CN103599145A - 铁筷子提取物及其中有效成分的分离方法和所得化合物 - Google Patents

铁筷子提取物及其中有效成分的分离方法和所得化合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了铁筷子提取物及其中有效成分的分离方法和所得化合物，所述铁筷子提取物是将铁筷子药材分别用6-8倍量95%乙醇、50%乙醇各提取2-4次，合并所有提取液，浓缩干燥，然后加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩、干燥而得。本发明经实验研究发现，铁筷子药材乙醇提取浸膏中乙酸乙酯萃取部位有较好的镇痛和抗炎作用，可将其用于制备抗炎镇痛的药物；并从该乙酸乙酯萃取部位分离得到17个化合物，其中有2个新化合物，12个化合物为铁筷子中首次分离得到，为铁筷子药材以及含有铁筷子的成药制剂建立含量测定项目奠定了基础，有利于提升铁筷子药材的质量标准及质量可控性，从而为铁筷子的进一步开发利用奠定了基础。

Description

铁筷子提取物及其中有效成分的分离方法和所得化合物
技术领域
本发明涉及铁筷子提取物及其中有效成分的分离方法和所得化合物，属于中药有效成分的提取分离技术领域。
背景技术
铁筷子为蜡梅科蜡梅属植物蜡梅Chimonanthus praecox(L.)link.及山蜡梅Chimonanthusnitens oliv.的干燥细根，为贵州省苗药，收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，又名岩马桑，臭蜡梅，野蜡梅等，具清热解毒、活血散癖、消肿止痛之功效，主治哮喘，劳伤咳嗽，胃痛，膀肮炎、尿道炎、疮疖肿毒及跌打损伤等症。记载始于《救荒本草》，谓：“多生南方，今北土亦有之。其树枝条颇似季，其叶似桃叶而宽大，纹微粗，开淡黄花。”《纲目》始载入药，曰：“解暑，生津。”对其描述为：“蜡梅小树，丛枝尖叶。……腊月开小花而香淡。”可见铁筷子用药历史悠久。贵州省少数民族多用于治疗风湿骨痛，跌打损伤等。目前已有贵州药企已将铁筷子运用到骨伤类疾病和风寒感冒的治疗当中，例如贵州民族药厂生产的风寒感冒胶囊、贵阳新天药业股份有限公司生产的生龙驱风药酒、贵州恒霸药业有限责任公司生产的伤科灵喷雾剂等都已在市场上销售。
由于《贵州省中药材、民族药材质量标准》中铁筷子仅有显微鉴别和薄层鉴别两项，未建立含量测定项，质量可控性较差。为了促进民族药相关科研基础工作及利用开发，本课题对铁筷子化学成分进行了系统研究，通过药理实验筛选铁筷子有效部位并分离其中化学成分，选取分离得到的有效成分作为对照品，可建立含量测定方法，为含有铁筷子的成药制剂或正在研制的成药制剂的质量控制提供科学依据，这对药材质量标准的提升和进一步研究以及推广使用有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种铁筷子提取物及其制备方法，以及该提取物中有效成分的分离方法和所得化合物。本发明通过实验筛选出苗药铁筷子抗炎镇痛活性最佳有效部位，并从该最佳有效部位分离得到17个化合物，为铁筷子药材以及含有铁筷子的成药制剂建立含量测定项目奠定了基础，有利于提升铁筷子药材的质量标准及质量可控性。
本发明的技术方案：一种铁筷子提取物，是将铁筷子药材分别用6-8倍量95%乙醇、50%乙醇各提取2-4次，合并所有提取液，浓缩干燥，然后加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩、干燥而得。
上述铁筷子提取物的制备方法：取铁筷子药材，粉碎成粗粉，用6-8倍量95%乙醇提取2-4次，每次1-3h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再用6-8倍量50%乙醇提取2-4次，每次1-3h，得50%乙醇提取液；合并所有提取液，减压浓缩，回收溶剂，干燥，然后加入适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3～5次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层浸膏，干燥即得。
优选的制备方法为：取铁筷子药材，粉碎成粗粉，分别用8倍量、6倍量、6倍量95%乙醇提取3次，每次2h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再分别用8倍量、6倍量、6倍量50%乙醇提取3次，每次2h，得50%乙醇提取液；合并所有提取液，减压浓缩，回收溶剂，70℃低温真空干燥，然后加入适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3～5次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层浸膏，干燥即得。
如上所述铁筷子提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。
如上所述铁筷子提取物中有效成分的分离方法：将铁筷子提取物加入甲醇溶解分散，用40～80目硅胶拌样，采用200～300目硅胶柱层析分离样品，用氯仿-甲醇=100:0～0:100混合溶剂梯度洗脱，洗脱组分通过薄层层析展开，在紫外检测仪下观察，再通过5%磷钼酸溶液或5%浓硫酸-乙醇溶液浸润后高温烘烤显色观察，合并相似组分，根据洗脱溶剂氯仿-甲醇的极性将乙酸乙酯萃取部位共分成7个段（1-7段对应的洗脱溶剂分别为氯仿-甲醇=100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50、0:100），第6段放置后析出晶体，得化合物5（ZY-5）；第3段经中压制备色谱，以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100梯度洗脱，再经结晶和重结晶得化合物1（ZY-1），合并此段其余组分（除化合物1之外的组分）后分为3个次组分，再通过硅胶柱层析以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100反复洗脱，得化合物2（ZY-2）、化合物3（ZY-3）、化合物4（ZY-4）；第4段通过300～400目硅胶柱色谱，以不同比例石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇系统反复柱层析，得化合物7（ZY-7）、化合物8（ZY-8）、化合物9（ZY-9）、化合物10（ZY-10）、化合物11（ZY-11）、化合物12（ZY-12）、化合物13（ZY-13）、化合物14（ZY-14）、化合物16（ZY-16）、化合物17（ZY-17）、化合物18（ZY-18）、化合物19（ZY-19）。
前述分离方法中，拌样所用40～80目硅胶为铁筷子提取物重量的1.75倍。
前述分离方法中，采用200～300目硅胶柱层析分离时，装柱硅胶为铁筷子提取物重量的10倍。
采用前述分离方法从铁筷子提取物中分离得到的化合物9，其分子式为C19H30O6，结构式为
Figure BDA0000404087720000031
采用前述分离方法从铁筷子提取物中分离得到的化合物16，其分子式为C17H28O5，结构式为
本发明技术方案的得出，是以申请人所进行的一系列试验研究为基础的，主要研究内容如下：
一、铁筷子抗炎镇痛活性最佳有效部位的筛选
1.1实验材料
1.1.1药材
铁筷子药材购于贵阳万东桥药材市场，采自黔东南，由贵阳中医学院生药教研室王祥培教授鉴定为蜡梅科植物蜡梅Chimonanthus praecox(L.)link.的根茎。标本保存于贵阳中医学院中心实验室。
1.1.2受试药物的制备
