CN100457772C - 灵芝甾醇类提取物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有机有效成份的医药配制品，特别涉及一种灵芝甾醇(Sterols)类提取物，其由灵芝提取而获得，其主要成分为白色片状结晶，其名称为24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇，分子式C28H46O；其制备方法；其在制备具有抗各种病因引起的脑缺血作用，特别是具有抗大脑皮层神经元缺氧作用的药物中的应用。本发明从灵芝中提取的新的甾醇类化合物对各种病因引起的脑缺血具有突出的疗效，而且因其具有的准确的分子结构式使其治病作用机理较为明确，药效突出，药物活性物质的利用率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有机有效成份的医药配制品，特别涉及一种灵芝甾醇(Sterols)类提取物及其制备方法与应用。
背景技术
灵芝具有较强的药用价值，传统的服用方法为煎服或煮食，被提取的活性药物成份较少，一般只有多糖成份被提取，即药物活性物质的利用率低。
现有技术中也有从灵芝中分离提取药物有效成份的作法，例如中国专利93101870.6(授权公告日1995年5月17日)就公开了一种复方灵芝营养液及其制备方法，但该专利技术只是将灵芝的粗提液作为一种组分与何首乌及绞股兰的有效萃取物组合而成为一种药物，用于提高免疫力及延缓衰老，该专利技术并未对灵芝的该提取成份及药理药效作进一步的深入研究。
从灵芝中分离提取得到的甾醇有近20余种，其中因骨架不同而分为麦角甾醇和胆甾醇两种类型，检索发现未见从灵芝中分离提取而获得的甾醇类提取物的药理活性报道及将其应用于临床。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从灵芝中精确提取而获得的活性物质灵芝甾醇类提取物；
提供该提取物的制备方法；
及该提取物在制备具有抗各种病因引起的脑缺血作用的药物中的应用。
本发明的目的可经如下方案实现。
灵芝甾醇类提取物，其要点在于，其由灵芝提取而获得，其主要成分为白色片状结晶，其名称为24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇，分子式C28H46O，其化学结构式如下：
这种从灵芝中提取而获得的物质为一种甾醇类化合物，本化合物存在28个碳，其中6个CH3，8个CH2，11个CH，以及3个季碳。利用一维(1H、13C、DEPT)和二维核磁共振技术[1H-1H、1H-13C相关谱，1H-13C异核多量子相关谱(HMBC)以及NOESY谱]对化合物进行了结构鉴定，确定其结构为24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇。
采用该灵芝甾醇类提取物对大鼠的脑皮层神经元缺氧再氧化损伤(简称H/R)进行治疗，具体为采用体外原代培养SD大鼠大脑皮层细胞，通过缺氧(12h)再氧化(24h)损伤建立脑缺血再灌注体外模型，观察发现灵芝甾醇类提取物(用量组0.01；0.1；1ug/ml)对受损细胞均有明显保护作用。
用PI和Hoechst33258双标的方法鉴定神经元的生命状态，在激光共聚焦显微镜下观察标记情况。PI和Hoechst33258双染的细胞为死细胞，Hoechst33258单染为活细胞。结果可见H/R模型组细胞中PI和Hoechst33258双染的死细胞明显增多，而应用灵芝甾醇类提取物后可明显增加活细胞的比例(详见图1)。
应用MTT法测定细胞的存活率和细胞代谢情况。结果H/R使神经元的存活率明显下降，而灵芝甾醇类提取物对受损细胞有显著的保护作用。
应用荧光探针DCF-DA特异性标记细胞内自由基，在激光共聚焦显微镜下测定细胞内自由基含量。可见H/R可显著诱导自由基的产生，镜下可见荧光探针强度明显增强，灵芝甾醇类提取物治疗组荧光强度则明显降低，也就是灵芝甾醇类提取物可显著抑制细胞内增高的自由基水平。
