CN102000127B

CN102000127B - 蜡梅属植物抑制乙酰胆碱酯酶活性部位的制备及其应用

Info

Publication number: CN102000127B
Application number: CN201010542318A
Authority: CN
Inventors: 朱笃; 王凌云; 张志斌; 刘易鑫; 颜日明; 邹峥嵘
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: CN102000127A

Abstract

本发明属于中药制药领域，涉及蜡梅属植物抑制乙酰胆碱酯酶活性部位的制备及其应用。蜡梅属植物活性部位制备方法为乙醇浸提，低极性溶剂萃取，酸溶碱沉氯仿萃取或碱溶酸沉、离心和乙酸乙酯萃取，所提取的活性部位包括3类物质，分别是：生物碱类、黄酮类和香豆素类。本发明所述的活性部位具有较强的抑制乙酰胆碱酯酶活性作用，在制备预防和治疗乙酰胆碱缺失导致的相关症状或疾病，尤其是防治老年性痴呆的药物中具有广泛的用途。

Description

蜡梅属植物抑制乙酰胆碱酯酶活性部位的制备及其应用

技术领域

本发明属于中药制药领域，涉及从蜡梅属植物中分离提取活性部位，特别涉及乙酰胆碱酯酶抑制活性部位的制备方法，所得活性部位具有较强的抑制乙酰胆碱酯酶活性作用，该活性部位物质可预期作为防治老年性痴呆药物的用途。

背景技术

蜡梅Chimonanthus praecox(L.)Link系蜡梅科Calycanthaceae植物，分布于我国华中、华南、华东以及云贵高原地区，其花、叶均有散发香气的芳香油，具有极高的药用和食用价值。当前对蜡梅属植物的研究重点是叶的挥发油成分，包括桉叶素、芳樟醇、α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、樟脑和龙脑等主要成分；而对非挥发油成分的研究近年也呈上升趋势，主要集中在蜡梅叶生物碱、黄酮及香豆素类物质的研究上，该类物质被证明具有抑菌、抗炎、解热、镇咳及增强免疫力等功效。鉴于此，开发蜡梅属植物的非挥发性生物活性成分就显得尤为重要。

老年痴呆症是严重危害人类健康的神经退行性疾病。Alzheimer disease(简称AD)是一种主要老年痴呆症，随着社会老龄化的加速，AD已成为人类继冠心病、癌症之后第三大死因。迄今尚未有治愈老年痴呆症的有效手段，但服用乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)是目前治疗老年痴呆症最有效的治疗方式。根据抗炎药物可以影响老年性痴呆疾病发展的思路，我们从蜡梅属植物的根、茎、叶、花各部位提取物中，用乙酰胆碱酯酶抑制作用为筛选指标，追踪其有效抑制乙酰胆碱酯酶的活性部位，并从中得到抑制乙酰胆碱酯酶作用较强的黄酮、生物碱和香豆素类活性部位。此类活性部位的发现为制备与乙酰胆碱缺失相关疾病的治疗药物及预防保健品提供了充足的原材料。

目前蜡梅属植物的药效研究主要集中在抑菌、抗病毒、预防流感等方面，关于其提取成分抑制乙酰胆碱酯酶活性的文献和专利尚未见报道，本发明是首次从蜡梅属植物中分离到具有抑制乙酰胆碱酯酶活性部位的报道，也为从传统中药资源中开发新的老年性痴呆药物尤其是乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物提供新的发展思路。

发明内容

本发明的目的是提供从蜡梅属植物中分离提取乙酰胆碱酯酶抑制活性部位及其制备方法，该活性部位物质可预期作为防治老年性痴呆药物的用途。

本发明所述的从蜡梅属植物中分离提取乙酰胆碱酯酶抑制活性部位的制备及其应用，具体工艺步骤如下：

a.称取蜡梅叶为原料，晾干、粉碎，用体积百分浓度为50～80％的乙醇溶液提取3次，各次所用乙醇溶液的质量依次为蜡梅叶原料质量的10倍、8倍和8倍，每次提取8～12小时，将三次的提取液用纱布过滤后合并；

b.将上述合并后的提取液在低于80℃的温度下，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得乙醇提取物，将其30～60℃烘干成浸膏备用；

c.称取蜡梅叶浸膏200～300克，用5～15％的醋酸水溶液将其分散后，用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取5～15次，收集酸水相和乙酸乙酯相以及不溶的沉淀；