取铁筷子药材粗粉350g，粉碎成粗粉，分别用8倍量、6倍量、6倍量95%乙醇提取3次，每次2h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再用50%乙醇按以上用量提取三次，最后合并前后提取液，减压浓缩，回收溶剂，得流浸膏，然后置于真空干燥箱中以70℃低温真空干燥，得到浸膏52.9g。
加入适量水分散浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种溶剂反复萃取，每种溶剂萃取3～5次，减压浓缩萃取溶液，得到石油醚部位浸膏3.5g(1%得膏率，每克相当于原药材100g)，乙酸乙酯部位浸膏7.9g(2.3%得膏率,每克相当于原药材44.3g)，正丁醇部位浸膏18.9g(5.4%得膏率，每克相当于原药材18.5g)和水溶性部位浸膏21.7g(6.2%得膏率，每克相当于原药材16.1g)。以成人(60kg)生药服用量的40倍作为高剂量，20倍作为低剂量，并根据各个部位得膏率计算相应取药量，加适量水配置药液。水难溶的部位用吐温-80溶剂助溶，或配置成混悬液。
1.1.3实验动物
清洁级昆明种小鼠，6～8周龄，体重18～22g，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK（黔2002-0001），适应饲养3天后供试。
1.1.4实验药品
阿司匹林肠溶片，舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：101102。
1.2实验方法
1.2.1铁筷子各萃取部位对醋酸引起的扭体反应的影响
取小鼠100只，随机分为10组，每组10只，分别作为空白对照组，阳性对照组，石油醚部位高、低剂量组，乙酸乙酯部位高、低剂量组，正丁醇部位高、低剂量组和水部位高、低剂量组。以灌胃方式给药，连续给药3天，每天2次，最后一次给药后1h，腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.2ml/只，观察20min内扭体次数，计算镇痛率，结果见表1。
镇痛率(%)=(对照组扭体次数-给药组扭体次数)/对照组扭体次数×100%
表1醋酸扭体试验
组别 剂量(mg/kg) 扭体次数 镇痛率(%)
空白对照 — 13.2±4.8 —
阿司匹林 100 3.3±3.1** 75.0
石油醚部位(高) 30 9.5±8.0 28.0
石油醚部位(低) 15 7.9±6.1* 40.2
乙酸乙酯部位(高) 69 6.6±5.5** 50.0
乙酸乙酯部位(低) 34.5 8.1±7.7 38.6
正丁醇部位(高) 162 — —
正丁醇部位(低) 81 — —
水部位(高) 186 11.3±6.6 14.4
水部位(低) 93 11.2±5.0 15.2
与空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明乙酸乙酯高剂量组镇痛效果最佳。
1.2.2铁筷子各萃取部位对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
取小鼠100只，随机分为10组，每组10只，分别作为空白对照组，阳性对照组，石油醚部位高、低剂量组，乙酸乙酯部位高、低剂量组，正丁醇部位高、低剂量组和水部位高、低剂量组。以灌胃方式给药，连续给药3天，每天2次，最后一次给药后1h，在小鼠右耳正反面均匀涂布二甲苯溶液0.03ml/只，左耳作为空白对照不处理。40min后通过脱颈处死小鼠，在左右耳同一位置用8mm打孔器打下，去除耳片，使用分析天平称取重量，以重量差值为肿胀度，计算肿胀抑制率，见表2。
肿胀抑制率(%)=[(空白对照组耳片重差-给药组耳片重差)/空白对照组耳片重差]×100%
表2耳肿胀的试验
组别 剂量(mg/kg) 耳肿胀度(mg) 肿胀率抑制(%)
空白对照 — 16±2.5
阿司匹林 500 10±4.8** 37.5
石油醚部位(高) 30 15±3.8 6.3
石油醚部位(低) 15 13±2.9 18.8
乙酸乙酯部位(高) 69 10±5.2* 37.5
乙酸乙酯部位(低) 34.5 12±4.2 25.0
正丁醇部位(高) 162 — —
正丁醇部位(低) 81 — —
水部位(高) 186 10±4.4** 37.5
水部位(低) 93 9±2.9** 43.8
与空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果表明乙酸乙酯高剂量组和水低剂量组效果最佳。
1.3结果与讨论
通过实验表明，铁筷子浸膏各给药组与空白对照组比较，均有一定的镇痛和抗炎作用。其中乙酸乙酯部位高剂量组镇痛效果最佳，石油醚部位低剂量组次之；水部位低剂量组抗炎作用最佳，乙酸乙酯部位高剂量组次之。说明铁筷子药材乙醇提取的浸膏中乙酸乙酯萃取部位有较好的镇痛和抗炎作用。
二、铁筷子乙醇提取乙酸乙酯萃取部位化学成分的分离
2.1实验仪器及材料
Rudolphresearch Analitycal旋光仪(美国)；质谱仪(美国HP-5973型质谱仪)。核磁共振谱(1H-NMR，13C-NMR，DEPT及2D-NMR)均在INOVA-400核磁共振仪上测定(TMS为内标)；柱层析用硅胶(200-300、300-400、40-80目，H)、薄层层析用硅胶(GF254)及GF25薄层层析板均为青岛海洋化工厂分厂产品。Sephadex LH-20(25-100μm)为AmershamBiosciences公司产品(瑞典)。薄层层析板通过UV-254和UV-365nm观察色谱行为，薄层层析板通过碘蒸气、5%硫酸-乙醇溶液、以及5%磷钼酸-乙醇溶液显色观察其斑点。所有化学溶剂均为工业级重蒸，氘代试剂购买于武汉中兴科技公司。
2.2药材
铁筷子药材购于贵阳万东桥药材市场，采自黔东南，由贵阳中医学院生药教研室王祥培教授鉴定为蜡梅科植物蜡梅Chimonanthus praecox(L.)link.的根茎。标本保存于贵阳中医学院中心实验室。
2.3提取分离
2.3.1总浸膏提取
铁筷子根茎约10kg，粉碎成粗粉后用95%乙醇提取3次，第1次8倍量乙醇，2、3次6倍量；每次2小时，合并滤液，放置；再将药渣用50%乙醇以相同步骤提取，合并两次提取液，减压浓缩得总浸膏。加入适量水分散，然后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯层浸膏约212g，具体流程如图1。
2.3.2乙酸乙酯层分离
取乙酸乙酯层浸膏200g，加入适量甲醇溶解分散，用约350g硅胶(40～80目)拌样。采用硅胶(200～300目)柱层析分离样品，装柱硅胶约为样品10倍量，用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿:甲醇=100:0～0:100)，洗脱组分通过薄层层析展开，在紫外检测仪下观察组分情况，再通过5%磷钼酸溶液或5%浓硫酸-乙醇溶液浸润后高温烘烤显色观察，合并相似组分，根据洗脱溶剂氯仿-甲醇的极性将乙酸乙酯萃取部位共分成7个段(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6和Fr.7，对应的洗脱溶剂分别为氯仿:甲醇=100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50、0:100)。Fr.6放置中析出晶体得到ZY-5（氯仿-甲醇=5:1）。Fr.3经中压制备色谱，以石油醚-乙酸乙酯（100:0～0:100）梯度洗脱，再经结晶和重结晶得到ZY-1，合并此段其余组分后分为3个次组分，再通过硅胶柱层析（石油醚-乙酸乙酯）反复洗脱，得到ZY-2、ZY-3、ZY-4。Fr.4通过硅胶柱色谱（300～400目），以不同比例石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇系统反复柱层析，得到ZY-7、ZY-8、ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18、ZY-19，分离流程见图2。
