보다 낮은 생성률을 보였다. 따라서 본 발명의 조성물은 H2O2 로 인한 독성보호에 효과가 있는 것으로 사료된다.
<Aβ25-35 에 의한 산화적 스트레스 유발>
과산화수소 대신에 Aβ25-35 (Amyloid (25-35) Peptide) 25 μM를 사용하여 C6 신경교 세포에 산화적 스트레스를 유발하는 것을 제외하고는 상기와 동일하게 시험하여 신경세포 생존율과 ROS 생성량을 측정하여 그 결과를 도 5a와 도 5b에 나타냈다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 세포 생존율은 정상군(normal) 100%로 하여, 본 발명의 따른 법제 하수오 유래 조성물의 농도별 시료 (10, 25, 50 μg/mL)를 각각 처리한 시험군과 처리하지 않은 대조군 (control)을 비교할 때, 대조군에서 56.07%의 생존율을 나타내어 신경세포 손상을 받는 것을 확인할 수 있었으나, 시험군에서는 각각 81.72, 93.67, 90.72%로 대조군 보다 훨씬 높은 세포 생존율을 나타내었다.
도 5b (왼쪽 그래프)로부터, 60분 동안 ROS 생성량을 측정한 결과 과산화수소를 처리한 군에서 시간이 지남에 따라 산화적 스트레스가 증가함을 알 수 있고, 시험군에서는 활성산소종의 생성이 대조군에 비해 억제됨을 알 수 있다. 도 5b (오른쪽 그래프)로부터, 60분을 기준으로 대조군을 100%로 하였을 때 정상군 (normal)은 91.68%를 보였으며, 시험군의 각각은 대조군 (control) 보다 낮은 생성률을 보였다. 따라서 본 발명의 조성물은 Aβ25-35 로 인한 독성보호에 효과가 있는 것으로 사료된다.
따라서 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀 함유 법제 하수오 추출물은 산화적 스트레스로 인해 유도된 신경세포를 사멸 및 ROS 생성으로부터 보호하는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
시험예 2: 법제 하수오 유래 조성물의 인비보 (
in vivo
) 인지능력 개선 효과
마우스 모델을 사용하여 본 발명의 조성물의 인비보 인지능력 개선효과를 검정하였다.
마우스는 5주령의 ICR mouse (25 g ~ 30 g, 수컷, 계통:CrljOri:CDI, 오리엔트(주))를 사용하였고, 물과 식이는 자유롭게 공급하였다. 사육실은 12시간 간격으로 낮-밤 사이클을 유지하였으며, 온도 20±2℃, 습도 50±10%의 환경에서 사육하였다. 사료로는 퓨리나(한국, 조단백질 21.1%, 조지방 3.5%, 조섬유 5.0%, 조회분 8.0%, 칼슘 0.6%, 인 0.6%)의 고형사료를 공급하였으며 음용수로 정수한 물을 공급하였다.
마우스는 정상군 (Normal), 대조군 (Aβ25-35 처리군; Control), 시험군 (Aβ25-35 처리 후 본 발명에 따른 법제 하수오 유래 조성물 시료 (100, 200 μg/mL 농도) 투여군(H100)과 투여군(H200))으로 나누어 실험하였다.
기억 손상 유발(Aβ25-35 처리)은 마우스를 에테르로 마취시킨 후 Laursen과 Belknap 방법에 따라 Aβ25-35를 주입하여 수행하였다. 구체적으로는 Aβ25-35를 생리식염수에 5 nM의 농도로 용해시킨 후 37℃ 에서 72 시간 배양 후, 26-게이지 바늘이 달려있는 10 μl 해밀턴 마이크로리터 주사기를 사용하여 각 마우스의 정수리 [bregma (두계골 계측점)에서 caudal (꼬리쪽) 방향으로 0.5 mm, midline(정준선)에서 오른쪽으로 1.0 mm]에 2.2 mm 깊이로 준비된 Aβ25-35 를 5 μl를 약 30초 동안 천천히 주입하였다. 정상군의 마우스는 동일한 시술과정으로 Aβ25-35 를 주입하는 대신 같은 양의 생리식염수를 주입하였다.
정상군과 대조군에는 음용수를 (100 μl/일), 시험군은 음용수에 본 발명에 따른 법제 하수오 유래 조성물 시료 (100, 200 μg/mL)를 각각 녹인 후 100 μl/일의 양을 존대와 주사기를 이용하여 14일간 일정한 시간에 경구 투여하였다.
마우스의 체중은 3일 간격으로 동일한 시간에 측정하였다.
