CN101357146A - 山蜡梅有效部位群的制备方法及其制剂的制法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及山蜡梅有效部位群的制备方法及其制剂的制法与用途，本发明的山蜡梅有效部位群及其制剂在防治呼吸系统疾病、抗感冒、抗菌、抗炎、抗病毒和抗真菌等药物中的应用。本发明将挥发油有效部位和非挥发性有效部位按山蜡梅药材实际生药提取量1.0－2.6∶0.5－3.5重量配比入药，即为山蜡梅有效部位群。该山蜡梅有效部位群的制剂可为颗粒剂、软胶囊、胶囊、滴丸、片剂、复合胶囊、分散片等。本发明对山蜡梅制剂进行深度开发，富含活性成分，不仅有效成分明确，药理作用明显，药效显著提高，而且性能稳定，质量可控，安全可靠，并且服用量小，有利于药品运输、储存与患者服用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药有效部位药物，特别涉及山蜡梅有效部位群的制备方法，及有效部位群中可检测有效成分含量均达到50％以上；另涉及该有效部位群制备的药物可在防治呼吸系统疾病、抗感冒、抗菌、消炎、抗病毒和抗真菌等药物中应用。
背景技术
感冒是全球发病率最普遍的疾病，分为流行性感冒和普通感冒两种，流感很容易引起病毒变异，并可能导致病毒性肺炎、病毒性心肌炎等疾病；感冒引起的症状主要是发热、发冷、流涕、咳嗽。据统计，目前在中国常见病症的自我诊疗比例中最高的是感冒，占常见病症的89.6％。75％的人一年之中都得患一次感冒，也就是说，一年之中，约有十亿人次感冒。我国传统中药在治疗感冒方面有独特的疗效，并且随着医源性、药源性疾病日益增加，化学药品的毒副作用问题亦越来越受到重视，人们开始把眼光转向更为自然的传统医药领域，回归自然成为世界性潮流。中药感冒药市场空间不段扩大，但目前临床使用的中药感冒药均存在制备工艺落后，服用剂量大，质量难以控制的问题，缺乏市场竞争力。因此开发具有先进制备工艺、质量可控、有效成分明确、服用量小、安全有效的新药成为中药感冒药的发展趋势。
山蜡梅为蜡梅科Calycanthaceae植物山蜡梅Chimonanthus nitens Oliv的叶，《中国药典》(1977年版)有记载，主产于安徽、江西等地。山蜡梅性凉、味辛微苦，具有解表祛风、清热解毒之功效，对于防治感冒、流行性感冒有良好的疗效。目前，山蜡梅化学成分研究以挥发油为主，对非挥发性成分研究较少。其挥发性组分主要是烯烃类、醇类物质，含有1，8桉叶素(1，8-cinceol)、芳樟醇(linalool)，α-蒎烯(α-pinene)，樟脑(camphor)，莰烯(camphene)，龙脑(borneol)等。开花期挥发油含量为1.62％-2.90％，营养期1.82％2.46％，其中54-58％为桉叶素。截至目前共报道的山蜡梅非挥发性成分有黄酮、总酚、甾体、生物碱、香豆素等成分；其中总黄酮含量为0.87％-1.27％，主要是槲皮素(quercetin)和山柰酚(kaempferol)及其与葡萄糖、鼠李糖形成的甙；生物碱含量为0.1％，主要是蜡梅碱(Calycanthine)和异山蜡梅碱。
《江西省药品标准》982年记载了山蜡梅制剂“山蜡梅片”和“山蜡梅冲剂”，作为防治感冒和流行性感冒在临床上应用。徐文跃等报道了以蜡梅叶为主的蜡梅止咳露，对外感风热型咳嗽、久咳及慢性支气管炎76例疗效观察表明：总有效率为90.8％，明显优于用川贝枇杷露治疗的对照组(44.6％，P＜001)。李萍等人通过体内抗菌试验，和体外抗菌试验发现发现山蜡梅叶对金黄色葡萄球菌和多种细菌均有抑制作用，同时还证明有抗炎解热，免疫增强的作用。何明等研究了通过体内外抑菌实验发现蜡梅感冒茶能抑制金葡菌的感染，减少小鼠致死率；显著地对抗醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高和蛋清所致大鼠脚肿；同时还能对抗干酵母所致的大鼠发热。刁军成研究表明山蜡梅水浸液或挥发油均有直接抑制或杀灭流感A3或副流感1病毒的作用。
以上研究表明山蜡梅挥发油及提取浸膏具有抑菌、抗炎、解热、镇咳、抗流感病毒和免疫增强等作用，但具体哪些成分或哪些部位起上述药理作用尚不是很清楚，因此有必要深入研究山蜡梅有效成分和有效部位，从而指导开发疗效更为显著的新制剂。
发明内容
本发明的目的是提供山蜡梅有效部位群的制备方法及其制剂的制法与用途。
山蜡梅有效部位群的制备方法，该方法依次包括下列步骤：
步骤(1)山蜡梅叶分拣、干燥，加水浸泡30min-1h，水蒸气蒸馏提取挥发油，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，作为挥发油有效部位；
步骤(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加溶剂提取，过滤，收集提取液，与蒸馏后的水溶液合并，减压浓缩，浓缩液上大孔树脂层析柱吸附，用2-6倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用2-6倍柱体积的10％-30％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用2-6倍柱体积的30％-90％的乙醇洗脱，洗脱液收集，减压浓缩，冷却后用醇溶解，静置，过滤，得滤液，减压回收乙醇，干燥即得非挥发性有效部位；
步骤(3)将挥发油有效部位和非挥发性有效部位按山蜡梅药材实际生药提取量1.0-2.6∶0.5-3.5重量配比入药，即为山蜡梅有效部位群。
