CN104825461A - 白肉灵芝提取物的神经保护用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了白肉灵芝提取物的神经保护用途。具体公开了所述提取物在制备用于神经保护的药物或食品中的应用。所述神经保护是预防和/或治疗神经退行性疾病、抗疲劳、镇静催眠、健脑益智中的至少一种。所述提取物在神经保护方面显示出显著效果。

Description

白肉灵芝提取物的神经保护用途

技术领域

本发明涉及药用提取物，具体涉及白肉灵芝提取物用于神经保护方面的应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、灵芝科(Gamodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)类。《中华本草》中记录“其性甘；味平；无毒；归肺、心、脾、肾经。益气血；安心神；健脾胃。主治虚劳、心悸、失眠、头晕、神疲乏力、久咳气喘、冠心病、矽肺、肿瘤。”《中国药典》中将灵芝收录为中药材，其中的灵芝多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是其药效物质的主要基础，以三萜和多糖为其中主要活性成分。现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-4及HIV-4蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化等作用。

灵芝分类历史悠久，归类各有不同，《本草纲目》等古籍中以“六色”将灵芝归为：青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、紫芝。近日广东省微生物研究所李泰辉等人在真菌学杂志《Mycoscience,http://dx.doi.org/10.1016/j.myc.2014.03.005》发表文章宣布他们在西藏林芝地区发现了一个灵芝新种——白肉灵芝Ganoderma leucocontextum(Li TH,Hu HP,Deng WQ,et al.Ganoderma leucocontextum,a new member of the G.lucidum complex from southwestern China；Mycoscience,2015,56(1)：81-85)。中国西藏新闻网2014年8月报道西藏自治区农牧科学院研究人员白肉灵芝人工栽培获得成功。针对白肉灵芝的食用及药用价值急需进行系统研究和开发。

发明内容

本发明以白肉灵芝Ganoderma leucocontextum为研究对象，对其提取物进行了化学和生物活性研究，发现白肉灵芝提取物具有很好的神经保护作用，具有很好的药用和食用价值。

为此，本发明的第一方面，提供白肉灵芝提取物在制备用于神经保护的药物中的应用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的组合，

本发明的白肉灵芝Ganoderma leucocontextum提取物是按照如下的方法制备，所述方法包括如下步骤：

用提取溶剂提取白肉灵芝的子实体至少一次；和

去除溶剂以获得所述提取物。

所述提取溶剂可选自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、卤代C1～C3烷烃、R1C(O)R2中的一种，或者两种或更多种的混合溶剂，其中R1和R2各自独立地为C1～C3烷基。

所述提取溶剂优选选自水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一种或多种。

特别优选所述提取溶剂为20～98％(v/v)的乙醇水溶液，更优选40～98％(v/v)、最优选70～95％(v/v)的乙醇水溶液。

白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比(g:ml或kg:L)为1:3～10；优选为1:2～5；最优选为1:3。

为提高提取效果，优选事先将白肉灵芝的子实体碎化。

所述提取方法可以是任何适宜的方法，例如但不限于浸渍提取、超声提取、加热回流提取等。

提取温度为室温～105℃，优选20～50℃。本文中所说室温通常指18～30℃。

根据一种实施方式，提取可进行1～5次，优选提取2～4次，最优选为3次。

提取时间为每次15min～2小时，优选为30～70min。

优选地，所述提取溶剂可回收再利用。

去除或回收提取溶剂的方法可根据不同溶剂灵活选取。例如可以进行蒸馏或减压蒸馏等。

根据本发明的另一种实施方式，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用弱极性有机溶剂萃取以除去脂溶性杂质；

用萃取剂萃取水相；和

取萃取剂层并去除萃取剂。

所述萃取剂可选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种，优选乙酸乙酯。

用于除去脂溶性杂质的弱极性有机溶剂可以是常用用萃取分离有机物的那些非极性溶剂。例如可选自C5～C12的烷烃、C5～C8的环烷烃、卤代C1～C3烷烃、石油醚中的一种或多种。根据一种实施方式，所述有非极性机溶剂可选自正己烷、正庚烷、正辛烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷、沸点60～90℃的石油醚中的一种或多种。优选使用所述石油醚和/或环己烷。