장기적출은 마우스를 에테르로 마취시켜 즉시 개복 후 관류시켜 장기의 혈액을 제거한 후 간과 뇌를 적출하여 생리식염수로 씻은 다음 여과지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다. 적출한 장기는 장기보관용 팩에 담아 밀봉하여 -80℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
<물체인지 시험 - 기억능력 손상 치료 효과>
물체인지 시험은 내부에서 외부가 보이지 않도록 제작된 박스 (40 x 40 x 40 cm)에서 실시되었다. 두 개의 모양과 크기가 같은 물체 (A1, A2)를 상자안에 고정시킨 후, 각 군의 마우스를 상자의 중심에서 출발시키고 10분간 마우스가 두 물체를 만지는 횟수를 기록했다. 24시간이 지난 다음 두 개의 물체 중 하나를 새로운 물체로 바꾼 후, 기존 물체와 새로운 물체를 만지는 횟수를 기록하여 수치화 하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Aβ25-35를 주입한 대조군의 경우 기존의 물체와 새로운 물체를 인지하는 비율이 각각 41.9%와 58.1%로 기존의 물체와 새로운 물체를 인지하는 비율의 차가 16.2%로 정상군에서의 차이 (26.4%)보다 더 낮은 것을 확인할 수 있다. 이는 대조군의 마우스는 Aβ25-35에 의한 기억 손상으로 인해 새로운 물체임을 인지하지 못한 것으로 보여진다. 반면에 시험군 (H100군과 H200군)의 마우스는 새로운 물체를 인지하는 비율이 각각 66.3%, 69.5%로 새로운 물체에 대한 호기심으로 인해 접촉 빈도가 높아진 것을 확인할 수 있다.
<T-maze 시험 - 공간 인지능력 향상 효과>
T-maze 시험은 Montagomery의 방법에 따라 수행하였다. 외부가 보이지 않도록 검정색 아크릴로 제작된 T-maze는 T자 모양으로 출발상자, 왼쪽 팔, 오른쪽 팔로 (폭 12 cm, 높이 20 cm, 출발부 76 cm, 오른팔왼팔 각 각 31.5 cm) 구성하여 오른쪽 팔 통로부분은 분리가 가능한 차단문을 설치하였다. 훈련 기간에는 오른쪽 팔을 차단문으로 막고 각 군의 마우스를 출발점에 놓아 출발시켜 10분 동안 왼쪽으로 들어가는 횟수를 기록했다. 24시간 후 오른쪽의 차단문을 제거한 후, 각군의 마우스를 같은 지점에서 출발시켜 왼쪽 팔과 오른쪽 팔로 들어가는 횟수를 기록하여 새로운 길에 대한 호기심을 비율로 나타내었고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군은 기존의 길에 대한 접근도가 40.0%, 새로운 길에 대한 접근도가 60.1%로 나타났고, 대조군은 기존의 길에 대한 접근도가 53.4%, 새로운 길에 대한 접근도가 46.6%로 정상군에 비해 두 가지 길에 대한 접근도에 차이가 크지 않을 뿐만 아니라 오히려 기존의 길에 대한 접근도가 더 높게 나타나 공간기억능력의 손상으로 인해 새로운 길을 인지하지 못하는 것으로 여겨진다. 반면에 시험군 (H100군과 H200군) 마우스의 경우 새로운 길에 대한 접근도가 각각 57.1%와 59.0%로 정상군과 유사한 높은 공간인지능력을 나타냄을 확인할 수 있었다.
<Morris water maze 시험 - 공간 기억능력 향상 효과>
Morris water maze 시험을 통한 공간기억 능력 향상 효과를 알아보았다. Morris water maze 시험은 동물의 공간학습과 그에 대한 기억을 검사하기 위하여 하는 실험으로, 훈련을 통해 사분면에 있는 공간단서를 기억하고 도피대를 찾아가는 실험이다.
구체적으로는 지름이 150 cm, 높이 30 cm의 수조를 4분면으로 나누고 한 분면에 지름 8 cm의 도피대를 수면 1cm 아래에 위치시켰다. 물의 온도는 22 ± 1℃로 유지시키고 물에 흰색물감 (Poster color, ShinHan)를 타서 각 군의 마우스가 수영할 때 직접 도피대를 보고 찾아갈 수 없도록 하였다. 각각의 분면에는 각군의 마우스가 공간 단서 (visual clue)를 이용하여 도피대를 찾아가도록 서로 다른 표식을 붙였다. 실험은 2단계로 실행하였다. 첫 번째 단계에서는 도피대를 찾아가는 학습단계로 3일간 관찰하였고, 두 번째 단계에서는 4일째 되는 날 기억검사를 실시하였다. 실험은 각 군의 마우스를 수조벽에 따라 수조에 넣는 것으로 시작되었고, 수조에 넣을 때 출발점은 각 사분면의 중앙 벽으로, 출발된 사분면은 정해진 순서 없이 무작위로 선택하고 실험기간동안 도피대의 위치는 변경하지 않았다. 각 군의 마우스는 하루 3번 (4시간 간격으로 12시간 이내에 실시), 3일 동안 훈련하는데 한 사분면에서 출발시켜 60초 안에 도피대를 찾아가는 시간을 기록하였다. 60초가 경과하도록 도피대를 찾지 못하면 실험자가 마우스를 도피대로 유도한 후 15초 동안 도피대 위에서 공간단서를 인지시켜 도피대가 있는 위치를 인식시키고 60초 이내에 도피대를 찾을 경우 반응에 대한 보상으로 15초 동안 도피대 위에서 쉬게 하였다.