d.步骤c所得酸水相用碳酸钠碱化至溶液pH为8.0～10.0，得碱水相，碱水相用氯仿萃取，每次500mL，萃取5～10次，收集氯仿相，所得的氯仿相经过碘化铋钾显色，确定其主活性部位为生物碱类物质；

e.步骤c所得乙酸乙酯相用5～10％的碳酸钠水溶液萃取，每次500mL，萃取8～15次，得到乙酸乙酯层和碱水层；随后收集碱水层用盐酸酸化至溶液pH为5.0～6.0，酸化后有大量的沉淀析出，离心并分别收集沉淀和上清，所得沉淀通过三氯化铝显色，确定其主活性成分为黄酮类物质；

f.步骤e离心所得上清用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取6～10次，收集乙酸乙酯相，采用氢氧化钾检识方法确定其主成分为香豆素类物质。

本发明得到的活性部位，即生物碱类、黄酮类及香豆素类具有抑制乙酰胆碱酯酶的作用，提供了可用于制备与乙酰胆碱缺失引起的相关疾病的治疗药物或保健品，包括但不限于防治老年性痴呆症的医药或保健品用途。

本发明所述活性部位的制备原来其主要来源于任意一种中国产的蜡梅属植物，包括蜡梅、突托蜡梅、山蜡梅、柳叶蜡梅等；可以是干品或鲜品；可以是蜡梅属植物的根、茎、叶、花、种子、皮、果实，也可以是它们的混合物。

本发明的有益成果：

(1)本发明提供了一种新的乙酰胆碱酯酶抑制剂的药源途径和制备方法，蜡梅属植物活性部位黄酮、生物碱和香豆素类首次被发现具有乙酰胆碱酯酶抑制活性功效。该药源原料来源丰富，制备工艺合理、可行，易于实现产业化；

(2)本发明提供的活性部位具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，此研究结果在此前尚未见报道；所得活性部位物质可以用在制备与乙酰胆碱缺失相关疾病(如老年性痴呆症、血管性痴呆、中风、学习记忆功能障碍等疾病)的药物中。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进行进一步阐明，但并不限于本发明的内容。

实施例1

1、蜡梅属植物活性部位生物碱的制备

a.称取蜡梅叶为原料，晾干、粉碎，用体积百分浓度60％的乙醇溶液提取3次，各次所用乙醇溶液的质量依次为蜡梅叶原料质量的10倍、8倍和8倍，每次提取10小时，将三次的提取液用纱布过滤后合并；

b.将上述合并后的提取液在45℃的温度下，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得乙醇提取物，将其40℃烘干成浸膏备用；

c.称取蜡梅浸膏250克，用10％的醋酸水溶液将其分散后，用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取10次，收集酸水相和乙酸乙酯相以及不溶的沉淀。

d.将上述酸水相用碳酸钠碱化至溶液pH为10.0，得碱水相，碱水相用氯仿萃取，每次500mL，萃取6次，收集氯仿相；

e.取1mL氯仿相溶液加入小试管，向试管中加入几滴碘化铋钾溶液，出现橘红色沉淀，根据颜色初步确定氯仿相中活性成分为生物碱类物质；

2、活性部位生物碱乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定

(1)方法

a.药品与试剂：碘化硫代乙酰胆碱(acetylthiocholine iodide，ATCI)、5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(dithiobis-nitrobenzoic acid，DTNB)和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)纯品均购自Sigma公司；石杉碱甲(Huperzine A，HupA)购自中国药品生物制品检定所，其他试剂均为分析纯；

b.在EP管中加入氯仿相样品或HupA标准品40μL，30μL 0.22U·mL^-1 AChE，30μL 15mM ATCI，磷酸缓冲液补平体系至终体积为190μL，混和37℃孵育30min，加10μL 4％SDS室温下终止反应20min，移入96孔板上，加3mM DTNB显色剂125μL显色5min，410nm处酶标仪检测，试验同时设有空白对照、标准对照、阳性对照、样品颜色对照。

按如下公式计算抑制率：

I(％)＝[(OD^--OD⁺)-(OD_样品-OD_本底)]/(OD^--OD⁺)×100％

(2)抑制率测定结果

通过对乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究发现，依据本发明提供的制备方法获得的生物碱具有显著的活性(结果见表1)。

表1不同浓度生物碱类物质对乙酰胆碱酯酶的抑制效果(3次重复)

通过实验证明：本发明制备的氯仿相生物碱具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，在不同浓度下氯仿相生物碱都具有抑制活性，1mg/mL的氯仿相部位生物碱与0.1mg/mL标准品石杉碱甲抑制活性相当。本实验表明该生物碱活性成分具有较强抑制乙酰胆碱酯酶的作用，有望进一步发展成为预防老年痴呆症的药物。