2.4化合物结构鉴定
2.4.1新化合物结构鉴定
化合物ZY-9无色油状，ESI-MS m/z377.2[M+Na]+，731.5[2M+Na]+确定分子量为354，结合1HNMR和13C-NMR信息，推测该化合物的分子式为C19H30O6，不饱和度为5。从1HNMR谱中，δ2.04(3H,s)，δ2.05(3H,s)为2个酰基质子信号特征峰，δ0.68(3H,d,J=6.8Hz)，δ0.94(3H,d,J=6.8Hz)为异丙基质子信号特征峰，δ2.22(3H,s)为连接羰基碳的甲基质子信号峰，δ1.34(3H,s)为1个甲基质子信号。13C-NMR谱图显示19个碳信号，其中δ210.7ppm为酮羰基特征信号，δ170.0ppm和δ170.9为酯羰基特征信号；排除2个酰基的4个碳信号，剩余15个碳信号，推测该化合物为倍半萜类物质。根据DEPT谱显示，该化合物含有7个CH，2个CH2，6个CH3，4个季碳，其中没有双键碳信号，结合不饱和度，排除羰基和两个酰基，推测该化合物为二环结构，其基本骨架的图谱数据与文献报道化合物1β,4α,11-oppositanetriol相似。根据HMBC图谱，酮羰基碳与H-15和H-5，H-6，H-7均有相关，表明羰基与C-6相连；两个酯羰基分别与H-2，H-3相关，表明其分别与C-2，C-3相连；C-4分别与H-12，H-13相关，说明异丙基与C-4相连；C-10与H-9，H-2相关，表明C-1连有一个CH3。根据Roesy图谱可观察到H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-5、H-5/H-6、H-9/H-2存在信号增益。由此该化合物鉴定为ZY-9，经SCIFINDER数据库检索后证实为新化合物。化合物位置编号及主要HMBC相关如下：
Figure BDA0000404087720000071
化合物ZY-16无色油状，ESI-MS m/z335.2[M+Na]+，647.3[2M+Na]+确定分子量为312，结合1HNMR和13C-NMR信息，推测该化合物的分子式为C17H28O5，不饱和度为4。1HNMR谱中显示，δ2.07(3H,s)为1个乙酰基质子信号特征峰，δ0.71(3H,d,J=6.8Hz)，δ0.96(3H,d,J=6.8Hz)为异丙基质子信号特征峰，δ2.22(3H,s)为连接羰基碳的甲基质子信号峰，δ1.27(3H,s)为1个甲基质子信号。13C-NMR谱图显示17个碳信号，其中δ210.9ppm为酮羰基特征信号，δ171.9为酯羰基特征信号；排除1个酰基的2个碳信号，剩余15个碳信号，推测该化合物为倍半萜类物质。根据DEPT谱显示，该化合物含有7个CH，2个CH2，5个CH3，3个季碳，其中没有双键碳信号，结合不饱和度，排除羰基和酰基的不饱和度，推测该化合物为二环结构，其基本骨架的图谱数据与文献报道化合物1β,4α,11-oppositanetriol相似。根据HMBC图谱，酮羰基碳与H-15和H-5，H-6，H-7均有相关，表明羰基与C-6相连；酯羰基碳与H-3相关，表明其C-3相连；C-4分别与H-12，H-13相关，说明异丙基与C-4相连；C-10与H-9，H-2相关，表明C-1连有一个CH3。根据Roesy图谱可观察到H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-5、H-5/H-6、H-9/H-2存在信号增益。由此该化合物鉴定为ZY-16，经SCIFINDER数据库检索后证实为新化合物。化合物位置编号及主要HMBC相关如下：
Figure BDA0000404087720000072
2.4.2已知化合物结构鉴定
化合物ZY-1黄色针状晶体(甲醇)，分子式:C11H10O5，mp147～148℃，紫外灯下观察(365nm)呈蓝色荧光。ESI-MS确定其分子量为222。1H-NMR谱中，δ6.22(1H，d)和δ7.84(1H，d)存在可推测该化合物为3，4位未被取代的香豆素类化合物，δ6.91(1H，s)为苯环质子信号，δ3.89(3H，s)和δ3.94(3H，s)为两个甲氧基质子信号。13C-NMR谱给出11个碳信号，其中δ55.8、δ60.6为甲氧基碳信号，δ160.1为羰基碳信号，由此可推测该化合物为苯环上含有三个连氧取代的香豆素类化合物。以上理化性质和波谱数据与文献基本一致，故鉴定该化合物为6，8-二甲氧基-7-羟基香豆素，即异嗪皮啶。
Figure BDA0000404087720000082
化合物ZY-2白色针状结晶(石油醚-乙酸乙酯)，分子式:C29H50O，mp137～139℃，通过ESI-MS确定分子量为414。从1H-NMR谱中看，该化合物吸收峰具有甾体类化合物的特征，δ0.78～2.27之间出现一系列吸收峰，表明甾体化合物骨架上的-CH2和-CH质子信号相互重叠，δ0.68和δ1.01分别为C18和C19上的质子信号。将该化合物与β-谷甾醇对照品通过薄层色谱同时展开Rf相同，且测混合熔点不下降。该化合物的1H-NMR谱数据与文献数据基本一致，故该化合物鉴定为β-谷甾醇。
Figure BDA0000404087720000083
化合物ZY-3白色簇晶(丙酮)，mp105～106℃，分子式:C12H12O5，该化合物在紫外灯下观察(365)有强烈蓝紫色荧光。EI-MS确定其分子量为236。1HNMR谱中:δ6.35(1H，d)和δ7.62(1H，d)的存在可推测该化合物为3，4位未被取代的香豆素类化合物，δ6.68(1H，s)为苯环质子信号，δ3.90(3H，s)，δ4.00(3H，s)和δ4.04(3H，s)为三个甲氧基质子信号。以上理化性质和波谱数据与文献数据基本一致，故鉴定该化合物为6，7，8-三甲氧基香豆素。
Figure BDA0000404087720000091
化合物ZY-4白色簇晶(丙酮)，分子式C10H10O4，mp151.5～153℃，紫外灯下无荧光。EI-MS确定其分子量为194。1HNMR谱中:δ6.64(1H，s)和δ6.67(1H，s)为苯环质子信号特征峰，δ3.88(3H，s)为甲氧基质子信号，δ2.75(2H,t),2.92(2H,t)推测为香豆素内酯环双键被取代后的4个氢信号；13C-NMR谱给出11个碳信号，其中δ56.4为甲氧基碳信号，δ168.8为羰基碳信号。以上理化性质和波谱数据与文献基本一致，故鉴定该化合物为7-hydroxy-6-methoxychroman-2-one。
Figure BDA0000404087720000092
化合物ZY-5淡黄色粉末，分子式为C17H20O10，mp218.0～219.0℃。紫外灯下(254nm)显示紫色荧光，Molish反应呈紫色环，EI-MS确定其分子量为384。1HNMR谱中:δ6.35(1H，d)和δ7.62(1H，d)的存在可推测该化合物苷元部分为3，4位未被取代的香豆素母核，δ7.015(1H，s)为香豆素母核上苯环的质子信号，3.89(3H，s)和4.02(3H，s)为苯环上两个甲氧基质子信号；13C-NMR谱中δ160.4，150.0，144.0，143.6，143.1，135.7，115.3，115.1，105.5为香豆素母核上的9个碳信号，δ62.5，56.8为两个甲氧基碳信号，另有104.0，79.2，78.5，75.9，71.6，61.8为葡萄糖基6个碳信号。以上理化性质和波谱数据与文献基本一致，故鉴定为异嗪皮啶-7-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物ZY-7黄色针晶(丙酮)，mp202～203℃，分子式为C10H8O4，紫外灯下(365nm)呈亮蓝色荧光，EI-MS m/z确定其分子量为192。1HNMR谱中:δ6.17(1H，d)和δ7.82(1H，d)的存在推测该化合物为3，4位未被取代的香豆素类化合物，δ3.89(3H，S)为甲氧基质子信号，δ6.73(1H，S)和δ7.09(1H，S)为苯环上质子信号特征峰；13C-NMR谱给出11个碳信号，其中δ56.6为甲氧基碳信号，δ164.1为羰基碳信号。以上理化性质和波谱数据与文献基本一致，故推断该化合物为东莨菪内酯。