可用所述弱极性有机溶剂进行多次萃取以尽量除去脂溶性杂质。例如可萃取2～5次。

用萃取剂的萃取也同样可进行多次。例如可为2～5次。

所述弱极性有机溶剂以及所述萃取剂的用量分别为每次为水相体积的50～200％；优选用与水相等体积的弱极性有机溶剂(或萃取剂)进行萃取。

根据本发明的一种实施方式，所述提取溶剂为水、或选自C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯中的一种或多种溶剂的40％(v/v)以下(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(v/v))的水溶液，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用萃取剂萃取所获得的提取液；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

所述萃取剂可为选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种，优选乙酸乙酯。

同样的，用萃取剂的萃取可进行多次。例如可为2～5次。

所述萃取剂的用量分别为每次为水相体积的50～200％；优选用与水相等体积的萃取剂进行萃取。

该实施方式可获得水溶性更好的提取物，以便制备水溶剂或茶饮等产品。

所述神经保护可以是选自如下的至少一种：预防和/或治疗神经退行性疾病、抗疲劳、镇静、催眠和健脑益智，但不限于此。其中所述神经退行性疾病是指阿尔茨海默症、帕金森症、早老性痴呆和老年性痴呆等疾病。所述镇静是指可预防和/或治疗神经衰弱、狂躁和抑郁等疾病。所述健脑益智是指提高记忆力、提高智力等。

本发明的第二方面提供含有上述白肉灵芝提取物的可食用的产品用于神经保护的用途。其中白肉灵芝提取物中含有下式1和式2所示的化合物的组合。

所述神经保护作用是指预防和/或辅助治疗神经退行性疾病、抗疲劳、镇静、催眠和健脑益智等。所述神经退行性疾病例如阿尔茨海默症、帕金森症、早老性痴呆和老年性痴呆等，所述镇静是指可预防和/或治疗神经衰弱、狂躁和抑郁等。所述健脑益智是指提高记忆力、提高智力等。所述可食用的产品具体形式可为口服液、茶饮、含片、胶囊、饮品、泡腾片等等。

本发明的研究发现，白肉灵芝可采用任何常规的溶剂，包括水进行提取，提取方法简单，提取物可溶于水。提取物中含有较大量的三萜类化合 物，并对阿尔茨海默症、镇静催眠、抗衰益智、抗疲劳等神经保护方面有显著效果。因此，白肉灵芝的提取物具有广阔的药用和食用的应用前景。

附图说明

图1为用不同有机溶剂提取白肉灵芝粗提物的HPLC指纹图谱；和

图2为根据本发明一种实施方式获得的白肉灵芝提取物的HPLC图谱。

具体实施方式

参照附图及以下详细描述的优选实施方式和具体实施例，更加详细地说明本发明的各个方面和上述的及其他的优点。本领域技术人员应理解，下面描述的这些内容是为了更好地理解本发明，本发明的范围并不受限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

白肉灵芝由西藏自治区农科院蔬菜研究所提供。

实施例1白肉灵芝乙醇提取物的制备

将白肉灵芝子实体剪碎，称重5000克。用15L体积百分含量95％乙醇的水溶液回流提取3次，每次1小时。合并提取液，减压浓缩干燥得到170克提取物，将提取物记作GL-1。

进一步将提取物用蒸馏水600ml溶解，用等体积的正己烷萃取三次，弃去有机相。再用等体积乙酸乙酯萃取水相三次，弃去水相，合并乙酸乙酯萃取液。用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯获得浸膏54g，记作GL-1E。

实施例2纯化及鉴定实施例1GL-1E提取物中的主要化合物

取40g实施例1制备的提取物GL-1E，通过硅胶柱色谱分离，以正己烷:乙酸乙酯体系和二氯甲烷:甲醇体系依次进行梯度洗脱，每个梯度洗3个保留体积，每个体积500ml。在二氯甲烷:甲醇(体积比为100:1)中得到馏分19，命名为GL-E19。