4일째 되는 날 3가지 실험을 실시하였다. 첫 번째는 흰색물감을 타서 도피대를 보이지 않게 한 후 공간단서를 이용하여 60초 이내에 도피대에 도달하는 시간의 변화를 기록하였고, 두 번째는 도피대를 치운 후 60초 동안 도피대가 있던 사분면에 머무는 빈도(%)를 측정하였고, 세 번째는 흰색물감을 타지 않은 수조에서 숨겨진 도피대와 노출된 도피대 도피대를 60초 이내에 찾아가는 시간을 측정하였으며, 그 결과를 각각 도 8, 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.
도 8은 각 군의 마우스들이 도피대에 도달하는 시간의 변화를 나타낸 것으로, Aβ25-35 투여로 인한 기억손상을 유도한 대조군은 훈련 기간이 길어짐에 따라 도피대에 도달하는 시간이 줄어든 것을 확인할 수 있었지만, 대조군은 도피대에 도달하는 시간이 다른 실험군에 비해 가장 길었다. 반면 시험군 (H100과 H200군)에서는 마지막 날의 실험에서 도피대 도달 시간이 정상군보다 오히려 더 빨라진 것을 관찰할 수 있었으며, 특히 H200군은 도달 시간이 가장 짧아 공간인지 능력 향상에 큰 효과가 있는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 조성물의 투여가 Aβ25-35에 의한 인지능력 손상에 대한 보호 작용을 일으켜 마우스가 도피대의 위치를 인지하고 찾아가는 시간이 줄어들고, 결국 마우스의 공간인지 능력 손상에 대한 보호 효과를 나타낸 것임을 보여준다.
도 9a는 도피대를 치우고 도피대가 있던 사분면에 마우스들이 60초 이상 머문 빈도(%)를 나타낸 것으로, 정상군의 경우 도피대가 있던 사분면에 머문 시간의 비율이 25%, 대조군은 9.3%로 나타났다. 반면 시험군인 H200군에서는 도피대가 있었던 사분면에 머문 시간이 유의적으로 증가하여 22.7%로 나타났다.
사분면에 머무르는 것의 의미는 마우스가 네 개의 사분면에 붙여진 표식을 인식하고 도피대가 있었던 사분면을 기억하여 그 사분면에서 도피대를 찾기 위해 머문 것으로, 공간단서를 기억하는 능력 (학습과 기억력)을 본 발명에 따른 조성물이 향상시켰다는 것을 확인할 수 있다.
도 9b는 도피대를 찾아가는 것이 운동능력에 의한 것인지, 시각능력으로 의한 것인지, 또는 공간기억능력에 의한 것인지를 알아보기 위해 숨겨진 도피대와 노출된 도피대로 실시한 시험 결과를 나타낸 것이다. 도 9b에 나타난 바에 의하면, 숨겨진 도피대로 실시한 경우, 시험군은 정상군 보다도 도피대를 찾아가는 시간이 훨씬 빠르다는 것을 확인할 수 있다. 반면 노출된 도피대를 찾아가는 실험을 실시하였을 때는 모든 군에서 도피대를 찾아가는 시간에 대한 유의적 차이가 없었다. 따라서 두 결과 값이 운동능력 차이나 시각적 차이로 인한 문제가 아닌 기억력 손상으로 인한 공간인지능력의 차이로 일어나는 것임을 확인할 수 있다.
결국 본 발명에 따른 조성물이 인지능력 손상에 대한 보호효과가 있고, 기억능력의 향상에도 효과가 있음을 알 수 있다.
시험예 3: 뇌 조직에서 NO 소거 효과
뇌 조직에서 Aβ25-35를 주입함에 따라 유발된 NO 생성을 억제하는 효과를 시험하였다.
NO 생성 억제 측정은 Schmidt 등의 방법에 따라 조직의 NO 함량을 측정하는 것으로, 구체적으로는 균질화시킨 뇌조직을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액 150 μl와 증류수 130 μl를 혼합한 후에 1% 술파닐산(sulfanilic acid)을 함유한 5% 인산과 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아미드디하이드로클로라이드 용액을 사용 식전에 1:1 (v/v)로 혼합하여 만든 그리스 시약(griess reagent)를 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 농도로 환산하였다. 표준곡선은 NaNO2를 농도별로 조제하여 사용하였다. 그 결과를 도 10에 나타냈다.