Figure BDA0000404087720000101
化合物ZY-8无色油状，ESI-MS:m/z275.3[M+Na]+,527.3[2M+Na]+,确定分子量为252，结合1HNMR和13C-NMR信息，推测该化合物的分子式为C15H24O3，不饱和度为4。从1HNMR谱中，δ0.76(3H,d,J=6.8Hz)，δ0.88(3H,d,J=6.4Hz)两个特征信号表明有一个异丙基，δ1.45(3H,s)，δ2.10(3H,s)为2个甲基质子信号。13C-NMR谱图呈现15个碳信号，推测该化合物为倍半萜类物质，其中δ198.7和δ209.5为2个酮羰基信号特征峰，δ138.9和δ150.7为双键碳信号。根据DEPT谱显示该化合物含有2个CH2，7个CH，5个CH3，4个季碳，根据不饱和度计算，去除2个酮羰基和1个双键信号，剩余1个不饱和度表明此化合物为一个单环结构。根据HMBC图谱，H-14，H9，H-8与C-10相关，H-2，H-3，H-5与C-1相关，表明两个酮羰基碳分别位于C-1和C-10位；H-8，H-7与C-11相关，表明异丙基与C-7相连。该化合物的相关图谱数据与文献基本相近，说明二者结构近似，目前正在通过振动圆二色谱法测定并计算其绝对构型。
Figure BDA0000404087720000102
化合物ZY-10无色油状，ESI-MS:m/s275.3[M+Na]+,527.3[2M+Na]+,确定分子量为252，结合1HNMR和13C-NMR信息，推测该化合物的分子式为C15H24O3，不饱和度为4。从1HNMR谱中，δ0.77(3H,d,J=6.4Hz)，δ0.86(3H,d,J=6.4Hz)两个特征信号表明有一个异丙基，δ1.46(3H,s)，δ2.09(3H,s)显示为2个甲基质子信号。13C-NMR谱图呈现15个碳信号，推测该化合物为倍半萜类物质，其中δ198.7ppm和δ210.1ppm为两个酮羰基信号，δ139.1ppm和δ150.0ppm为双键碳信号。根据DEPT谱显示化合物含有2个CH2，7个CH，5个CH3，4个季碳，根据不饱和度计算，去除2个酮羰基和1个双键信号，剩余1个不饱和度表明此化合物为一个单环结构。根据HMBC图谱，H-14，H9，H-8与C-10相关，H-2，H-3，H-5与C-1相关，表明两个酮羰基碳分别位于C-1和C-10位；H-8，H-7与C-11相关，表明异丙基与C-7相连。该化合物的相关图谱数据与文献基本相近，说明二者结构近似，目前正在通过振动圆二色谱法测定并计算其绝对构型。
Figure BDA0000404087720000111
化合物ZY-11无色油状，分子式为C14H22O3，不饱和度为4。EI-MS m/z确定其分子量为238。1HNMR谱中δ0.91(3H，d)和δ1.06(3H，d)为异丙基质子信号特征峰，δ1.23(3H，s)为一甲基质子信号峰。δ4.16(1H，br s)为C-4上羟基质子信号。13C-NMR谱给出14个碳信号，δ199.9为羰基碳信号，δ132.4和δ157.6为双键碳信号。DEPT谱中可以看出含有3个-CH，4个-CH2，3个-CH3和4个季碳，根据不饱和度计算，去除1个酮羰基和1个双键信号，剩余2个不饱和度表明此化合物为双环结构。以上波谱数据与文献基本一致，故该化合物鉴定为Oxyphyllenodiols A。
Figure BDA0000404087720000112
化合物ZY-12白色簇晶(石油醚-乙酸乙酯)，分子式为C9H10O5。EI-MS m/z确定其分子量为198。1HNMR谱中δ3.85(6H，s)表明有两个甲基质子信号重叠。δ7.30(2H，s)为苯环上两个质子特征信号峰。以上波谱数据与文献报道一致，故鉴定为丁香酸。
Figure BDA0000404087720000113
化合物ZY-13无色油状，分子式为C15H26O2，不饱和度为3。EI-MS m/z确定其分子量为238。1HNMR谱中δ0.86(3H，d)和δ0.99(3H，d)为异丙基质子信号特征峰，δ1.23(3H，s)，δ1.81(3H，s)为2个甲基质子信号峰。13C-NMR谱给出15个碳信号，δ134.0和δ129.7为双键碳信号。DEPT谱中可以看出含有6个-CH，3个-CH2，4个-CH3和2个季碳，根据不饱和度计算，去除1个双键信号，剩余2个不饱和度表明此化合物为双环结构。并且与文献报道一致，故鉴定此化合物为(1R,3R,6S,7R,10S)-7-Isopropyl-4,10-dimethylbicyclo[4.4.0]-dec-4-ene-3,10-diol。
化合物ZY-14无色油状，分子式为C14H22O3，不饱和度为4。EI-MS m/z确定其分子量为238。1HNMR谱中δ0.86(3H，d)和δ1.04(3H，d)为异丙基质子信号特征峰，δ1.27(3H，s)为一甲基质子信号峰。δ3.97(1H，br s)为C-4上羟基质子信号。13C-NMR谱给出14个碳信号，δ200.1为羰基碳信号，δ133.4和δ156.7为双键碳信号。DEPT谱中可以看出含有3个-CH，4个-CH2，3个-CH3和4个季碳，根据不饱和度计算，去除1个酮羰基和1个双键信号，剩余2个不饱和度表明此化合物为双环结构。以上波谱数据与文献报道一致，故鉴定此化合物为Oxyphyllenodiols B。
化合物ZY-17淡黄色针状晶体(丙酮)，mp145～147℃，分子式为C11H12O4，该化合物在紫外灯下(365nm)显强烈蓝色荧光。EI-MS m/z确定其分子量为206。1H-NMR谱中δ6.27(1H，d)和δ7.62(1H，d)的存在可推测该化合物有3，4位未被取代的香豆素母核，δ3.92和δ3.95表明为两个甲氧基质子信号。13C-NMR谱给出10个碳信号，δ161.5为羰基碳特征信号，δ56.4为2个甲氧基碳信号重叠。以上理化常数和光谱数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物为6，7-二甲氧基香豆素。
Figure BDA0000404087720000123
化合物ZY-18无色油状，分子式为C15H26O，不饱和度为3。EI-MS m/z确定其分子量为222。1HNMR谱中δ0.79(3H，d)和δ0.92(3H，d)为异丙基特征信号峰，δ1.22(3H，s)和δ1.67(3H，s)为2个甲基质子信号。13C-NMR谱给出15个碳信号，推测为倍半萜类化合物，δ122.6和δ134.4为双键碳信号，δ19.1，δ21.5和δ21.8为3个甲基碳信号。DEPT谱中可以看出有5个-CH，4个-CH2，4个-CH3和2个季碳，根据不饱和度计算该化合物应该为2环结构。其波谱数据与文献基本一致，故该化合物鉴定为t-cadinol。
Figure BDA0000404087720000131
化合物ZY-19淡黄色簇晶(氯仿)，mp94.0～96.5℃；分子式为C29H48O；EI-MS m/z:412[M+，39]，398(8)，370(11)，289(18)，271(12)，245(6)，229(34)，149(24)，124(100)，107(24)，95(31)，81(28)，69(28)，55(51)，43(57)。计算机通过物碎片信息直接检索出化合物，其1H和13C谱信息与文献基本一致，故鉴定为豆甾-4-烯-3-酮。