以裂解液制备细胞裂解物，用bradford方法鉴定蛋白含量。应用南京建成生物工程研究所生产试剂盒，比色法测定脂质过氧化产物戊二醛(MDA)水平。结果可见，灵芝甾醇类提取物也可降低受损神经元内异常升高的MDA，说明抗氧化作用可能是灵芝甾醇类提取物对神经细胞保护作用的机制之一。
同时，应用南京建成生物工程研究所生产试剂盒，我们还检测了神经元内总超氧化物歧化酶(SOD)及Mn-SOD活性。我们发现灵芝甾醇类提取物可明显增加神经元内SOD及Mn-SOD活性，而对Cu-ZnSOD活性并没有明显作用，这证明Mn-SOD可能是灵芝甾醇类提取物发挥其抗氧化作用的关键酶，通过增加Mn-SOD的活性而增强神经细胞的抗氧化能力(详见图2)。
用抗p65单克隆抗体标记细胞内核转录因子NF-κB，用免疫荧光的方法在激光共聚焦显微镜下对NF-κB进行定位观察。可见在正常情况下NF-κB基本定位于细胞浆内，而在缺氧12小时复氧45分钟时，NF-κB则大量向细胞核内转位，应用灵芝甾醇类提取物则明显拮抗了NF-κB的活化及核转位。
制备细胞裂解液，用Western blot的方法检测NF-κB特异性抑制物I-κB的表达水平。特异性一抗应用浓度为1∶100，二抗应用浓度用1∶1000。实验发现H(12h)/R(45min)可增加I-κB的降解，而灵芝甾醇类提取物可抑制此变化。因此我们认为灵芝甾醇类提取物通过抑制I-κB的降解进而抑制了NF-κB的活化和核转位。
制备细胞裂解液，并应用ELISA试剂盒，按照试剂盒说明方法检测炎性细胞因子TNFα和IL-1β在细胞内的表达水平，发现H/R可显著升高TNFα和IL-1β的水平，而灵芝甾醇类提取物可抑制此变化。
因为NF-κB是多种细胞因子表达的关键调控因子，所以我们推测灵芝甾醇类提取物可能通过抑制NF-κB的活化而影响TNFα和IL-1β的表达，从而抑制了炎性细胞因子对神经元的免疫损伤。又因为有实验证明SOD可抑制NF-κB的活化，所以我们推测Mn-SOD可能是灵芝甾醇类提取物对H/R损伤细胞发挥保护作用的关键作用位点，进而从抗氧化和抗免疫两个机制对抗H/R损伤。
医学上称脑缺氧是因为脑供血不足而引起的，因而本灵芝甾醇类提取物对大脑皮层神经元缺氧具有保护作用，故而同样对脑缺血具有保护作用。
一系列的研究均表明，发明人从灵芝中提取的新的甾醇类提取物对治疗由各种病因引起的脑缺血(特别是对大脑皮层神经元缺氧)具有突出的有益效果，而且因其具有的准确的分子结构式使其治病作用机理较为明确，药理作用突出，药物活性物质的利用率高。
灵芝甾醇类提取物，其要点在于，还包括次要成分白色结晶胆甾-5，7-二烯-3β醇，其化学结构式如下：
该化合物同样是通过一维(1H、13C、DEPT)和二维核磁共振技术[1H-1H、1H-13C相关谱，1H-13C异核多量子相关谱(HMBC)以及NOESY谱]对提取物进行鉴定而获得。
本发明的另一目的：提供一种
灵芝甾醇类提取物的制备方法，其要点在于，包括如下依序进行的步骤：
(1)提供一种灵芝作为原料母体；
(2)破碎该原料母体而得破碎物；
(3)用乙醇对破碎物进行回流提取4～10h、离心而得提取液；
(4)将提取液浓缩至浓缩液中含生药量0.5～1.5g/ml，静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗提物；
(5)将粗提物用热乙醇溶解，提取溶解液并静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗结晶；
(6)将粗结晶用乙醇稀碱溶液处理16～48小时，收集不溶物，
(7)将不溶物用浓碱溶液碱化24h，过滤，收集滤液；
(8)用等量乙醚对滤液进行萃取并收集乙醚层；
(9)将乙醚层用水洗至中性，进行干燥，待乙醚挥发完全后所得固体物即为灵芝甾醇类提取物。
对工艺步骤可作如下解释：
作为原料母体的灵芝可以是袋料栽培而获得的灵芝子实体，也可以是段木栽培的灵芝的子实体，甚至还可以是经微生物发酵而获得灵芝菌丝体。
采用常用破碎装置对灵芝原料母体进行破碎，破碎后的灵芝状态可以为片状或烟丝状，只要满足可以获得细胞壁已被粉碎的母体即可。