山蜡梅中提取有效部位群的方法，步骤(1)中加水量为生药材的6-30倍，提取时间为1-6小时。
山蜡梅有效部位群的制备方法，步骤(2)中药渣加溶剂为水或10％-95％的乙醇，提取次数为1-4次，每次提取时间为30min-2h。
山蜡梅有效部位群的制备方法，步骤(2)中减压浓缩温度为40℃-75℃。
山蜡梅有效部位群的制备方法，步骤(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量40％-95％进行溶解。
山蜡梅有效部位群的制备方法，步骤(2)用醇溶解工序中静置时间为6-48小时。
本发明利用现代药效筛选技术、提取纯化技术、制剂技术以及质量控制技术对山蜡梅制剂进行深度开发，目的得到有效成分明确，药理作用明显，性能稳定，毒性小，质量可控，安全可靠的有效部位群及其制剂。
本发明对山蜡梅制剂进行深度开发，富含活性成分，并且服用量小，有利于药品运输、储存与患者服用。
具体实施方式
实施例1-1：
山蜡梅有效部位群的制备方法，该方法依次包括下列步骤：
步骤(1)山蜡梅叶分拣、干燥，加水浸泡30分种，水蒸气蒸馏提取挥发油，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，作为挥发油有效部位；
步骤(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加溶剂提取，过滤，收集提取液，与蒸馏后的水溶液合并，减压浓缩，浓缩液上大孔树脂层析柱吸附，用2倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用2倍柱体积的10％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用2倍柱体积的30％的乙醇洗脱，洗脱液收集，减压浓缩，冷却后用醇溶解，静置，过滤，得滤液，减压回收乙醇，干燥即得非挥发性有效部位；
步骤(3)将挥发油有效部位和非挥发性有效部位按山蜡梅药材实际生药提取量1.0∶3.5重量配比入药，即为山蜡梅有效部位群。
实施例1-2：
山蜡梅有效部位群的制备方法，该方法依次包括下列步骤：
步骤(1)山蜡梅叶分拣、干燥，加水浸泡60分种，水蒸气蒸馏提取挥发油，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，作为挥发油有效部位；
步骤(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加溶剂提取，过滤，收集提取液，与蒸馏后的水溶液合并，减压浓缩，浓缩液上大孔树脂层析柱吸附，用6倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用6倍柱体积的30％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用6倍柱体积的90％的乙醇洗脱，洗脱液收集，减压浓缩，冷却后用醇溶解，静置，过滤，得滤液，减压回收乙醇，干燥即得非挥发性有效部位；
步骤(3)将挥发油有效部位和非挥发性有效部位按山蜡梅药材实际生药提取量2.6∶0.5重量配比入药，即为山蜡梅有效部位群。
实施例1-3：
山蜡梅有效部位群的制备方法，该方法依次包括下列步骤：
步骤(1)山蜡梅叶分拣、干燥，加水浸泡45分种，水蒸气蒸馏提取挥发油，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，作为挥发油有效部位；
步骤(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加溶剂提取，过滤，收集提取液，与蒸馏后的水溶液合并，减压浓缩，浓缩液上大孔树脂层析柱吸附，用3倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用3倍柱体积的60％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用3倍柱体积的60％的乙醇洗脱，洗脱液收集，减压浓缩，冷却后用醇溶解，静置，过滤，得滤液，减压回收乙醇，干燥即得非挥发性有效部位；
步骤(3)将挥发油有效部位和非挥发性有效部位按山蜡梅药材实际生药提取量1.6∶1.5重量配比入药，即为山蜡梅有效部位群。
实施例2-1：
山蜡梅有效部位群的制备方法，
步骤(1)中加水量为生药材的6倍，提取时间为1小时。
步骤(2)中药渣加溶剂为水或10％的乙醇，提取次数为1次，提取时间为30分钟。
步骤(2)中减压浓缩温度为40℃。
步骤(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量40％进行溶解。
步骤(2)用醇溶解工序中静置时间为6小时。
步骤(2)用醇溶解工序中静置温度为0℃。
其余同实施例1-1。
实施例2-2：
山蜡梅有效部位群的制备方法，
步骤(1)中加水量为生药材的30倍，提取时间为6小时。
步骤(2)中药渣加溶剂为水或95％的乙醇，提取次数为4次，提取时间为120分钟。
步骤(2)中减压浓缩温度为75℃。
步骤(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量95％进行溶解。
步骤(2)用醇溶解工序中静置时间为48小时。
步骤(2)用醇溶解工序中静置温度为25℃。
其余同实施例1-2。
实施例2-3：
山蜡梅有效部位群的制备方法，
步骤(1)中加水量为生药材的15倍，提取时间为3小时。
步骤(2)中药渣加溶剂为水或70％的乙醇，提取次数为2次，提取时间为100分钟。
