TWI466674B - 臺灣梭羅木之生物活性組合物 - Google Patents
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Description
本發明係關於臺灣梭羅木(Reevesia formosana
)之根部擁有抗腫瘤活性之強心苷(cardenolide)化合物。
從微生物，植物，動物與礦物等天然資源，運用各種分離技術獲得天然物不論是否已知，可提供新穎之生物活性，均可作為臨床藥物之重要資源。
梧桐科之臺灣梭羅木(Reevesia formosana
Sprague)，係生長於台灣南部之落葉植物。世界上梭羅樹屬(Reevesia)植物約25種，主要集中於亞洲南部，兩種分佈於美洲中部，十四種生長於中國，但臺灣僅有一種。2003年朱慧等人於中草藥期刊，揭示從長柄梭羅(R
.longipetiolata
)曾經分離五個已知化合物，分別為β-類固醇(β-sitosterol)、胡蘿蔔苷(daucosterol)、白樺脂酸(betulinic acid)，羽扇豆醇(lupeol)和兒茶素(catechin)。
早期之分離技術偏重於天然物之結構式、安定性以及定量，因而分離純化之重心在於獲取精油(volatile oil)、類黃酮(flavonoids)、生物鹼(alkaloid)或皂素(saponin)等二次代謝產物(secondary metabolism)。期間運用如濾紙層析(paper chromatography)、薄膜層析(thin layer chromatography)、管柱層析(column chromatography)、氣相層析、高效率液相層析分析儀(high performance liquid chromatography,HPLC)、氣相層析質譜分析(GC MASS)、超臨界流體層析(supercritical fluid chromatography,SFC)等層析分離技術，從天然物分離出植物成分或二次代謝產物。而經由各種生物活性之評估試驗，分別確任所分離成分之生理活性。
目前天然物之研發，普遍將分離之策略則偏重於活性成分。將採集之天然物利用酒精或含水酒精萃取，粗萃取物則依照不同極性溶媒分配(partition)後獲得劃分區(fraction)，讓各種生物活性試驗進行各劃分區活性之評估，所篩選具活性之劃分區再運用分離純化技術獲得成分之生理活性。此類結合化學成份與活性分析模式，泛稱為生物活性導向之分離技術(Bioassay-guided fractionation)。
發明人鑑於臺灣梭羅木(Reevesia formosana Sprague)植物之活性化學成分尚未被研究，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「臺灣梭羅木之生物活性組合物」，獲得抗腫瘤活性之強心苷(cardenolide)化合物，以下為本案之簡要說明。
本發明之一目的在於提供具有抗癌活性之化合物及其醫藥組合物。
根據本發明之構想，係提供一種強心苷衍生物，其結構係以式(I)化合物為其基本架構，
其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R5
可為氫基或氫氧基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲烷基、甲醛基或甲酸基；R16
可為氫基或乙酸基；R17
可為含酮基之環氧五員環，或亦可與R13
共同形成含環氧化合物之螺雙環。
根據上述構想，本發明係從臺灣梭羅木(Reevesia formosana
)之根部獲得如式(I)之強心苷系列衍生物，該化合物可與一醫藥可接受之載體，形成一醫藥組成物，以抑制腫瘤細胞之活性作用。
根據上述構想，將採集之臺灣梭羅木根經風乾後細切成薄片，於室溫下以冷卻之甲醇萃取，經揮除溶劑後，甲醇粗萃取物則以乙酸乙酯(EtOAc)和水分配(partition)，分別乙酸乙酯可溶性劃分區(fraction)及水可溶性劃分區。其中乙酸乙酯可溶性劃分區充填於矽膠管柱，運用正己烷-乙酸乙酯梯度溶媒沖提，獲得劃分區1至12，以及最後以甲醇沖提共形成13劃分區。該乙酸乙酯及水可溶性劃分區兩部分分別進行活性分析，顯示對人類乳癌細胞株(MCF-7)、人類大細胞肺癌細胞株(NCI-H460)和人類肝癌細胞株(HepG2)腫瘤細胞均具備殺傷作用。請參考表一，顯示9至13劃分區對MCF-7、NCI-H460和HepG2腫瘤細胞均具備較強之殺傷作用。
根據上述構想，乃選用矽膠、Sephadex LH-20、RP-C18
矽膠等材質之管柱，經由二氯甲烷(CH2
Cl2
)、乙酸乙酯(EtOAc)、正己烷(n