因为欲提取的灵芝甾醇类化合物溶于乙醇，所以采用乙醇对破碎物进行回流提取，并通过离心去渣而获得纯清的提取液。回流提取的时间越长，提取率越高，但耗时长，成本高，经验表明采用乙醇回流提取甾醇化合物的最佳时间为5～6小时。而乙醇与破碎物的重量比可为10∶1。
对提取液进行浓缩获取药物活性成份浓度较高的浓缩液，同时也回收乙醇，因为乙醇易挥发，因而通常采用加热蒸发方式回收乙醇。浓缩液中含生药量的浓度会对接下来的纯化工艺产生一定的影响，但对整个提取工艺的效果不会产生太大的影响，因而只需合理控制便可，但尽量控制在浓度为1g/ml最佳。因为低温下甾醇类化合物会结晶析出，因而采用静置10小时以上(或称静置过夜)，温度4～5℃，即可收集到较为粗糙的甾醇类提取物的粗提物，收集的方式可以为离心过滤。
将粗提物用热乙醇溶解，进行甾醇类提取物的纯化，乙醇的温度可以控制为高于常温但不高于乙醇的挥发温度，具体的温度设定本技术领域技术人员可根据当地实际气温及所掌握的知识进行准确的设置，放弃乙醇不溶物，而收集热乙醇溶解物的溶解液并静置10小时以上，温度4～5℃，收集进一步纯化的粗结晶。
将粗结晶用乙醇稀碱溶液处理16～48小时，收集不溶于该乙醇稀碱溶液的中性物质甾醇类提取物而去除不需要的酸性物质。
将不溶物用浓碱溶液碱化24h，过滤，此时所需的甾醇类提取物已溶于该浓碱溶液，收集滤液。该处的碱溶液可以为12％KOH。
采用常用萃取设备对滤液进行萃取，萃取剂为与滤液等量的乙醚，待混合液分层，收集溶有甾醇类化合物的乙醚层。
对乙醚层进行干燥，去除乙醚，所得固体物即为灵芝甾醇类提取物。
所获得的灵芝甾醇类提取物包含有多种成份，其中包含有主要成份24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份胆甾-5，7-二烯-3β醇。该甾醇提取物的药用效果所前如述。
上述工艺中用以溶解甾醇类化合物的乙醇的浓度可以采用现有技术中的常用浓度，例如可以采用95％的乙醇。当然，在实际操作中乙醇或用氯仿，或用甲醇，或用苯等有机溶剂代替。
本发明进一步还在于
对提取液进行浓缩的步骤为：
(1)提供一种旋转蒸发仪，
(2)将提取液导入旋转蒸发仪中，转速98r/min，
(3)直至浓缩液含生药量0.5～1.5g/ml，静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗提物。
而对将粗提物用热乙醇溶解的步骤还可以细化为：
(1)用热乙醇溶解粗提物，
(2)分别收集溶解液及不溶物，
(3)将不溶物用热乙醇溶解，
(4)重复(2)～(3)步骤多次，
(5)收集所有溶解液并静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗结晶。
上述步骤可以增加甾醇类化合物的提取率，避免了药物活性物质的浪费。
乙醇稀碱溶液的提供可以为在乙醇溶液中加入1％KOH或NaOH溶液。
对乙醚层干燥的具体步骤可以为：
(1)将乙醚层用水洗至中性，
(2)用无水Na2SO4将水份吸干并使乙醚挥发完全后得固体物。
下面对所获得的灵芝甾醇类提取物进一步纯化，以获得更为精确的物质。
具体步骤如下：
(1)提供一种层析柱，固定相硅胶，流动相石油醚与乙酸乙酯混合液，
(2)先用石油醚将硅胶填入层析柱，
(3)将溶解液加少量硅胶混合，常温去除溶剂而得固体物，
(4)将固体物装入层析柱顶，滴加石油醚与乙酸乙酯混合液梯度洗脱而使各组份分离，
(5)用自动分段收集器分段收集分离液，
(6)对各种分离液进行薄层分析、跟踪检测，合并同类，所用展开剂石油醚与乙酸乙酯的重量比为7∶3，显色剂1％香兰醛-硫酸；
(7)对同类分离液进行浓缩；
(8)提供一种乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液；
(9)在浓缩液中加入等量的乙醚与冰醋酸混合液，静置，收集析出的白色片状结晶分别为主要成份灵芝甾醇类提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份胆甾-5，7-二烯-3β醇。
采用层析柱对溶解液进行分离溶解液中的不同化合物，自动分段收集器分段收集该不同的化合物且分别浓缩。层析柱可以分离性质极近似的物质，早在几十年前就已广泛应用于化学、化工、生化等领域。