步骤(2)中减压浓缩温度为65℃。
步骤(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量80％进行溶解。
步骤(2)用醇溶解工序中静置时间为24小时。
步骤(2)用醇溶解工序中静置温度为15℃。
其余同实施例1-3。
实施例3-1：
山蜡梅有效部位群的制备方法，步骤(2)所使用的干燥方法为喷雾干燥。其余同实施例1-1。
实施例3-2：
山蜡梅有效部位群的制备方法，步骤(2)所使用的干燥方法为减压干燥。其余同实施例1-2。
实施例3-3：
山蜡梅有效部位群的制备方法，步骤(2)所使用的干燥方法为常压干燥。其余同实施例1-3。
试验例1
经气相色谱法测定，本发明山蜡梅挥发油有效部位(试验例714制备)主要含有1，8桉叶素(1，8-cinceol)、芳樟醇(linalool)，樟脑(camphor)和龙脑(borneol)等，其中1，8桉叶素(1，8-cinceol)、芳樟醇(linalool)含量总和为50％-88％。
试验例2
经特征显色反应及薄层层析检查，本发明山蜡梅非挥发性有效部位(试验例7-14制备)主要含有黄酮、酚类和甾体类成分。
建立紫外-分光光度法测定本发明山蜡梅非挥发性有效部位(试验例7-14制备)中总黄酮、总酚和甾体类成分含量：
用硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠显色法，在500nm下测定紫外吸收值，用芦丁作对照品，样品不加显色剂为空白。(测总黄酮)
用十二烷基硫酸钠-铁氰化钾-三氯化铁显色法，在764nm下测定紫外吸收值，用绿原酸或没食子酸作对照品，样品不加显色剂为空白。(测总酚)
用香草醛-冰乙酸-高氯酸显色法，在445nm下测定紫外吸收值，用β-谷甾醇作对照品，样品不加显色剂为空白。(测甾体类成分)
结果：总黄酮、总酚和甾体类成分含量总和为50％-90％。
试验例3 本发明山蜡梅有效部位群抗炎作用研究(对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响)
1.实验分组和实验步骤
取大鼠64只，雌雄各半，180-220g，随机分为8组，每组8只，分别为：
(1)模型对照组
(2)阳性对照组(临床用量1215-2430mg/d，本实验复方乙酰水杨酸片用量为364.5mg/kg体重[即乙酰水杨酸198mg/kg体重]，相当于临床用量的12倍)
(3)样品组(临床用量30g/d，本实验用量6g/kg体重，相当于临床用量的12倍)：
1# 非挥发性有效部位组(试验例11制备)
2# 挥发油组(试验例11制备)
3# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例11制备)
4# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例7制备)
5# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例8制备)
6# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例9制备)
用记号笔在大鼠右后肢踝关节周围做一标记，采用特定装置测定每只大鼠右后肢正常足跖容积。测量正常足跖容积后，模型对照组大鼠灌予生理盐水，其余给药组大鼠按1ml/100g体重灌胃给予相应的药物，1次/d，连续5d，第5d给药后30min，2％戊巴比妥钠麻醉大鼠，分别在大鼠右后肢足跖皮下注射蛋清0.1mL/只致炎。随后，每隔1h均按上法，各测一次足跖容积，连续6次，记录结果，并分别按下式计算肿胀率(％)和抑制率(％)。
2.结果(见表1)
表1 山蜡梅有效部位对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响(mean±sd，N＝8)
| 不同时间(h)足跖肿胀率(％)(抑制率％) | 不同时间(h)足跖肿胀率(％)(抑制率％) | 不同时间(h)足跖肿胀率(％)(抑制率％) | |
| 1h | 2h | 3h | |
| 生理盐水组 | 103.93±17.58 | 86.72±13.95 | 68.57±9.68 |
| 水杨酸组 | 87.94±20.24(15.38％) | 80.69±20.77(6.96％) | 56.33±18.94(17.85％) |
| 1# 非挥发性有效部位组(试验例11制备) | 83.74±16.54(19.43％) | 79.72±16.14(8.07％) | 57.89±12.12(15.58％) |
| 2# 挥发油组(试验例11制备) | 81.59±9.33*(21.49％) | 79.97±16.09(7.79％) | 72.47±15.20(5.68％) |
| 3# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例11制备) | 75.39±11.71(27.45％) | 73.02±13.97(15.80％) | 54.08±10.45*(21.13％) |
| 4# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例7制备) | 73.84±9.81(28.95％) | 67.89±9.81(28.95％) | 55.48±12.53(19.09％) |