Figure BDA0000404087720000132
2.4.3化合物理化常数与波谱数据
化合物ZY-1异秦皮啶mp147～148℃;ESI-MS m/z:222[M]+;1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ:3.89(3H,s,6-OCH3),3.94(3H,s,8-OCH3),6.22(1H,d,J=9.6Hz,H-3),6.91(1H,s,H-5),7.84(1H,d,J=9.6Hz,H-4);13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ:55.8(6-OCH3),60.6(8-OCH3),104.1(C-5),110.9(C-4a),112.6(C-3),134.9(C-8),143.5(C-7),143.9(C-8a),144.3(C-4),145.6(C-6),160.1(C-2)。
化合物ZY-2β-谷甾醇mp137～139℃,ESI-MS m/z:414[M]+;1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.68(3H,s,CH3),0.78(3H,s,CH3),0.83(3H,s,CH3),0.89(3H,s,CH3),0.93(3H,s,CH3),1.01(3H,s,CH3),3.50～3.56(1H,m,H-3),5.35(1H,d,J=8Hz,H-6)。
化合物ZY-36,7,8-三甲氧基香豆素mp105～106℃,EI-MS m/z:236[M]+,221,207,193,178,150;1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:3.90(3H,s,6-OCH3),4.00(3H,s,7-OCH3),4.04(3H,s,8-OCH3),6.35(1H,d,J=9.6Hz,H-3),6.68(1H,s,H-5),7.62(1H,d,J=9.6Hz,H-4)。
化合物ZY-47-hydroxy-6-methoxychroman-2-one mp151.5～153℃,EI-MS m/z:194[M]+,179,152,151,137,81,69,53;1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:2.74～2.77(2H,m,H-3),2.90～2.94(2H,m,H-4),3.88(3H,s,6-OCH3),6.64(1H,s,H-5),6.67(1H,s,H-8);13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ:23.5(C-3),29.4(C-4),56.4(6-OCH3),104.1(C-8),109.8(C-5),113.1(C-4a),143.3(C-6),143.4(C-7),146.0(C-8a),168.8(C=O)。
化合物ZY-5异嗪皮啶-7-O-β-D-葡萄糖苷mp218.0～219.0℃,EI-MS m/z:384[M]+;1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ:3.89(3H,s,6-OCH3),4.02(3H,s,8-OCH3),6.36(1H,d,J=9.6Hz,H-3),7.02(1H,s,H-5),7.89(1H,d,J=9.6Hz,H-4),5.20(1H,d,J=7.6Hz,H-1′),3.22(1H,m,H-2′),3.34(1H,m,H-3′),3.49(1H,m,H-4′),3.50(1H,m,H-5′),3.63(1H,m,H-6′a),3.77(1H,dd,J=2,12Hz,H-6′b);13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ:160.4(C-2),115.1(C-3),144.0(C-4),115.3(C-4a),105.5(C-5),150.0(C-6),143.1(C-7),143.6(C-8),135.7(C-8a),62.5(8-OCH3),56.8(6-OCH3),104.0(C-1′),75.9(C-2′),78.5(C-3′),71.6(C-4′),79.2(C-5′),61.8(C-6′)。
化合物ZY-7东莨菪内酯mp202～203℃,EI-MS m/z:192[M]+,177,164,149,121,107,92,79,69,51;1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:3.89(3H,S,6-OCH3),6.17(1H,d,J=9.4Hz,H-3),6.73(1H,S,H-8),7.09(1H,S,H-5),7.82(1H,d,J=9.4Hz,H-4);13C-NMR(100MHz,CD3OD)δ:56.6(6-OCH),103.9(C-8),109.9(C-5),112.6(C-3),112.6(C-4a),146.1(C-4),147.1(C-6),151.4(C-8a),152.9(C-7),164.1(C-2)。
化合物ZY-8ESI-MS:m/z275.3[M+Na]+,527.3[2M+Na]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.76(3H,d,J=6.8Hz,H-12),0.88(3H,d,J=6.4Hz,H-13),1.45(3H,s,H-15),1.62(1H,m,H-8β),1.70(1H,m,H-11),1.90(1H,m,H-8α),2.10(3H,s,H-14),2.13(2H,m,H-3),2.23(2H,m,H-9),2.26(1H,m,H-7),2.44(1H,m,H-2β),2.65(1H,dt,J=16.8Hz,J=5.6Hz,H-2α),6.42(1H,s,H-5);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:20.2(C-12),20.6(C-13),24.7(C-8),27.4(C-15),30.0(C-14),31.3(C-11),35.2(C-2),36.9(C-3),41.9(C-9),42.1(C-7),68.5(C-4),138.9(C-6),150.7(C-5),198.7(C-1),209.5(C-10)。
化合物ZY-9ESI-MS:m/z377.2[M+Na]+,731.5[2M+Na]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.68(3H,d,J=6.8Hz,H-13),0.94(3H,d,J=6.8Hz,H-12),1.34(3H,s,H-10),1.40(1H,m,H-4),1.67(1H,m,H-9),2.04,2.05(6H,s,-OAc×2),2.22(3H,s,H-15),2.45(1H,q,J=9.6Hz,H-5),2.76(1H,m,H-6),4.70(1H,d,J=3.2Hz,H-3),5.57(1H,d,J=2.8Hz,H-2);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:17.6(C-10),17.9(C-13),20.9,21.3(-OAc×2),21.8(C-12),24.4(C-8),29.3(C-7,C-11),29.8(C-15),42.4(C-5),49.3(C-4),54.4(C-6),55.8(C-9),69.7(C-3),74.1(C-1),79.9(C-2),170.0,170.9-CH3(COO),(C-17),210.7(C-14)。