柱层析分析时，固定相为表面具有一定活性的吸附剂，而流动相的作用是对试样(固体物)进行洗脱分离。
该分离方式是基于固体吸附剂(固定相)对固体物中各组分的吸附能力的不同而进行的。
其分离过程是这样的：流动相将固体物携带进入层析柱，与固定相接触时，固体物很快被固定相溶解或吸附，随着流动相的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中洗脱下来，洗脱下来的组分随着流动相的向前移动时又再次被固定相溶解或吸附。随着流动相的不断涌入，溶解-洗脱的过程反复进行。显然，因为组分性质的差异，固定相对它们的溶解或吸附的能力不同，在层析柱内停留的时间也不同，因而，经过一定的时间间隔(一定柱长)后性质不同的组分24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇和胆甾-5，7-二烯-3β醇或其它成分便彼此分离。
自动分段收集器的收集口与层析柱分离液出口连接。
提供一种乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液，在浓缩液中加入等量混合液使浓缩液中的甾醇类提纯物重结晶，静置一段时间后，收集析出的白色片状结晶即为灵芝甾醇类提纯物。
本发明的目的之一：提供甾醇类提取物在制备具有抗各种病因引起的脑缺血作用，特别是具有抗大脑皮层神经元缺氧作用的药物可通过如下方式实现。
具有抗脑缺血作用的药物，其包含有效剂量的灵芝甾醇类提取物。
本发明还在于，该药物中包含有效剂量的灵芝甾醇类提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇。
本发明进一步还在于，该药物中包含有效剂量的灵芝甾醇类提纯物胆甾-5，7-二烯-3β醇。
或该药物同时包含有效剂量的灵芝甾醇类提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇和胆甾-5，7-二烯-3β醇的混合物。
灵芝甾醇类提取物、灵芝甾醇类提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇及胆甾-5，7-二烯-3β醇对各种病因引起的脑缺血的治疗效果同上文及下述具体实施方式中的实施例3。而至于有效剂量的定义则依据现有医药领域中根据实验药量而转换获得的用药量而定。
而该药物的剂型可以是现有技术中的常用的，例针剂，片剂，口服液等等。
综上所述，本发明较之现有技术具有如下优点：本发明从灵芝中提取的新的甾醇类化合物对各种病因引起的脑缺血具有突出的疗效，而且因其具有的准确的分子结构式使其治病作用机理较为明确，药效突出，药物活性物质的利用率高。
附图说明
图1为灵芝甾醇类提取物(1μg/ml)对H/R损伤的皮层神经元的保护作用。应用荧光探针Hoechst dye 33258和PI双标技术区别培养体系内的活细胞与死细胞，其中Hoechst dye 33258(蓝色)标记所有活细胞胞核，PI(红色)标记死细胞胞核。
a.正常对照组细胞 b.H(12h)/R(24h)损伤细胞 c.GS(1μg/ml)处理细胞
图2为灵芝甾醇类提取物对H/R损伤的神经元内总SOD、Mn-SOD及Cu-Zn SOD活性的影响。数据代表平均值±标准差。*P＜0.05，**P＜0.01与H/R模型组对照。
图3采用MTT法检测甾醇提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇对H/R损伤皮层细胞的保护作用，数据代表平均值±标准差。**P＜0.01与H/R模型组对照。
图4为灵芝甾醇类提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇(1μg/ml)对H/R损伤的皮层神经元的保护作用。
A.正常对照组细胞 B.H(12h)/R(24h)损伤细胞 C.GSP(1μg/ml)处理细胞
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行更详细的描述。
实施例1：
灵芝甾醇类提取物的制备方法，包括如下依序进行的步骤：