| 5# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例8制备) | 77.85±16.52(25.09％) | 71.26±13.64(17.83％) | 56.12±18.21(18.16％) |
| 6# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例9制备) | 82.22±7.22(20.89％) | 74.97±8.49(13.55％) | 67.63±9.41(1.37％) |
与模型对照组比较，*P＜0.05
3.结论
从表1中得知，水杨酸组在4h和6h、山蜡梅1#在4h、山蜡梅2#在1h、和山蜡梅3#在3h、山蜡梅4#在4h、山蜡梅5#在4h和5h、山蜡梅6#在2h对大鼠足跖肿胀率与模型对照组相比差别有统计学意义，说明山蜡梅有效部位群具有显著抗炎作用。
试验例4 本发明山蜡梅有效部位群体外抗真菌试验
1.方法(平皿法)：
(1)药液稀释：取灭菌试管10支，依次编号，排列于试管架，按无菌操作第1管中加入供试液10ml，第2-10管中加无菌蒸馏水各5ml，从第一管中取5ml供试品至第二管，再从第二管取5ml至第三管……，按两倍稀释法依次稀释，另做无菌蒸馏水作对照。
(2)真菌的接种和培养：取10个无菌平皿做好编号分别加入上述1-10号试管内已稀释的药物各1ml至平皿，加入0.5ml试验菌，倾注10ml改良马丁琼脂(冷却至40℃-45℃)，混匀，凝固，倒置，于培养箱25℃-28℃培养3-5d.同时制备阳性对照，供该药对白色念珠菌的MIC。
(3)测定：
37℃培养3-5d后观察结果，≤3个菌落的平板或无菌生长的平板最低药物浓度即为受试药对该菌株的最低抑菌的MIC。
2.结果：
结果显示山蜡梅有效部位对所试验的白色念球菌有不同程度的抑菌作用MIC，见表2。
表2 山蜡梅有效部位抑菌实验结果
3.结论：
根据实验数据评价其抑真菌活性强弱顺序分别是5#＞4#＞3#＞6#＞1#＞2#山蜡梅挥发油。本实验中山蜡梅提取物平均最低抑菌浓度MIC值范围在0.0033-0.01g生药/ml之间。根据相关报告，楮叶提取物总平均最低抑菌浓度MIC(g/mL)值范围在0.0268-0.0667(g/mL)之间，而其治疗浅部真菌病的疗效与达克宁相当，并且楮叶不同溶剂提取物体外抗浅部真菌试验显示具有明显的抗真菌作用，其提取物的最低抑菌浓度低于目前公认的抗真菌中药的最低抑菌浓度[2]；根据我国科学家经过几十年的探索，抗真菌作用较强的中药有丁香、肉桂、牡丹皮、土槿皮等，这些中草药的乙醇提取物的MFC约为1g/ml，中草药有效成分丁香酚、肉桂醛的MFC为0.250g/ml[3]；屠鹏飞[4]测定龙血竭对多种真菌的MIC在0.0188-0.75g/ml，其作用靶位是真菌的细胞壁；何进[5]测定了大蒜油的抗真菌活性(MIC为0.00625-0.05g/ml)。山蜡梅有效部位提取物抑菌浓度MIC值基本低于以上所提中药提取物的MIC值，故可以说山蜡梅有效部位最低抑菌浓度低于目前公认的抗真菌中药的最低抑菌浓度，有开发价值。
试验例5 本发明山蜡梅有效部位群体外抑菌实验
1.方法：采用平皿法，对常见的5种菌株进行最小抑菌浓度试验
1.1 药液的配制及稀释
1# 非挥发性有效部位组(试验例11制备)
2# 挥发油组(试验例11制备)
3# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例11制备)
4# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例7制备)
5# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例8制备)
6# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例9制备)
首先山蜡酶各提取液用无菌蒸馏水按等倍稀释的原则，依次配制10个浓度。
1.2 山蜡酶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌的抑制作用
实验分为无菌蒸馏水组、阳性对照组、山蜡酶各浓度组。
取10个无菌平皿做好编号后，分别加入上述不同浓度的药液各1ml至平皿中，加入已稀释好的金黄色葡萄球菌或大肠埃希氏菌菌液，倾注10ml冷却至40℃左右的营养琼脂，混匀，平皿倒置，于5％CO2培养箱中，37℃培养18-24h。得出该药对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC(培养18-24h后观察，≤3个菌落的平板或无菌生长的平板的最低药物浓度即为受试药对该菌株的MIC)。
1.3 山蜡酶提取液对肺炎双球菌、乙型溶血性链球菌的抑制作用
实验分为无菌蒸馏水组、阳性对照组、山蜡梅各浓度组。
取稀释好的肺炎双球菌或乙型溶血性链球菌或流感杆菌菌液1ml分别加入盛有不同浓度药液的已编号的1-10号试管中，混匀，用烧红并冷却的接种环分别取1-10号试管中受试药与试验菌的混合液一环，划线接种于血平板和巧克力平板上，平板倒置，于5％CO2培养箱中，37℃培养18-24h。同时设置阳性对照组，得出该药对溶血性链球菌、肺炎双球菌的MIC(培养18-24h后观察，≤3个菌落的平板或无菌生长的平板的最低药物浓度即为受试药对该菌株的MIC)。
1.4 山蜡酶提取液对流感嗜血杆菌的的抑制作用
实验分为无菌蒸馏水组、阳性对照组、山蜡梅各浓度组。