化合物ZY-10ESI-MS:m/z275.3[M+Na]+,527.3[2M+Na]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.77(3H,d,J=6.4Hz,H-12),0.86(3H,d,J=6.4Hz,H-13),1.46(3H,s,H-15),1.62(1H,m,H-8β),1.65(1H,m,H-11),1.87(1H,m,H-8α),2.11(3H,s,H-14),2.17(2H,m,H-3),2.25(2H,m,H-9),2.41(1H,m,H-2β),2.46(1H,m,H-7),2.65(1H,dt,J=16.8Hz,J=5.6Hz,H-2α),6.43(1H,s,H-5);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:20.0(C-12),20.3(C-13),24.8(C-8),27.5(C-15),29.9(C-14),31.8(C-11),35.2(C-2),37.1(C-3),41.8(C-9),41.9(C-7),68.6(C-4),139.1(C-6),150.0(C-5),198.7(C-1),210.1(C-10)。
化合物ZY-11Oxyphyllenodiols A EI-MS m/z:238[M]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.91(3H,d,J=6.8Hz,H-12),1.06(3H,d,J=6.8Hz,H-13),1.23(3H,s,H-15),1.67(1H,ddd,J=6.8,8.8,13.6Hz,H-2β),1.79(1H,ddd,J=1.2,6.4,13.6Hz,H-2α),1.97(2H,m,H-7),2.21(1H,m,H-11),2.27(1H,m,H-1α),2.37(1H,m,H-8α),2.47(1H,m,H-1β),2.52(1H,m,H-8β),2.64(1H,br dd,J=2.8,5.2Hz,H-6),4.16(1H,br s,H-3);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:19.1(C-12),21.4(C-1),21.5(C-13),21.8(C-15),22.2(C-7),29.8(C-11),32.1(C-2),35.0(C-8),40.0(C-6),72.2(C-3),75.1(C-4),132.4(C-10),157.6(C-5),199.9(C-9)。
化合物ZY-12丁香酸mp207～208℃;EI-MS m/z:198[M]+,183,155,137,127,109,93,81,65,53,39;1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:3.85(6H,s,3,5-OCH3),7.30(2H,s,H-2,6)。
化合物ZY-13(1R,3R,6S,7R,10S)-7-Isopropyl-4,10-dimethylbicyclo[4.4.0]-dec-4-ene-3,10-diol)无色油状,mp69～71℃;EI-MS m/z:238[M]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86(3H,d,J=6.8Hz H-15),0.99(3H,d,J=6.8Hz H-14),1.00(1H,d,J=8Hz H-13),1.23(3H,s,H-11),1.38(2H,m,H-7),1.40(2H,m,H-7),1.42(1H,m,H-8),1.57(1H,m,H-8),1.74(2H,m,H-1),1.76(2H,m,H-10),1.81(3H,s,H-12),2.32(1H,m,H-5),3.95(1H,m,H-2),5.77(1H,d,J=5.6Hz H-2);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:15.4(CH3),19.1(CH3),21.0(C-8),21.5(CH3),27.0(C-13),29.3(C-2),30.5(CH3),34.7(C-9),34.7(C-6),40.2(C-7),42.5(C-1),68.5(C-3),72.0(C-10),129.7(C-5),134.0(C-4)。
化合物ZY-14Oxyphyllenodiols B EI-MS m/z:238[M]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86(3H,d,J=6.8Hz,H-12),1.04(3H,d,J=6.8Hz,H-13),1.27(3H,s,H-15),1.58(1H,ddd,J=6.4,6.8,13.2Hz,H-2β),1.87(1H,ddd,J=4,5.6,13.2Hz,H-2α),1.98(2H,m,H-7),2.25(1H,m,H-11),2.33(1H,m,H-8α),2.36(2H,m,H-1),2.52(1H,ddd,J=5.2,8.8,14Hz,H-8β),2.62(1H,br d,J=6.4Hz,H-6),2.91(1H,br s,H-4),3.97(1H,br s,H-3);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:18.5(C-12),20.8(C-1),21.4(C-13),21.8(C-15),25.0(C-7),29.1(C-11),31.2(C-2),35.5(C-8),41.2(C-6),70.2(C-3),72.4(C-4),133.4(C-10),156.7(C-5),200.1(C-9)。
化合物ZY-16ESI-MS:m/z377.2[M+Na]+,731.5[2M+Na]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.71(3H,d,J=6.8Hz,H-13),0.96(3H,d,J=6.8Hz,H-12),1.27(3H,s,H-10),1.38(1H,m,H-4),1.59(1H,m,H-9),2.07(3H,s,-OAc),2.22(3H,s,H-15),2.41(1H,m,H-5),2.73(1H,m,H-6),3.60(1H,s,H-2);5.50(1H,d,J=2.4Hz,H-3);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:16.9(C-10),17.9(C-13),21.5(-OAc),21.9(C-12),24.4(C-8),29.2(C-11),29.4(C-7),29.6(C-15),42.7(C-5),49.4(C-4),54.6(C-6),55.2(C-9),72.7(C-3),75.2(C-1),79.6(C-2),171.9-CH3(COO),210.9(C-14)。
化合物ZY-176,7-二甲氧基香豆素mp145～147℃;EI-MS m/z:206[M]+,191,178,163,149,135,120,107,92,79,69。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.62(1H,d,J=9.6Hz,H-4),6.83(1H,s,H-5),6.82(1H,s,H-8),6.27(1H,d,J=9.6Hz,H-3),3.92(3H,s,6-OCH3),3.95(3H,s,7-OCH3);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:161.5(C-2),131.5(C-3),143.3(C-4),108.1(C-5),146.4(C-6),152.9(C-7),100.1(C-8),150.0(C-9),111.4(C-10),56.4(-OCH3×2)。