1、提供袋料栽培灵芝子实体作为原料母体，并将原料母体清洗、干燥；
2、采用破碎机将该原料母体进行破碎而得破碎物；
3、用95％乙醇对破碎物进行回流提取5～6h，乙醇与破碎物的重量比为10∶1，3000r/min 15分钟离心，弃渣而得提取液；
4、对提取液进行浓缩，步骤为：
(1)提供一种薄膜旋转蒸发仪，
(2)将提取液导入薄膜旋转蒸发仪中，转速98r/min，
(3)直至浓缩液含生药量约1g/ml，静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗提物。
5、将粗提物作如下处理：
(1)用95％热乙醇溶解粗提物，
(2)分别收集溶解液及不溶物，
(3)将不溶物用95％热乙醇溶解，
(4)重复(2)～(3)步骤多次，
(5)弃乙醇热不溶物，收集所有溶解液并静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗结晶。
6、将粗结晶用1％KOH乙醇溶液处理16～24小时，收集不溶物，
7、将不溶物用12％KOH碱溶液碱化24h，过滤，收集滤液；
8、用与滤液等量的乙醚对滤液进行萃取并收集乙醚层；
9、将乙醚层用水洗至中性，用无水Na2SO4将水份吸干并使乙醚挥发完全后得固体物灵芝甾类提取物。
将灵芝甾醇类提取物进一步纯化，以获得更为精确的物质。
具体步骤如下：
(1)提供一种层析柱，固定相硅胶，流动相石油醚与乙酸乙酯混合液，
(2)先用石油醚将硅胶填入层析柱，
(3)将溶解液加少量硅胶混合，常温去除溶剂而得固体物，
(4)将固体物装入层析柱顶，滴加石油醚与乙酸乙酯混合液梯度洗脱而使各组份分离，
(5)用自动分段收集器分段收集分离液，
(6)对各种分离液进行薄层分析、跟踪检测，合并同类，所用展开剂石油醚与乙酸乙酯的重量比为7∶3，显色剂1％香兰醛-硫酸；
(7)对同类分离液进行浓缩；
(8)提供一种乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液；
(9)在浓缩液中加入等量混合液，静置，收集析出的白色片状结晶分别为主要成份灵芝甾醇类提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份为胆甾-5，7-二烯-3β醇。
实施例2：
提供实施例1获得的比例最多的甾醇类提纯物，即主要成份进行如下实验：
实验条件
化合物约20mg溶解于氘代氯仿中，然后装入5mm核磁管中，在Bruker DRX-400型超导核磁共振谱仪进行氯仿一维和二维核磁共振谱的检测，测试温度为298k，TMS作为氢谱和碳谱的化学位移内标。
实验结果
由13CNMR和DEPT谱可以确定分子中存在28个碳，其中6个CH3，8个CH2，11个CH，以及3个季碳。利用一维(1H、13C、DEPT)和二维核磁共振技术1H-1H、1H-13C相关谱，1H-13C异核多量子相关谱(HMBC)以及NOESY谱可以确定化合物X的氢原子和碳原子的化学位移(见表1和表2)
表1：化合物的1H NMR数据
| 氢原子编号 | 化学位移(δppm) | 氢原子编号 | 化学位移(δppm) | 氢原子编号 | 化学位移(δppm) |
| 1α | 1.065 | 9α | 1.613 | 18 | 0.534 |
| 1β | 1.799 | 11α | 1.419 | 19 | 0.776 |
| 2α | 1.374 | 11β | 1.588 | 20 | 1.837 |
| 2β | 1.770 | 12α | 1.237 | 21 | 0.897 |
| 3α | 3.573 | 12β | 1.681 | 22 | 5.138 |
| 4α | 1.220 | 14α | 1.225 | 23 | 5.184 |
| 4β | 1.987 | 15α | 1.338 | 24 | 1.995 |
| 6 | 5.139 | 15β | 1.470 | 25 | 1.440 |
| 7α | 1.234 | 16α | 1.265 | 26 | 0.801 |