GL-E19(10.5g)利用ODS反相硅胶柱分离，用体积百分含量为10％～100％甲醇的水溶液依次进行洗脱，每个洗脱体系3个保留体积，每个保留体积为500ml，每300ml收集一个馏分。体积百分含量为40％的甲醇水溶液系统的第三个馏分和体积百分含量为50％的甲醇水溶液系统的第三个馏分，分别命名为GL-E19-23和GL-E19-27。

对GL-E19-23以体积百分含量40％乙腈的酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集28min的色谱峰，得到化合物1。对GL-E19-27以体积百分含量42％乙腈酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集25.2min的色谱峰得到化合物2。上述HPLC色谱条件如下：以色谱纯的甲醇将样品配制为10mg/ml的溶液，上样量为15ul每次，色谱柱为Kromasil10×250mm C18半制备柱，柱温为25℃，210nm波长进行检测。

化合物1和化合物2通过鉴定，结构式如下式1、式2所示，数据归属见表1和2。

表1化合物1和化合物2的¹³C NMR数据(125MHz，CDCl₃)

Carbon	化合物1	化合物2	Carbon	化合物1	化合物2
						1	34.9	34.2	19	19.1	18.6
2	34.5	34.3	20	31.9	35.7
						3	219.1	211.8	21	20.9	18.5
4	50.3	51.6	22	26.5	25.8
						5	49.5	50.5	23	33.1	34.5
6	27.0	39.5	24	143.8	144.5
						7	65.6	198.7	25	127.6	127.5

8	157	147.0	26	172.2	173.0
						9	140.9	149.9	27	12.1	12.2
10	37.5	39.5	28	22.0	22.5
						11	192.4	199.6	29	65.5	65.8
12	79.7	44.1	30	24.5	21.6
						13	60.5	57.3	1'	170.4	171.6
14	49.7	49.1	2'	20.7	44.8
						15	216.7	208.0	3'		69.9
16	37.7	37.1	4'		44.7
						17	46.1	45.3	5'		175.2
18	13.6	16.2	6'		27.3

表2化合物1和化合物2的¹H NMR数据(J in Hz,500MHz，CDCl₃)

实施例3提取物GL-1的指纹图谱检测

高效液相化学指纹图谱分析条件如下：使用Agilent1200高效液相色谱仪，四元梯度泵，DAD检测器，Agilent色谱工作站。色谱柱YMC C8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈-体积百分含量0.04％的三氟乙酸的水溶液，温度室温(20～30℃)的条件下进行梯度洗脱(洗脱程序以及各成分的体积百分含量如下所示)，流速1.00mL/min。将粗提物G1用 乙腈溶解，配成10mg/mL的溶液，进样量10μl，紫外检测波长为210nm。

梯度洗脱步骤如下表3：

表3

按照上述洗脱条件得到提取物GL-1的色谱图如图1所示，并对实施例2分离得到的2个化合物进行指认，这两个化合物的峰面积占总峰面积的10.82％。

实施例4用甲醇提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:甲醇＝1g:3ml的量加入甲醇，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-2。甲醇纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-2进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的6.58％。

实施例5:用乙酸乙酯提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:乙酸乙酯＝1g:3ml的量加入乙酸乙酯，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，即提取物GL-3。乙酸乙酯纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-3进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的8.45％。

实施例6:用二氯甲烷提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:二氯甲烷＝1g:3ml的量加入二氯甲烷，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到粗提物GL-4。所述二氯甲烷纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-4进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的12.38％。

实施例7:用丙酮提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:丙酮＝1g:3ml的量加入丙酮，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-5。所述丙酮纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-5进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1-2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的6.31％。

实施例8:用水提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:水＝1g:3ml的量加入去离子水，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-6。将GL-6提取物浸膏用适量蒸馏水混悬，然后用等量乙酸乙酯萃取三次，旋转蒸发仪蒸干溶液获得水提物的乙酸乙酯浸膏GL-6E。所述水为去离子水。

将GL-6E进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图2所示，1-2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的12.24％。