化合物ZY-18t-cadinol EI-MS m/z:206[M]+;1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.79(3H,d,J=6.8Hz,H-14)),0.92(3H,d,J=6.5Hz,H-13),1.00(1H,tt,J=14.4,J=3.2Hz,H-7a),1.11(1H,dt,J=12,J=1.6Hz,H-1a),1.22(3H,s,H-15),1.32(1H,m,H-8β),1.35(1H,m,H-2β),1.42(1H,m,H-9α),1.46(1H,m,H-8α),1.67(3H,s,H-11),1.75(1H,m,H-9β),1.91(1H,m,H-2α),1.93-2.02(3H,m,H-3α,H-3β,H-6β);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:15.2(C-14),19.8(C-8),21.4(C-13),22.5(C-2),23.8(C-11),26.1(C-12),28.4(C-15),30.9(C-3),37.7(C-6),40.2(C-9),46.6(C-7),47.9(C-1),70.7(C-10),122.6(C-5),134.4(C-4)。
化合物ZY-19豆甾-4-烯-3-酮mp145～147℃;EI-MS m/z:412[M+,39],398(8),370(11),289(18),271(12),245(6),229(34),149(24),124(100),107(24),95(31),81(28),69(28),55(51),43(57);1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.72(1H,s,H-4),2.39～2.25(4H,m,H-2,6),2.05～1.99(3H,m,H-1,12),1.88-1.81(2H,m,H-7,15),1.73～1.65(2H,m,H-1,24),1.65～1.42(3H,m,H-8,11,16),1.41～1.10(10H,m,H-11,15,16,17,20,22,23,28),1.06～0.95(3H,m,H-7,14,22),0.99～0.87(2H,m,H-9,25),1.19(3H,s,19-CH3),0.92(3H,d,J=6.4Hz,21-CH3),0.84(3H,t,J=6.8Hz,29-CH3),0.83(3H,d,J=6.8Hz,26-CH3),0.81(3H,d,J=6.8Hz,27-CH3),0.71(3H,s,18-CH3);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:199.6(C-3),171.8(C-5),123.7(C-4),55.9(C-17),55.8(C-14),53.8(C-9),45.9(C-25),42.4(C-13),39.6(C-12),38.5(C-10),36.1(C-20),35.7(C-1),35.6(C-8),34.0(C-2),33.8(C-22),32.9(C-6),32.0(C-7),29.1(C-24),28.3(C-15),26.0(C-23),24.2(C-16),23.1(C-28),21.0(C-11),19.8(C-26),19.0(C-27),18.7(C-21),17.4(C-19),11.9(C-18,29)。
2.5结果与讨论
本实验通过对铁筷子乙酸乙酯萃取层化学成分的研究，共分离得到17个化合物，主要为香豆素和倍半萜类化合物，还有苷类和三萜类化合物。
化合物ZY-8、9、10、16未确定绝对构型，其中ZY-9、16为新化合物，ZY-8与ZY-10可能为差向异构体，这4个化合物需进一步通过圆二色谱法测定和计算绝对构型。其余得到13个已知化合物，它们分别是ZY-1(异嗪皮啶)、ZY-2(β-谷甾醇)、ZY-3(6，7，8-三甲氧基香豆素)、ZY-4(7-hydroxy-6-methoxychroman-2-one)、ZY-5(异嗪皮啶-7-O-β-D-葡萄糖苷)、ZY-7(东莨菪内酯)、ZY-11(Oxyphyllenodiols A)、ZY-12(丁香酸)、ZY-13(1R,3R,6S,7R,10S)-7-Isopropyl-4,10-dimethylbicyclo[4.4.0]-dec-4-ene-3,10-diol、ZY-14(Oxyphyllenodiols B)、ZY-17(6，7-二甲氧基香豆素)、ZY-18(t-cadinol)、ZY-19(豆甾-4-烯-3-酮)。
所得化合物中ZY-4、ZY-5、ZY-8、ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-16、ZY-18、ZY-19为铁筷子药材中首次分离得到。
本发明通过实验研究发现，铁筷子药材乙醇提取浸膏中乙酸乙酯萃取部位有较好的镇痛和抗炎作用，可将其用于制备抗炎镇痛的药物；并从该乙酸乙酯萃取部位分离得到17个化合物，其中ZY-9、ZY-16为新化合物，ZY-4、ZY-5、ZY-8、ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-16、ZY-18、ZY-19为铁筷子药材中首次分离得到，为铁筷子药材以及含有铁筷子的成药制剂建立含量测定项目奠定了基础，有利于提升铁筷子药材的质量标准及质量可控性，从而为铁筷子深层次的开发利用和新药研制奠定了基础。
附图说明
图1是铁筷子提取物的制备工艺流程图；
图2是铁筷子提取物中有效成分的分离流程图。
具体实施方式
本发明的实施例1：铁筷子提取物的制备（参见图1）：
取铁筷子药材，粉碎成粗粉，分别用8倍量、6倍量、6倍量95%乙醇提取3次，每次2h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再分别用8倍量、6倍量、6倍量50%乙醇提取3次，每次2h，得50%乙醇提取液；合并所有提取液，减压浓缩，回收溶剂，70℃低温真空干燥，然后加入适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取4次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层浸膏，干燥即得。
实施例2：铁筷子提取物的制备：
取铁筷子药材，粉碎成粗粉，分别用8倍量、7倍量、6倍量95%乙醇提取2次，每次3h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再分别用8倍量、7倍量、6倍量50%乙醇提取2次，每次3h，得50%乙醇提取液；合并所有提取液，减压浓缩，回收溶剂，真空干燥，然后加入适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取5次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层浸膏，干燥即得。
实施例3：铁筷子提取物的制备：
取铁筷子药材，粉碎成粗粉，分别用8倍量95%乙醇提取4次，每次1.5h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再分别用8倍量50%乙醇提取4次，每次1.5h，得50%乙醇提取液；合并所有提取液，减压浓缩，回收溶剂，干燥，然后加入适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层浸膏，干燥即得。