实施例2

1、蜡梅属植物活性部位黄酮类的制备

蜡梅属植物叶原料的处理和浸膏的获得同实施例1活性部位生物碱的制备步骤a，b，c，以后制备步骤如下；

d.将上述乙酸乙酯相用10％的碳酸钠水溶液萃取，每次500mL，萃取8次，收集碱水层；

e.将收集的碱水层用盐酸酸化至溶液pH为6.0，酸化后有大量的沉淀析出，离心并收集沉淀；

f.取沉淀用乙醇溶解，通过TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝7∶3)展开后，喷洒三氯化铝溶液，紫外长波下显黄色荧光，初步确定沉淀为黄酮类物质。

2、活性部位黄酮类物质乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定

(1)活性部位黄酮类物质乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定方法同实施例1，不同之处在于EP管中加入黄酮类样品；

(2)抑制率测定结果

通过对乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究发现，依据本发明提供的制备方法获得的黄酮类物质具有显著的活性(结果见表2)。

表2不同浓度黄酮类物质对乙酰胆碱酯酶的抑制效果(重复3次)

通过实验证明：本发明制备的黄酮类活性物质具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，发现不同浓度下黄酮类物质都具有抑制活性，1mg/mL的黄酮类物质抑制活性最高达到77％。本实验表明黄酮类活性部位具有抑制乙酰胆碱酯酶的作用，具有较强的开发潜力。

实施例3

1、蜡梅属植物活性部位香豆素类的制备步骤

蜡梅属植物叶原料的处理和浸膏的获得同实施例1活性部位生物碱的制备步骤a，b，c，d，以后制备步骤如下；

e.将收集的碱水层用盐酸酸化至溶液pH为6.0，酸化后有大量的沉淀析出，离心收集上清，上清用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取6次，收集乙酸乙酯相；

f.将乙酸乙酯相经TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝6∶4)展开后，喷洒5％的氢氧化钾乙醇溶液，紫外下出现蓝色荧光加强现象，确定乙酸乙酯相为香豆素类物质；

2、活性部位香豆素类物质乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定

(1)活性部位香豆素类物质乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定方法同实施例1，不同之处在于EP管中加入乙酸乙酯相香豆素类样品；

(2)抑制率测定结果

通过对乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究发现，依据本发明提供的制备方法获得的黄酮类物质具有显著的活性(结果见表3)。

表3不同浓度香豆素类对乙酰胆碱酯酶的抑制效果(重复3次)

实验证明：本发明制备的香豆素类活性物质具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，1mg/mL的香豆素类物质抑制活性最高达到92％，在0.1mg/mL浓度下，其乙酰胆碱酯酶的抑制率也在60％左右，说明香豆素类物质具有显著的抑制活性。本实验表明蜡梅属植物中香豆素类活性部位具有显著抑制乙酰胆碱酯酶活性的作用，可期待用于制备与乙酰胆碱缺失引起的相关疾病的治疗药物或保健品的原材料。

Claims

1.蜡梅叶活性部位在制备抑制乙酰胆碱酯酶活性药物中的应用，其特征在于所述的蜡梅叶活性部位为生物碱类物质或黄酮类物质或香豆素类物质；所述生物碱类物质制备步骤为：

c.称取蜡梅叶浸膏200～300克，用5～15％的醋酸水溶液将其分散后，用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取5～15次，收集酸水相和乙酸乙酯相；

d.将上述酸水相用碳酸钠碱化至溶液pH为8～10，得碱水相，碱水相用氯仿萃取，每次500mL，萃取5～10次，收集氯仿相；

e.利用碘化铋钾显色法确定氯仿相为生物碱类活性物质；

所述黄酮类物质制备步骤为：

d.将上述乙酸乙酯相用5～15％的碳酸钠水溶液萃取，每次500mL，萃取5～10次，收集碱水层；

e.将收集的碱水层用盐酸酸化至溶液pH为5.0～6.0，酸化后有大量的沉淀析出，离心并收集沉淀；

f.将收集的沉淀取出部分用少量的水溶解后，采用三氯化铝检测法确定沉淀物为黄酮类活性物质；

所述香豆素类物质制备步骤为：

e.将收集的碱水层用盐酸酸化至溶液pH为5.0～6.0，酸化后有大量的沉淀析出，离心收集上清，上清用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取5～10次，收集乙酸乙酯相；

f.将收集的乙酸乙酯相组合物采用氢氧化钾检识确定其为香豆素类活性物质。