实施例9白肉灵芝提取物对退行性疾病的作用

(一)白肉灵芝提取物能够抑制H₂O₂对神经细胞株PC12的毒性

两种常见的退行性疾病帕金森和阿尔茨海默病，其病理过程中的氧化应激被认为是其中的主要因素之一。

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用DMSO(二甲亚砜)配制成50mg/ml溶液(制备时溶于少量DMSO后，再用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积百分含量<1％)，用DMEM培养基进行2倍梯度稀释，共8个浓度，供活性测试。DMEM、胎牛血清和马血清购自Gibco公司。PC12细胞株购自中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所。H₂O₂和DMSO购自北京化工厂。CCK8购自日本同仁化学研究所。

方法：PC12细胞采用含10％胎牛血清、5％马血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，37摄氏度，5％CO₂培养箱培养。将PC12细胞接种于96孔板上，加入不同浓度待测化合物处理16小时，然后加入H₂O₂处理24小时，加入CCK8再次孵育4小时，450nm测定吸光度并计算细胞存活率。

结果：如表4所示，上述提取物对PC12具有保护作用，能够抑制H₂O₂诱导的细胞毒性，能显著高于未加药物处理组。结果证明，白肉灵芝提取物能够抑制活性氧H₂O₂产生的神经细胞的毒性，能够用于神经退行性疾病的预防和治疗。

表4

提取物	EC50，μg/ml	提取物	EC50，μg/ml
				GL-1E	24.6	GL 5	54.3
GL 1	59.8	GL-6	49.8
				GL 2	76.3	GL-6E	31.3
GL 3	88.2	维生素E	0.9
				GL 4	67.9

(二)白肉灵芝提取物的神经生长因子样作用研究

神经细胞受损是阿尔茨海默病发生的主要原因。用脑中现有的星形胶质细胞“更新”因伤或疾病而受损的脑细胞将为阿尔茨海默病或中风等疾病治疗提供全新方法。

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物 (GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用DMSO(二甲亚砜)配制成50mg/ml溶液(制备时溶于少量DMSO后，再用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积百分含量<1％)，用DMEM培养基进行2倍梯度稀释，共8个浓度，供活性测试。DMEM、胎牛血清和马血清购自Gibco公司。H₂O₂和DMSO购自北京化工厂。

方法：参照Peter J.Meberg与Toshihide Tabata建立的方法进行乳鼠大脑皮层细胞原代培养(Methods Cell Biol,2003,71:111；J Nerosci Methods,2000,104(1):45)。将2天新生乳鼠放入500mL碘伏中，窒息而死并消毒5min后取出乳鼠，用75％酒精消毒头部，在无菌条件下取出大脑皮层，并去除脑膜、血管、海马等，将脑细胞剪碎成1mm³小块，加入等体积的0.25％含EDTA的Typsin液中消化，37摄氏度水浴锅中消化30min，每隔2min轻轻摇荡1次。加入10％FBS的DMEM培养液终止消化；70μm尼龙网筛过滤，离心(800r/min,6min)，弃上清液。用10％FBS的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液1×10⁶个/mL接种于24孔板中，置于CO₂培养箱(5％CO₂、37度)培养。培养2～3天半量换液1次，10～12天用于实验研究。将细胞接种于96孔板上，各给药组加入不同浓度待测化合物处理72小时，对照组加入等量的DMSO(DMSO用培养基稀释，使含量小于总体积的1％)，然后用倒置相差显微镜观察神经胶质细胞和神经元细胞的生长情况。

结果如表5所示，上述提取物可以有效地促进神经胶质细胞向神经元细胞的转化，具有研发治疗阿尔茨海默病的药物的巨大潜力。

表5

提取物	神经胶质细胞％	提取物	神经胶质细胞％
				GL-1E	15％	GL 5	45％
GL 1	46％	GL-6	39％
				GL 2	53％	GL-6E	22％
GL 3	51％	对照组	90％
				GL 4	32％

实施例10白肉灵芝提取物的镇静催眠作用

(一)对戊巴比妥钠睡眠时间的影响

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na配 制100mg/ml溶液，供活性测试。小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。戊巴比妥钠为Serva产品，上海化学试剂采购供应站试剂厂分装，批号110812。

方法：选取体重18～22g小鼠，雌雄不限，随机分为8组，每组10只，每只灌胃0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，空白对照组以等量的0.5％CMC-Na溶液。给药30分钟后，腹腔注射给药戊巴比妥钠50mg/kg，以翻正反射消失至恢复时间作为睡眠时间。