取脱纤维羊血100ml平均分装于装有无菌玻璃珠的三角锥型瓶中，每瓶20ml，摇动三角瓶10min左右，使形成的纤维蛋白块会沉淀在玻璃珠上，以无菌操作每瓶加入180ml冷至45℃-50℃的牛肉膏蛋白胨培养基，立即摇荡以便血液和培养基充分混匀(45℃-50℃加入血液是为了保存其中某些不耐热的营养物质和保存血细胞的完整，以便于观察细菌的溶血作用，同时这个温度下琼脂不会凝固)45℃-50℃水浴保温，另取三瓶制好的血液琼脂置于水浴80℃15分钟使成巧克力色，为巧克力培养基。取10个无菌平皿做好编号分别加入上述1-10号试管内已稀释的药物各1ml至平皿，加入1ml试验菌，倾注10ml以上做好的血琼脂，摇匀，倒置，于二氧化碳培养箱36℃±1℃培养18h-24h.同时制备阳性对照，供该药对溶血性链球菌、肺炎双球菌的、流感嗜血杆菌的MIC。
2.结果(见表3)
表3 山蜡梅有效部位对五种菌株的抑制作用
3.结论
山蜡梅有效部位群具有良好的体外抑菌作用，其中综合抑菌效果强弱顺序为：5#＞4#＞3#＞2#＞6#＞1#。
试验例6 本发明山蜡梅有效部位群体内抗病毒药效学实验
1.受试药物及实验用病毒
(1)山蜡梅样品组(1#-6#)；
(2)阳性对照药利巴韦林片；
(3)甲型流感病毒A/PR8/34(H1H1)。
2.实验方法：
(1)甲型流感病毒经鸡胚增毒，经血凝试验结果血凝滴度为640以上，可以用于体内感染动物。
(2)经测定病毒感染小鼠半数死亡(LD50)滴定，结果LD50为10-1.71。
(3)山腊梅有效部位对甲型流感病毒A/PR8/34感染小鼠的保护作用
取ICR小鼠144只，体重18-22g，雌雄各半，按以下办法随机分9组，每组16只。
以上各组动物均采用灌胃给药，每日一次，连续给药5天。于开始给药次日，除正常对照组外的各组小鼠在浅麻醉下，以血凝滴度640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染病毒，每鼠50μl，观察动物感染发病情况及死亡数目，记录14d内死亡树目，并比较存活天数，结果见表4。
表4 山蜡梅有效部位群体内抗病毒实验结果
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(g/kg) | 存活天数 |
| 正常组 | 16 | 等量NS | |
| 病毒感染组 | 16 | 等量NS | 5.71±3.18 |
| 利巴韦林组 | 16 | 0.05 | 11.07±3.61* |
| 1# 非挥发性有效部位组(试验例11制备) | 16 | 0.20 | 10.61±3.56* |
| 2# 挥发油组(试验例11制备) | 16 | 0.20 | 9.25±3.26* |
| 3# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例11制备) | 16 | 0.20 | 10.66±3.28* |
| 4# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例7制备) | 16 | 0.20 | 10.82±3.32* |
| 5# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例8制备) | 16 | 0.20 | 11.06±3.11* |
| 6# 挥发油+非挥发有效部位组(试验例9制备) | 16 | 0.20 | 10.01±3.25* |
2.结论
山蜡梅有效部位群可明显延长甲型流感病毒小鼠存活天数。与病毒模型组比较有显著性差异，疗效与利巴韦林相当，抗病毒强弱顺序为：5#＞4#＞3#＞1#＞6#＞2#。
试验例7
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油1小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位10.1g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为88.0％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加水煎煮2次，提取时间为30min，过滤，滤液与蒸馏后的水溶液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上大孔树脂层析柱吸附，用3倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用2倍柱体积的10％乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用5倍柱体积的30％乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-75℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量40％，进行溶解，10℃-20℃静置24小时，过滤，得滤液，40℃-75℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位19.5g，其中总黄酮含量质量分数为10.7％，酚类、甾体类成分质量分数总和为80.2％，三者含量总和为90.9％。
(3)将挥发油有效部位10.1g和非挥发性有效部位19.5g作为原料药制成颗粒剂。
其余按照实施例1-1提供的方法操作。
试验例8