| 7β | 1.742 | 16β | 1.695 | 27 | 0.812 |
| 8α | 1.337 | 17α | 1.784 | 28 | 0.995 |
表2：化合物的13C NMR数据
| 碳原子编号 | 化学位移(δppm) | 氢原子编号 | 化学位移(δppm) | 氢原子编号 | 化学位移(δppm) |
| 1 | 37.2 | 11 | 21.6 | 21 | 17.6 |
| 2 | 31.5 | 12 | 28.1 | 22 | 135.7 |
| 3 | 71.1 | 13 | 43.3 | 23 | 131.9 |
| 4 | 39.5 | 14 | 56.0 | 24 | 49.5 |
| 5 | 139.5 | 15 | 22.9 | 25 | 33.1 |
| 6 | 117.5 | 16 | 37.9 | 26 | 19.7 |
| 7 | 29.6 | 17 | 55.1 | 27 | 20.0 |
| 8 | 40.5 | 18 | 12.1 | 28 | 21.1 |
| 9 | 40.3 | 19 | 13.0 | ||
| 10 | 34.2 | 20 | 42.8 |
该主要化合物的结构式为
同理获得该灵芝甾醇类提取物的次要成份为及胆甾-5，7-二烯-3β醇，其结构式为
实施例3：
灵芝甾醇类提取物及其提纯物对大鼠大脑皮层
神经元缺氧再氧化损伤的保护作用
观察灵芝甾醇类提取物(Ganoderma Sterols，GS)及其提纯物(即主要成分24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇，purification ofGanoderma Sterols，GSP)对大鼠大脑皮层神经元缺氧再氧化损伤(H/R)的保护作用，为将灵芝甾醇提取物应用于脑缺血再灌注的预防保护提供实验依据。
(一)灵芝甾醇类提取物(GS)对大鼠大脑皮层神经元缺氧再氧化损伤
的保护作用
首先我们研究了灵芝甾醇类提取物(GS)对脑缺血再灌注体外模型的保护作用，并对其机制进行了初步探讨。
体外原代培养SD大鼠大脑皮层细胞，通过缺氧(12h)再氧化(24h)损伤建立脑缺血再灌注体外模型。培养器皿预先用12mg/l多聚赖氨酸处理，自然晾干备用。取出生1天的SD大鼠，无菌分离乳鼠大脑皮层，0.25％胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，用含10％胎牛血清、10％马血清的DMEM稀释，以1×106/ml细胞密度接种于培养器皿中，置于孵育箱(CO2浓度为5％)，于37℃孵育。体外培养72小时加10μmol/L阿糖胞苷抑制非神经元的生长。以烯醇化酶(NSE)作为神经元特异性标志物检验神经元的纯度，结果证明在我们的培养体系中，神经元所占比例为83-92％。
神经元体外培养8天后除去原DMEM培养液，换以低糖、无血清培养液，放入37℃，5％CO2，95％N2的缺氧罐中，于缺氧12h后即刻将细胞移至37℃，5％CO2，95％空气孵箱中复氧24h，取出进行实验。
用PI和Hoechst33258双标的方法鉴定神经元的生命状态，在激光共聚焦显微镜下观察标记情况。PI和Hoechst33258双染的细胞为死细胞，Hoechst33258单染为活细胞。结果可见H/R模型组细胞中PI和Hoechst33258双染的死细胞明显增多，而应用GS后可明显增加活细胞的比例(详见图1)。
应用MTT法测定细胞的存活率和细胞代谢情况。于终止培养前4h向96孔板的每孔中加入MTT(终浓度为0.5mg/ml)，培养4h后吸出培养液，每孔加100μl二甲基亚枫(DMSO)，使结晶充分溶解，分光光度仪上读取波长570nm的A值。结果H/R使神经元的存活率明显下降，而GS对受损细胞有显著的保护作用。
应用荧光探针DCF-DA特异性标记细胞内自由基，在细胞中DCF-DA被H2O2氧化为二氯荧光黄(DCF)，DCF产生绿色荧光，通过测定细胞内DCF的荧光强度，即可相对定量细胞内H2O2水平。DCF-DA(10μmol/L)与细胞在37℃条件下反应30分钟，在激光共聚焦显微镜下测定细胞内自由基含量。可见H/R可显著诱导自由基的产生，镜下可见荧光探针强度明显增强，GS治疗组荧光强度则明显降低，也就是GS可显著抑制细胞内增高的自由基水平。