结果：与对空白照组比较，上述提取物可以显著延长戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间，结果见表6。

表6

提取物	睡眠时间(分钟)	提取物	睡眠时间(分钟)
				GL-1E	202.0±22.3**	GL 5	159.4±22.3**
GL 1	180.6±19.6**	GL 6	167.5±25.69**
				GL 2	160.7±25.3**	GL-6E	189.4±21.6**
GL 3	182.9±15.6**	空白对照组	100.4±13.7
				GL 4	173.8±19.7**

*P<0.05，**P<0.01与空白对照组相比

(二)对士的宁致小鼠惊厥的影响

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。硝酸士的宁注射液(上海禾丰制药有限公司，批号121112)。

方法：选取体重18～22g小鼠，雌雄不限，随机分为8组，每组10只，实验前禁食12小时，自由饮水。每只灌胃0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，空白对照组以等量的0.5％CMC-Na溶液。给药30分钟后，腹腔注射给药硝酸士的宁2mg/kg，以双后肢强直性惊厥与否为观察指标，记录小鼠惊厥数，计算惊厥率。

惊厥率＝给药组小鼠惊厥次数/空白对照组惊厥次数×100％

结果：与空白对照组比较，上述提取物可以显著抵抗士的宁致小鼠惊厥作用，结果见表7。

表7

提取物	惊厥率％	提取物	惊厥率％
				GL-1E	30％**	GL 5	52％**
GL 1	53％**	GL-6	55％**
				GL 2	65％*	GL-6E	41％**
GL 3	50％**	空白对照组	100％
				GL 4	48％**

*P<0.05，**P<0.01与空白对照组相比

实施例11白肉灵芝提取物的抗衰益智作用

白肉灵芝提取物对大鼠学习记忆的影响(Morris水迷宫法)

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的6个提取物(GL-1E、GL-1～GL-5和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。雄性清洁级SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。大鼠Morris水迷宫视频分析系统：上海吉量JL Behv-MWMG型，包括1大鼠Morris水迷宫，1套视频摄像系统，无线遥控器，1大鼠水迷宫视频分析软件及加密狗。

方法：Morris水迷宫直径1.65m，内壁及底为全黑色，水迷宫区域分成四个象限，选择在第二象限中央水面2cm下放一直径12cm黑色平台，水迷宫实验每次换水后，添加一定量黑色染料，使水变为黑色不透明，实验期间水温保持在20±2℃。

选取体重200～220g雄性清洁级SD大鼠，雌雄不限，随机分为8组，每组10只，实验前禁食12小时，自由饮水。每只灌胃1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)；对照组给予等量0.5％CMC-Na溶液。给药第11～14天，给药完毕后立刻进行定位航行实验。在定位航行实验过程中，每只大鼠每天训练4次，间隔10min。训练时，随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中。4次训练分别从4个不同入水点入水。记录每只 鼠分别从4个不同点入水开始找到水下平台所需时间即逃避到平台上的潜伏期(escaping latency)。允许动物在60s内找到平台，找到后在平台上保持15s。如果在60s内找不到平台，则将大鼠引导到平台上，并保持15s，潜伏期按60s计算。每次训练结束后擦干大鼠身体，放入各自的鼠笼内并适当给予保暖。第一天每次训练前要先将大鼠放在平台上15s，使其熟悉环境，从第二天开始则直接进行定向游泳训练。大鼠在每个入水点第一次探索时，由于时间和空间的改变，不能与上一次探索形成顺序性关系，而只能依照环境的参照来确定水下平台的位置，因此其记忆属性为参考记忆。本实验即参考Youngblood等[Youngblood B D,Zhou J,Smagin G N et al.Sleep deprivation by the“flower pot”technique and spatial reference memory.Physiol Behav 1997；61(2)249-56.]的设计方法，以每天四个入水点的潜伏期的算术平均值作为该天的定向游泳成绩，参与最终结果的统计。