-hexane)、甲醇(MeOH)、丙酮(acetone)、水等溶媒或該等溶媒之混合進行後續之沖提與純化，請參考表二共J種模式。其中劃分區10充填於Sephadex LH-20管柱以100%之甲醇沖提，獲得劃分區10-1至10-13之13劃分區。劃分區10-3充填於RP-C18
管柱以甲醇：水(3:2)混合溶媒沖提，獲得劃分區10-3-1至10-3-12。
劃分區10-3-6充填於矽膠管柱，以二氯甲烷-丙酮(3:1)混合溶媒沖提，獲得劃分區10-3-6-1至10-3-6-7共7劃分區。劃分區10-3-10充填於矽膠管柱、以二氯甲烷-丙酮(3: 1)混合溶媒沖提，獲得劃分區10-3-10-1至10-3-10-5共5劃分區。劃分區11充填於Sephadex LH-20管柱，以100%之甲醇沖提，獲得劃分區11-1至11-9之9劃分區。劃分區11-2充填於RP-C18
管柱以甲醇-水(1:1)混合溶媒沖提，獲得14劃分區(劃分區11-2-1至11-2-14)。劃分區11-2-8充填於矽膠管柱以二氯甲烷-丙酮(3: 1)混合溶媒沖提，獲得劃分區11-2-8-1至11-2-8-9之9劃分區。
另外分別於劃分區10-3-8分離出化合物1(460毫克)，以正己烷-乙酸乙酯混合溶媒從劃分區10-3-5，獲得化合物8和9結晶之混合物(10.0毫克)。將濾除結晶之母液，充填於矽膠管柱，以二氯甲烷-丙酮(5:1)混合溶媒沖提，獲得劃分區10-3-5-1至10-3-5-7共7劃分區。劃分區10-3-6-2以RP-18之製備型薄層層析板進一步以丙酮-水(1:1)混合溶媒純化，獲得化合物2(2.0毫克)。劃分區11-2-8-7和劃分區11-2-8-8以製備薄膜層析法經由正己烷-二氯甲烷-丙酮(1: 1: 2)純化，獲得化合物3(9.0毫克)、4(14.0毫克)、5(2.8毫克)。劃分區10-3-10-3和10-3-10-4分別含有化合物7(63毫克)及6(11毫克)。劃分區10-3-5-2含有化合物12和13(1.7毫克)之混合物，劃分區10-3-5-5含有化合物10和11(7.0毫克)之混合物。
所分離純化之化合物分別以Yanaco顯微熔點測定儀(micromelting)，以及相關設備檢測紫外光譜(UV)、紅外光譜(KBr)、氫(1
H)和碳(13
C)之核磁共振光譜與單晶x射線繞射分析(Single-Crystal X-ray Crystallography)等數據以確認化合物之結構。如第一圖所示，化合物1之單晶x射線繞射分析圖。
化合物10和11之氫(1
H)和碳(13
C)之核磁共振光譜均與化合物8和9頗相似，化合物8和9之δH
10.05(1 Hs，H-19)，δc
207.9(C-19)呈現乙醛基；而δc
176.0(C-19)於化合物10和11呈現羧酸基。
強心苷(cardenolides)亦稱為強心類固醇，曾被發現於夾竹桃科、蘿摩科、菊科、十字花科、大戟科、百合科、桑科、毛茛科、玄參科等之植物。所採集之臺灣梭羅木根部，運用生物活性導向之分離技術，證實乙酸乙酯及水可溶性劃分區兩部分均對於人類乳癌細胞株(human breast adenocarcinoma,MCF-7)、人類大細胞肺癌細胞株(non-small-cell lung cancer,NCI-H460)和人類肝癌細胞株(liver hepatocellular cells,HepG2)等腫瘤細胞均具備殺傷作用。經分離純化所獲得之式(I)強心苷系列衍生物，綜合物性與相關化性數據(表四~八)，確認可區分為如式(II)或式(III)所示之化合物。其中化合物8與9係以6:5之比例混合，化合物10與11以及化合物12與13均係以3:2之比例混合。如表三所示，該等強心苷衍生物均對於MCF-7、NCI-H460和HepG2等腫瘤細胞具殺傷作用。
於式(II)化合物其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R5
可為氫基或氫氧基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲烷基、甲醛基或甲酸基；R16
可為氫基或乙酸基。
於式(III)化合物其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲醛基或甲酸基。
R3
取代基係特殊之糖基，分別為reevesiose、6-脫氧-2-O
-甲基-β-D-葡萄糖(6-deoxy-2-O
-methyl-β-D-glucose)、4,6-雙脫氧-2-O
-甲基-β-D-阿洛糖(4,6-dideoxy-2-O
-methyl-β-D-allose,b)和6-脫氧-2-O
-甲基-β-D-阿洛糖(6-deoxy-2-O
-methyl-β-D-allose)。
臺灣梭羅木根部獲得十三種強心苷系列衍生物，化合物reevesiosides A-I編碼為1-6、8、10、12以及epi