도 10에 나타낸 바에 의하면, 대조군의 경우 뇌에서 NO 생성량이 4.9 μmol/L/mg단백질, 정상군이 2.6 μmol/L/mg단백질을 나타내어 Aβ25-35 주입으로 인해 NO가 1.8배 증가하는 것을 알 수 있었다. 이에 비하여 시험군 (H100과 H200군)은 각각 4.1, 4.2 μmol/L/mg단백질으로 정상군에 비해서도 뇌 조직에서 NO 생성량이 감소함을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 뇌 조직에서 NO 생성을 억제하는 효과를 갖고, 또한 뇌 조직에서 NO에 의한 산화적 스트레스를 개선할 수 있다.
시험예 4: 뇌 조직에서의 지질과산화 생성 억제 효과
뇌 조직의 지질과산화 생성 억제 측정은 Ohkawa 등의 방법을 이용하여 MDA (Malondialdehyde) 함량을 측정하여 수행하였다.
각 군의 마우스의 뇌 조직을 호모게나이저를 이용하여 생리식염수로 균질화시킨 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리시켜 얻은 조직 상층액과 1% 인산과 0.67% 티오바르비투르산(thiobarbituric acid; TBA)를 혼합하여 95℃에서 45분간 반응시킨 후 냉각하여 1-부탄올을 2ml 첨가하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤에 상층액을 535 nm, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA를 농도별로 제조하여 얻은 표준 곡선을 이용하여 지질과산화 정도를 산출하여, 그 결과를 도 11에 나타냈다.
도 11에 의하면, MDA의 농도가 정상군의 26.5 nmol/mg단백질인 반면, 대조군에서는 37.2 nmol/mg단백질로 Aβ25-35 주입으로 인해 지질과산화가 1.4배 더 많이 생성되었음을 확인할 수 있다. 이에 비하여 시험군 (H100과 H200군)에서는 각각 27.4, 30.2 nmol/mg단백질로 지질과산화 억제 효과가 나타났고, 특히 H100군의 경우 정상군에 필적하는 수준으로 지질과산화를 억제하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 뇌 조직에서 지질과산화 생성 억제효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
Claims (11)
- 법제 하수오 유래의 하기 구조식으로 표시되는 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 인지기능 개선용 조성물:
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 법제 하수오의 유기용매 추출물 또는 분획물인 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성성분은 법제 하수오 유래의 2,3,5,4' -테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드인 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성성분은 법제 하수오 유래의 레인인 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성성분은 법제 하수오 유래의 에모딘 또는 크리소파놀인 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 인지기능 개선 조성물을 포함하여 이루어지는 건강기능성 식품.
- 제 6항에 있어서, 기억력 개선 또는 건망증 개선용인 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
- 제 6항에 있어서, 치매, 허혈성 뇌질환 및 알츠하이머 질환의 증상 개선용 건강기능성 식품.
- 제 8항에 있어서, 정제, 캅셀제, 분말제, 과립제, 액상제 및 환제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 가공된 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
- ⅰ) 법제 하수오 분말을 제공하는 단계;
ⅱ) 법제 하수오 분말에 20 ~ 30 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매로 추출하는 단계;
ⅲ) 유기용매 추출물을 물에 현탁한 후, 헥센, 클로로포롬 및 메탄올으로 분획하고, 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 헥센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획물을 얻는 단계; 및
ⅳ) 결과의 분획물로부터 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 단계 ⅳ)에서 분리는 정제 순환 고압액체크로마토그래피, 역상크로마토그래피, 실리카 겔 프래시 CC 크로마토그래피 및 세파덱스 LH-20 크로마토그래피로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 인지기능 개선 조성물의 제조방법.
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|---|---|---|---|---|
| CN109212065A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-01-15 | 上海博云生物科技有限公司 | 一种脑组织中胆固醇类代谢物的检测方法 |
| US20210186947A1 (en) * | 2018-05-24 | 2021-06-24 | Eth Zurich | Tomm6-interacting extracts and compounds for use in the treatment and prophylaxis of nervous system diseases, atherosclerosis, hepatitis b infection and human papilloma virus (hpv) infection |
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2015
- 2015-05-21 KR KR1020150070973A patent/KR20160136855A/ko not_active Application Discontinuation
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| EP3943085A3 (en) * | 2018-05-24 | 2022-02-23 | ETH Zurich | Tomm6-interacting extracts and compounds for use in the treatment and prophylaxis of nervous system diseases, atherosclerosis, hepatitis b infection and human papilloma virus (hpv) infection |
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