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油1小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位10.9g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为88.2％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加60％乙醇，回流提取2次，每次提取时间为1h，过滤，合并滤液，与蒸馏后的水溶液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上已预处理好的大孔树脂层析柱吸附，用4倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用4倍柱体积的30％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用5倍柱体积的70％的乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-65℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量95％进行醇沉，0-10℃静置24小时，过滤，得滤液，40℃-65℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位5.2g，其中总黄酮含量质量分数为76.2％，酚类、甾体类成分质量分数总和为13.3％，三者含量总和为89.5％。
(3)将挥发油有效部位10.9g和非挥发性有效部位5.2g作为原料药制成滴丸。
其余按照实施例1-2提供的方法操作。
试验例9
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油6小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位26.0g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为52.8％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加水煎煮2次，每次1h，过滤，合并滤液，与蒸馏后的水溶液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上已预处理好的大孔树脂层析柱吸附，用2倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用2倍柱体积的10％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用5倍柱体积的40％的乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-65℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量70％进行醇沉，10℃-25℃静置24小时，过滤，得滤液，40℃-65℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位35.0g，其中总黄酮含量质量分数为21.6％，酚类、甾体类成分质量分数总和为30.3％，三者含量总和为51.9％。
(3)将挥发油有效部位26.0g和非挥发性有效部位35.0g作为原料药制成胶囊。
其余按照实施例1-3提供的方法操作。
试验例10
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加6倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油2小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位15.8g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为82.6％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加水煎煮2次，每次1h，过滤，合并滤液，与蒸馏后的水溶液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上已预处理好的大孔树脂层析柱吸附，用3倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用2倍柱体积的10％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用5倍柱体积的30％的乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-65℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量50％进行醇沉，0-10℃静置24小时，过滤，得滤液，40℃-65℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位20.1g，其中总黄酮含量质量分数为13.8％，酚类、甾体类成分质量分数总和为58.3％，三者含量总和为72.1％。
(3)将挥发油有效部位20.8g和非挥发性有效部位20.1作为原料药制成胶囊。
其余按照实施例2-1提供的方法操作。
试验例11