-reevesioside F-I編碼為7、9、11、13。化合物reevesiosides A-F與化合物epi
-reevesioside F共7種化合物之基本結構隸屬於式(II)，而化合物Reevesioside G-I與化合物epi
-Reevesioside G-I共6種化合物之基本結構隸屬於式(III)。
綜上所述經由生物活性導向之分離技術，甲醇粗萃取物再進行之乙酸乙酯可溶性劃分區(表一)以及表三所示上述十三種強心苷系列衍生物均對於MCF-7、NCI-H460和HepG2腫瘤細胞具備殺傷作用。
上述賦形劑或稱為『藥學上可接受之載體或賦形劑』、『生物可利用之載體或賦形劑』，係包括溶媒、分散劑、包衣、抗菌或抗真菌劑，保存或延緩吸收劑等任何習知用於製備成劑型之適當化合物。通常此類載體或賦形劑，本身不具備治療疾病之活性，且將本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，製備之各劑型，投與動物或人類不致於造成不良反應、過敏或其他不適當反應。因而本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，係適用於臨床及人類。運用本發明化合物之劑型經由靜脈、口服、吸入或經由鼻、直腸、陰道等局部或舌下等方式投藥，可達到治療效果。
該載體隨各劑型而不同，無菌注射之組成物可將溶液或懸浮於無毒之靜脈注射稀釋液或溶劑中，此類溶劑如1,3-丁二醇。其間可接受之載體可為甘露醇(Mannitol)或水。此外固定油或以合成之單或雙甘油酯懸浮介質，係一般習用之溶劑。脂肪酸，如油酸(Oleic acid)、橄欖油或蓖麻油等與其甘油酯衍生物，尤其經多氧乙基化之型態皆可作為製備注射劑並為天然醫藥可接受之油類。此等油類溶液或懸浮液可包含長鏈酒精稀釋液或分散劑、羧甲基纖維素或類似之分散劑。其他一般使用之介面活性劑如Tween、Spans或其他相似之乳化劑或是一般醫藥製造業所使用於醫藥可接受之固態、液態或其他可用於劑型開發之生物可利用增強劑。
用於口服投藥之組合物則係採用任何一種口服可接受之劑型，其型式包括膠囊、錠劑、片劑、乳化劑、液狀懸浮液、分散劑、溶劑。口服劑型一般所使用之載體，以錠劑為例可為乳糖、玉米澱粉、潤滑劑，如硬脂酸鎂為基本添加物。而膠囊使用之稀釋液包括乳糖與乾燥玉米澱粉。製成液狀懸浮液或乳化劑劑型，係將活性物質懸浮或溶解於結合乳化劑或懸浮劑之油狀介面，視需要添加適度之甜味劑，風味劑或是色素。
鼻用氣化噴霧劑或吸入劑組成物，可根據已知之製劑技術進行製備。例如，將組成物溶於生理食鹽水中，添加苯甲醇或其他適合之防腐劑，或促吸收劑以增強生物可利用性。本發明化合物之組合物亦可製成栓劑，進行經直腸或陰道之投藥方式。
本發明化合物亦可運用『靜脈投藥』，其係包括經由皮下、腹腔、靜脈、肌肉，或關節腔內、顱內、關節液內、脊髓內注射，主動脈注射，胸腔注射，疾病部位內注射，或其他適合之投藥技術。對於不同病症之患者，約每日投與0.1mg至0.2 mg之活性成份。
本案所提出之「臺灣梭羅木之生物活性組合物」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
於37℃含5% CO2
空氣之培養箱將MCF-7(human breast adenocarcinoma)、NCI-H460(non-small-cell lung cancer)與HepG2(liver hepatocellular cells)培養於修改之Dulbecco’s Eagle’s培養基，其中添加10%胎牛血清和非必需之氨基酸(Life Technologies,Inc.)。人類癌細胞株係接種於96孔微孔板，MCF-7與NCI-H460每孔洞100μl之培養基分別培養細胞數量為6500、2500和7500。經過夜之適應期後，細胞株至少投與8個不同濃度之測試化合物，於二氧化碳培養箱培養72小時。依照1995年Gieni等人之MTS減少試驗(MTS reduction assay)，運用5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethylthiazoyl)-3-(4-sulfophenyl) tetrazolium salt(MTS)化合物，估計存活之細胞數目。該實驗並以二甲基亞碸(DMSO)(Promega,Madison,WI,USA)最後濃度0.1%作為對照組。由於二甲基亞碸控制一個百分比之結果，檢測結果可作為IC50
值之確定濃度反應(dose-response)曲線。當IC50
值為4 μg/mL認為屬於顯著之細胞毒性作用。每個IC50
值係樣本三次重複之試驗平均值。於96孔微孔板HepG2接種培養細胞數量為10000細胞/孔，進行相同之實驗。