以裂解液制备细胞裂解物，用bradford方法鉴定蛋白含量。应用南京建成生物工程研究所生产试剂盒，比色法测定脂质过氧化产物戊二醛(MDA)水平。结果可见，GS也可降低受损神经元内异常升高的MDA，说明抗氧化作用可能是GS对神经细胞保护作用的机制之一。
同时，应用南京建成生物工程研究所生产试剂盒，我们还检测了神经元内总超氧化物歧化酶(SOD)及Mn-SOD活性。我们发现GS可明显增加神经元内SOD及Mn-SOD活性，而对Cu-Zn SOD活性并没有明显作用，这证明Mn-SOD可能是GS发挥其抗氧化作用的关键酶，通过增加Mn-SOD的活性而增强神经细胞的抗氧化能力(详见图2)。
用抗p65单克隆抗体标记细胞内核转录因子NF-κB，用免疫荧光的方法在激光共聚焦显微镜下对NF-κB进行定位观察。可见在正常情况下NF-κB基本定位于细胞浆内，而在缺氧12小时复氧45分钟时，NF-κB则大量向细胞核内转位，应用GS则明显拮抗了NF-κB的活化及核转位。
制备细胞裂解液，用Western blot的方法检测NF-κB特异性抑制物I-κB的表达水平。特异性一抗应用浓度为1∶100，二抗应用浓度用1∶1000。实验发现H(12h)/R(45min)可增加I-κB的降解，而GS可抑制此变化。因此我们认为GS通过抑制I-κB的降解进而抑制了NF-κB的活化和核转位。
制备细胞裂解液，并应用ELISA试剂盒，按照试剂盒说明方法检测炎性细胞因子TNFα和IL-1β在细胞内的表达水平，发现H/R可显著升高TNFα和IL-1β的水平，而GS可抑制此变化。
因为NF-κB是多种细胞因子表达的关键调控因子，所以我们推测GS可能通过抑制NF-κB的活化而影响TNFα和IL-1β的表达，从而抑制了炎性细胞因子对神经元的免疫损伤。又因为有实验证明SOD可抑制NF-κB的活化，所以我们推测Mn-SOD可能是GS对H/R损伤细胞发挥保护作用的关键作用位点，进而从抗氧化和抗免疫两个机制对抗H/R损伤。
(二)灵芝甾醇提纯物(24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇，GSP)
对大鼠大脑皮层神经元缺氧再氧化损伤的保护作用
采用进一步纯化的甾醇类提纯物(24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇，GSP)代替上述(一)实验中的灵芝甾醇提取物进行试验，得出如下结果。
应用H/R损伤建立的脑缺血再灌注体外模型，我们对此提纯物的药效学及药理学进行了初步探讨。
应用MTT法测定细胞的存活率和细胞代谢情况(详见图3)，可以发现GSP对受损细胞有明显保护作用，可明显增加神经元的存活率(详见图4)。应用荧光探针DCF-DA特异性标记细胞内自由基，在激光共聚焦显微镜下测定细胞内自由基含量，可见GSP可显著抑制H/R模型组细胞内增高的自由基水平，证明抗氧化作用可能是GSP对神经细胞保护作用的机制之一。
我们发现与相同质量的GS相比，GSP对神经元的保护作用及抑制自由基产生作用均具有更加显著的效果。说明从GS中纯化GSP的方法有效地保护了其中具有神经保护作用的成分，并可以因此减少用药剂量和可能的副作用。
Claims (11)
1、灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，包括如下依序进行的步骤：
(1)提供一种灵芝作为原料母体；
(2)破碎该原料母体而得破碎物；
(3)用乙醇对破碎物进行回流提取4～10h、离心而得提取液；
(4)将提取液浓缩至浓缩液中含生药量0.5～1.5g/ml，静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗提物；
(5)将粗提物用热乙醇溶解，提取溶解液并静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗结晶；
(6)将粗结晶用乙醇稀碱溶液处理16～48小时，收集不溶物，