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加10倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油3小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位19.9g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为79.8％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加10％乙醇，回流提取2次，每次提取时间为1h，过滤，合并滤液，与蒸馏后的水溶液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上已预处理好的大孔树脂层析柱吸附，用3倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用3倍柱体积的20％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用3倍柱体积的50％的乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-65℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量60％进行醇沉，0-10℃静置12小时，过滤，得滤液，40℃-65℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位18.2g，其中总黄酮含量质量分数为42.6％，酚类、甾体类成分质量分数总和为35.7％，三者含量总和为78.3％。
(3)将挥发油有效部位19.9g和非挥发性有效部位18.2g作为原料药制成片剂。
其余按照实施例2-2提供的方法操作。
试验例12
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加15倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油4小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位21.2g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为76.5％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加30％乙醇，回流提取3次，提取时间为30min，过滤，合并滤液，与蒸馏后的水溶液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上已预处理好的大孔树脂层析柱吸附，用4倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用4倍柱体积的30％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用4倍柱体积的60％的乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-75℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量70％进行醇沉，0-10℃静置24小时，过滤，得滤液，40℃-75℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位15.3g，其中总黄酮含量质量分数为51.6％，酚类、甾体类成分质量分数总和为23.7％，三者含量总和为75.3％。
(3)将挥发油有效部位21.2g和非挥发性有效部位15.3g作为原料药制成软胶囊。
其余按照实施例2-3提供的方法操作。
试验例13
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加20倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油4小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位23.8g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为79.3％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加60％乙醇，回流提取2次，提取时间为1h，过滤，合并滤液，与蒸馏后的水溶液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上已预处理好的大孔树脂层析柱吸附，用5倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用5倍柱体积的30％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用5倍柱体积的70％的乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-75℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量80％进行醇沉，0-10℃静置36小时，过滤，得滤液，40℃-75℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位11.2g，其中总黄酮含量质量分数为56.8％，酚类、甾体类成分质量分数总和为12.1％，三者含量总和为68.9％。