萃取與分離實施例
臺灣梭羅木根經風乾後6.5公斤細切成薄片，於室溫下以冷卻之30 L甲醇萃取三次，經真空揮除溶劑。甲醇粗萃取物(150克)則以乙酸乙酯(EtOAc)和水分配(partition)，獲得45g乙酸乙酯可溶性劃分區(fraction)及100克水可溶性劃分區。此兩部分可溶性劃分區分別進行存活分析，顯示對MCF-7、NCI-H460和HepG2腫瘤細胞均具備殺傷作用。
乙酸乙酯可溶性劃分區(45g)充填於矽膠管柱(70-230篩，1.5公斤)，運用正己烷-乙酸乙酯梯度溶媒沖提，獲得劃分區1至12，以及最後以甲醇沖提共為13劃分區。劃分區9-13顯示對以上三種腫瘤細胞之殺傷作用較強。
劃分區10(2.4g)充填於Sephadex LH-20管柱以100%之甲醇沖提，獲得劃分區10-1至10-13之13劃分區。劃分區10-3(0.87 g)充填於RP-C18
管柱(20-40μm矽膠)以甲醇：水(3:2)混合溶媒沖提，獲得劃分區10-3-1至10-3-12。劃分區10-3-8含有化合物1(460 mg)，以正己烷-乙酸乙酯從劃分區10-3-5(144毫克)，獲得化合物8和9結晶之混合物(10.0毫克)。將濾除結晶之母液，充填於矽膠管柱，以二氯甲烷-丙酮(5:1)混合溶媒沖提，獲得劃分區10-3-5-1-10-3-5-7共7劃分區。
劃分區10-3-5-2含有化合物12和13(1.7毫克)之混合物，劃分區10-3-5-5含有化合物10和11(7.0毫克)之混合物。劃分區10-3-6(14.3毫克)充填於矽膠管柱(15-35μm矽膠)，以二氯甲烷-丙酮(3:1)混合溶媒沖提，獲得劃分區10-3-6-1至10-3-6-7共7劃分區。劃分區10-3-6-2充填於RP-18薄層進一步以丙酮-水(1:1)混合溶媒純化，得到化合物2(2毫克)。劃分區10-3-10(100毫克)充填於矽膠管柱(15-35μm矽膠)、以二氯甲烷-丙酮(3: 1)混合溶媒沖提，獲得5劃分區(劃分區10-3-10-1至10-3-10-5)，劃分區10-3-10-3和10-3-10-4分別含有化合物7(63毫克)及6(11毫克)。劃分區11(9 g)充填於Sephadex LH-20管柱，以100%之甲醇沖提，獲得9劃分區(劃分區-11-1至11-9)。劃分區11-2(0.74 g)充填於RP-C18
管柱(20-40μm矽膠)以甲醇：水(1：1)混合溶媒沖提，獲得14劃分區(劃分區11-2-1至11-2-14)。劃分區11-2-8(149毫克)充填於矽膠管柱(15-35μm矽膠)以二氯甲烷-丙酮(3: 1)混合溶媒沖提，獲得9劃分區(劃分區11-2-8-1至11-2-8-9)。
劃分區11-2-8-7和劃分區11-2-8-8以製備薄層矽膠色譜法經由正己烷-二氯甲烷-丙酮(1:1:2)純化，獲得化合物3(9毫克)、4(14毫克)、5(2.8毫克)。
實施例 製備注射劑之組合物
依量秤取成分，溶於注射用液體，製備成注射劑。
reevesiosides A 0.135mg/vial(1.1mL)
注射用液體 qs
1. 一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(I)化合物，
其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R5
可為氫基或氫氧基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲烷基、甲醛基或甲酸基；R16
可為氫基或乙酸基；R17
可為含酮基之環氧五員環，或亦可與R13
共同形成含環氧化合物之螺雙環。
2.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(II)化合物，
其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R5
可為氫基或氫氧基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲烷基、甲醛基或甲酸基；R16
可為氫基或乙酸基。
3.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(III)化合物，
其中該R3
取代基可為氫基或糖基；
R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲醛基或甲酸基。
4.一種強心苷化合物，具有如式(I)所示之結構，
其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R5