(7)将不溶物用浓碱溶液碱化24h，过滤，收集滤液；
(8)用等量乙醚对滤液进行萃取并收集乙醚层；
(9)将乙醚层用水洗至中性，进行干燥，待乙醚挥发完全后所得固体物即为甾醇类提取物，所述甾醇类提取物的主要成分为白色片状结晶24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇，分子式C28H46O，其化学结构式如下：
2、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，所述的灵芝甾醇类提取物还包括次要成分，所述的次要成分为白色结晶胆甾-5，7-二烯-3β醇，其化学结构式如下：
3、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，乙醇对破碎物进行回流提取甾醇化合物的最佳时间为5～6小时。
4、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，乙醇与破碎物的重量比为10∶1。
5、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，乙醇稀碱溶液的提供为在乙醇溶液中加入1％KOH或1％NaOH溶液。
6、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，浓碱溶液为12％KOH。
7、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，所述权利要求1方法步骤(3)中的乙醇、步骤(6)中的乙醇稀碱溶液或用氯仿，或用甲醇，或用苯代替。
8、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，对提取液进行浓缩的步骤为：
(1)提供一种旋转蒸发仪，
(2)将提取液导入旋转蒸发仪中，转速98r/min，
(3)直至浓缩液含生药量0.5～1.5g/ml，静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗提物。
9、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，将粗提物用热乙醇溶解的步骤细化为：
(1)用热乙醇溶解粗提物，
(2)分别收集溶解液及不溶物，
(3)将不溶物用热乙醇溶解，
(4)重复(2)～(3)步骤多次，
(5)收集所有溶解液并静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗结晶。
10、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，对乙醚层干燥的具体步骤为：
(1)将乙醚层用水洗至中性，
(2)用无水Na2SO4将水份吸干并使乙醚挥发完全后得固体物。
11、根据权利要求1所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法，其特征在于，所述的灵芝甾醇类提取物的制备方法还包括分离甾醇类提取物的不同成份，其具体步骤如下：
(1)提供一种层析柱，固定相硅胶，流动相石油醚与乙酸乙酯混合液，
(2)先用石油醚将硅胶填入层析柱，
(3)将溶解液加少量硅胶混合，常温去除溶剂而得固体物，
(4)将固体物装入色层析顶，滴加石油醚与乙酸乙酯混合液梯度洗脱而使各组份分离，
(5)用自动分段收集器分段收集分离液，
(6)对各种分离液进行薄层分析、跟踪检测，合并同类，所用展开剂石油醚与乙酸乙酯的重量比为7∶3，显色剂1％香兰醛-硫酸；
(7)对同类分离液进行浓缩。
(8)提供一种乙醚∶冰醋酸＝1∶1的混合液；
(9)将步骤(7)的浓缩液中加入等量的步骤(8)的混合液，静置，收集析出的白色片状结晶分别为主要成份灵芝甾醇类提纯物24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇和次要成份胆甾-5，7-二烯-3β醇。
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