水迷宫试验期间，水迷宫周围灯光等参照物必须保持不变。在本实验中，将水迷宫周围围一圆形帘子，以避免实验人员对实验的干扰。水迷宫内壁，水面上方在每个象限的固定位置贴有不同几何图形，作为实验动物记忆的参照物。

结果：与对照组比较，上述提取物可以显著提高大鼠记忆力，结果见表8。

表8

*P<0.05，**P<0.01与空白对照组相比

实施例12白肉灵芝提取物抗疲劳作用(爬杆实验)

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。雄性清洁级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。

方法：选取体重18～22g雄性小鼠，随机分为9组，每组10只，实验前禁食12小时，自由饮水。每只灌胃0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，对照组给予等量0.5％CMC-Na溶液，连续10天，末次给药30分钟后，将小鼠放在垂直悬挂的玻璃杆上，使其肌肉处于紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从玻璃杆上跌落下来的时间，第三次跌落终止实验，累计3次的时间作为爬杆时间。

结果：与对照组比较，上述提取物可以显著延长小鼠爬杆时间，有一定的抗疲劳作用，结果见表9。

表9

提取物	爬杆时间分钟	提取物	爬杆时间分钟
				GL-1E	14.25±5.67	GL 5	13.03±6.01
GL 1	12.99±4.98	GL 6	12.01±5.74
				GL 2	10.43±4.26	GL-6E	13.42±5.28
GL 3	13.14±6.27	对照组	9.63±3.61
				GL 4	12.42±3.50

*P<0.05，**P<0.01与空白对照组相比。

Claims (10)

1.白肉灵芝提取物在制备用于神经保护的药物中的应用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的组合，

2.根据权利要求1所述的应用，所述提取物通过如下方法获得，所述方法包括：

用提取溶剂提取白肉灵芝的子实体至少一次；和

去除溶剂以获得所述提取物，

其中，所述提取溶剂选自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、卤代C1～C3烷烃、R1C(O)R2中的一种，或者两种或更多种的混合溶剂，其中R1和R2各自独立地为C1～C3烷基。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述提取溶剂选自水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一种或多种，

优选所述提取溶剂为20～98％(v/v)的乙醇水溶液，

更优选40～98％(v/v)的乙醇水溶液、进一步优选为70～95％(v/v)的乙醇水溶液。

4.如权利要求2所述的方法，其中白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比为1:3～10；优选为1:2～5，最优选为1:3；提取温度为18℃～ 105℃，优选20℃～50℃；且提取1～5次，优选提取2～4次，最优选为3次。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用弱极性有机溶剂萃取以除去脂溶性杂质；

用萃取剂萃取水相；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

其中，所述萃取剂为选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种，

优选地，所述弱极性有机溶剂选自C5～C12的烷烃、C5～C8的环烷烃、卤代C1～C3烷烃、石油醚中的一种或多种；更优选地，所述非极性有机溶剂选自正己烷、正庚烷、正辛烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷和沸点60～90℃的石油醚中的一种或多种；最优选为沸点60～90℃的石油醚和/或环己烷。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述提取溶剂为水、或为选自C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯和乙酸C1～C3烷基酯中的一种或多种溶剂的40％、优选30％、更优选20％(v/v)以下的水溶液，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用萃取剂萃取所获得的提取液；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

其中，所述萃取剂为选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种。

7.根据权利要求1所述的应用，其中所述神经保护是选自如下的至少一种：预防和/或治疗神经退行性疾病、抗疲劳、镇静、催眠和健脑益智；优选地，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默症、帕金森症、早老性痴呆和老年性痴呆，所述镇静选自预防和/或治疗神经衰弱、狂躁和抑郁。

8.含有白肉灵芝提取物的可食用的产品用于神经保护的用途，其中所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的组合，

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述神经保护选自预防和/或辅助治疗神经退行性疾病、抗疲劳、镇静、催眠和健脑益智中的至少一种，优选地，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默症、帕金森症、早老性痴呆和老年性痴呆，所述镇定选自预防和/或辅助治疗神经衰弱、躁狂和抑郁、亚健康状态中的用途。

10.根据权利要求8所述的用途，其中所述产品为口服液、茶饮、含片、胶囊、饮品或泡腾片。