实施例4：铁筷子提取物中有效成分的分离（参见图2）：
取实施例1所得铁筷子提取物（即乙酸乙酯层浸膏）200g，加入适量甲醇溶解分散，用350g40～80目硅胶拌样，采用200～300目硅胶柱层析分离样品，装柱硅胶为2000g，用氯仿-甲醇=100:0～0:100混合溶剂梯度洗脱，洗脱组分通过薄层层析展开，在紫外检测仪下观察，再通过5%磷钼酸溶液或5%浓硫酸-乙醇溶液浸润后高温烘烤显色观察，合并相似组分，根据洗脱溶剂氯仿-甲醇的极性将乙酸乙酯萃取部位共分成7个段(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6和Fr.7，对应的洗脱溶剂分别为氯仿-甲醇=100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50、0:100)，Fr.6放置后析出晶体，得化合物5（ZY-5）；Fr.3经中压制备色谱，以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100梯度洗脱，再经结晶和重结晶得化合物1（ZY-1），合并此段其余组分后分为3个次组分，再通过硅胶柱层析以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100反复洗脱，得化合物2（ZY-2）、化合物3（ZY-3）、化合物4（ZY-4）；Fr.4通过300～400目硅胶柱色谱，以不同比例石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇系统反复柱层析，得化合物7（ZY-7）、化合物8（ZY-8）、化合物9（ZY-9）、化合物10（ZY-10）、化合物11（ZY-11）、化合物12（ZY-12）、化合物13（ZY-13）、化合物14（ZY-14）、化合物16（ZY-16）、化合物17（ZY-17）、化合物18（ZY-18）、化合物19（ZY-19）。其中ZY-9的分子式为C19H30O6，结构式为
Figure BDA0000404087720000181
ZY-16的分子式为C17H28O5，结构式为
Figure BDA0000404087720000182
实施例5：铁筷子提取物中有效成分的分离：
取实施例2或3所得铁筷子提取物（即乙酸乙酯层浸膏），加入甲醇溶解分散，用1.75倍重量的40～80目硅胶拌样，采用200～300目硅胶柱层析分离样品，装柱硅胶为乙酸乙酯层浸膏重量的10倍，用氯仿-甲醇=100:0～0:100混合溶剂梯度洗脱，洗脱组分通过薄层层析展开，在紫外检测仪下观察，再通过5%磷钼酸溶液或5%浓硫酸-乙醇溶液浸润后高温烘烤显色观察，合并相似组分，根据洗脱溶剂氯仿-甲醇的极性将乙酸乙酯萃取部位共分成7个段（1-7段对应的洗脱溶剂分别为氯仿-甲醇=100:0、100:2、100:5、100:10、100:20、100:50、0:100），第6段放置后析出晶体，得ZY-5；第3段经中压制备色谱，以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100梯度洗脱，再经结晶和重结晶得ZY-1，合并此段其余组分后分为3个次组分，再通过硅胶柱层析以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100反复洗脱，得ZY-2、ZY-3、ZY-4；第4段通过300～400目硅胶柱色谱，以不同比例石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇系统反复柱层析，得ZY-7、ZY-8、ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18、ZY-19。

Claims (9)

1.一种铁筷子提取物，其特征在于：它是将铁筷子药材分别用6-8倍量95%乙醇、50%乙醇各提取2-4次，合并所有提取液，浓缩干燥，然后加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩、干燥而得。
2.如权利要求1所述铁筷子提取物的制备方法，其特征在于：取铁筷子药材，粉碎成粗粉，用6-8倍量95%乙醇提取2-4次，每次1-3h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再用6-8倍量50%乙醇提取2-4次，每次1-3h，得50%乙醇提取液；合并所有提取液，减压浓缩，回收溶剂，干燥，然后加入适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3～5次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层浸膏，干燥即得。
3.根据权利要求2所述铁筷子提取物的制备方法，其特征在于：取铁筷子药材，粉碎成粗粉，分别用8倍量、6倍量、6倍量95%乙醇提取3次，每次2h，得95%乙醇提取液，备用；药渣再分别用8倍量、6倍量、6倍量50%乙醇提取3次，每次2h，得50%乙醇提取液；合并所有提取液，减压浓缩，回收溶剂，70℃低温真空干燥，然后加入适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3～5次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层浸膏，干燥即得。
4.权利要求1所述铁筷子提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。
5.权利要求1所述铁筷子提取物中有效成分的分离方法，其特征在于：将铁筷子提取物加入甲醇溶解分散，用40～80目硅胶拌样，采用200～300目硅胶柱层析分离样品，用氯仿-甲醇=100:0～0:100混合溶剂梯度洗脱，洗脱组分通过薄层层析展开，在紫外检测仪下观察，再通过5%磷钼酸溶液或5%浓硫酸-乙醇溶液浸润后高温烘烤显色观察，合并相似组分，根据洗脱溶剂氯仿-甲醇的极性将乙酸乙酯萃取部位共分成7个段，第6段放置后析出晶体，得化合物5；第3段经中压制备色谱，以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100梯度洗脱，再经结晶和重结晶得化合物1，合并此段其余组分后分为3个次组分，再通过硅胶柱层析以石油醚-乙酸乙酯=100:0～0:100反复洗脱，得化合物2、化合物3、化合物4；第4段通过300～400目硅胶柱色谱，以不同比例石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和氯仿-甲醇系统反复柱层析，得化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物16、化合物17、化合物18、化合物19。
6.根据权利要求5所述铁筷子提取物中有效成分的分离方法，其特征在于：拌样所用40～80目硅胶为铁筷子提取物重量的1.75倍。
7.根据权利要求5所述铁筷子提取物中有效成分的分离方法，其特征在于：采用200～300目硅胶柱层析分离时，装柱硅胶为铁筷子提取物重量的10倍。
8.采用权利要求5所述分离方法从铁筷子提取物中分离得到的化合物9，其分子式为C19H30O6，结构式为
9.采用权利要求5所述分离方法从铁筷子提取物中分离得到的化合物16，其分子式为C17H28O5，结构式为
Figure FDA0000404087710000022
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