(3)将挥发油有效部位23.8g和非挥发性有效部位11.2g作为原料药制成复合胶囊。
其余按照实施例2-1提供的方法操作。
试验例14
(1)山蜡梅叶分拣、干燥，称取1000g，加30倍水浸泡30min，水蒸气蒸馏提取挥发油5小时，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，得挥发油有效部位24.3g，其中1，8-桉叶素、芳樟醇两者在有效部位中含量质量分数和为62.3％；
(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加95％的乙醇，提取3次，提取时间为1h，过滤，合并各次滤液，与蒸馏水液合并，40℃-75℃减压浓缩，浓缩液上已预处理好的大孔树脂层析柱吸附，用6倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用6倍柱体积的30％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用6倍柱体积的70％的乙醇洗脱，洗脱液收集，40℃-75℃减压浓缩，冷却后加入乙醇至含醇量90％进行醇沉，0-10℃静置48小时，过滤，得滤液，40℃-75℃减压回收乙醇，喷雾干燥即得非挥发性有效部位10.6g，其中总黄酮含量质量分数为58.7％，酚类、甾体类成分质量分数总和为8.2％，三者含量总和为64.9％。
(3)将挥发油有效部位24.3g和非挥发性有效部位10.6g作为原料药制成分散片。
其余按照实施例2-3提供的方法操作。
Claims (15)
1、山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征在于该方法依次包括下列步骤：
步骤(1)山蜡梅叶分拣、干燥，加水浸泡30min-1h，水蒸气蒸馏提取挥发油，收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，作为挥发油有效部位；
步骤(2)蒸馏后的水溶液另器保存；药渣加溶剂提取，过滤，收集提取液，与蒸馏后的水溶液合并，减压浓缩，浓缩液上大孔树脂层析柱吸附，用2-6倍柱体积水洗脱，水洗液弃掉，继续用2-6倍柱体积的10％-30％的乙醇洗脱，洗液弃掉，继续用2-6倍柱体积的30％-90％的乙醇洗脱，洗脱液收集，减压浓缩，冷却后用醇溶解，静置，过滤，得滤液，减压回收乙醇，干燥即得非挥发性有效部位；
步骤(3)将挥发油有效部位和非挥发性有效部位按山蜡梅药材实际生药提取量1.0-2.6∶0.5-3.5重量配比入药，即为山蜡梅有效部位群。
2、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是：步骤(1)中加水量为生药材的6-30倍，提取时间为1-6小时。
3、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是步骤(2)中药渣加溶剂为水或10％-95％的乙醇，提取次数为1-4次，每次提取时间为30min-2h。
4、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是步骤(2)中减压浓缩温度为40℃-75℃。
5、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是步骤(2)中用醇溶解工序是指加入乙醇至含醇量40％-95％进行溶解。
6、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是步骤(2)用醇溶解工序中静置时间为6-48小时。
7、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是步骤(2)用醇溶解工序中静置温度为0-25℃。
8、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是所使用的干燥方法为喷雾干燥、减压干燥(真空)或常压干燥。
9、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是挥发油有效部位在山蜡梅干燥药材中的质量分数得率为1.0％-2.6％。
10、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是挥发油有效部位主要含有1，8-桉叶素、芳樟醇，其两者在有效部位中含量质量分数总和为50％-88％。
11、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是非挥发性有效部位在山蜡梅干燥药材中的质量分数得率为0.5％-3.5％。
12、根据权利要求1所述的山蜡梅有效部位群的制备方法，其特征是非挥发性有效部位主要含有黄酮、酚类、甾体和三萜类成分，其中总黄酮、总酚和甾体类成分三者质量分数总和为50％-90％。
13、根据权利要求1-12所述方法提取的山蜡梅有效部位群。
14、一种含有权利要求13所述的有效部位群的制剂，其特征是：有效部位群制备的制剂可为颗粒剂、软胶囊、胶囊、滴丸、片剂、复合胶囊和分散片中的一种。
15、根据权利要求13所述的有效部位群及其制剂在防治呼吸系统疾病、抗感冒、抗菌、抗炎、抗病毒、抗真菌等药物中的应用。
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