可為氫基或氫氧基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲烷基、甲醛基或甲酸基；R16
可為氫基或乙酸基；R17
可為含酮基之環氧五員環，或亦可與R13
共同形成含環氧化合物之螺雙環。
5.一種強心苷化合物，具有如式(II)所示之結構，
其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R5
可為氫基或氫氧基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲烷基、甲醛基或甲酸基；R16
可為氫基或乙酸基。
6.一種強心苷化合物，具有如式(III)所示之結構，
其中該R3
取代基可為氫基或糖基；R10
可選自以下群組之一，氫基、氫氧基、甲醛基或甲酸基。
7.一種製備臺灣梭羅木根部萃取物之方法，其係將採集之臺灣梭羅木根部，以溶媒萃取，萃取物經分配(partition)，再分離。
8.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之reevesioside A化合物。
9.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之reevesioside B化合物。
10.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之reevesioside C化合物。
11.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之reevesioside D化合物。
12.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之reevesioside E化合物。
13.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之reevesioside F化合物。
14.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之epi
-reevesioside F化合物。
15.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之Reevesioside G化合物。
16.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之epi
-Reevesioside G化合物。
17.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之Reevesioside H化合物。
18.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之epi
-Reevesioside H化合物。
19.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之Reevesioside I化合物。
20.一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之epi
-Reevesioside I化合物。
21.一種強心苷化合物，係為reevesioside B化合物。
22.一種強心苷化合物，係為reevesioside C化合物。
23.一種強心苷化合物，係為reevesioside D化合物。
24.一種強心苷化合物，係為reevesioside E化合物。
25.一種強心苷化合物，係為reevesioside F化合物。
26.一種強心苷化合物，係為epi
-reevesioside F化合物。
27.一種強心苷化合物，係為Reevesioside G化合物。
28.一種強心苷化合物，係為epi
-Reevesioside G化合物。
29.一種強心苷化合物，係為Reevesioside H化合物。
30.一種強心苷化合物，係為epi
-Reevesioside H化合物。
31.一種強心苷化合物，係為Reevesioside I化合物。
32.一種強心苷化合物，係為epi
-Reevesioside I化合物。
33.一種強心苷化合物，係為reevesioside A化合物。
34.一種製備臺灣梭羅木根部萃取物之方法，其係將採集之臺灣梭羅木根部，以含醇溶媒萃取，粗萃取物則經分配(partition)，運用管柱分離。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
朱慧等人，中草藥，2003年第34卷第11期第976~978頁長柄梭羅細胞毒活性部位的化學成分研究。
第一圖 化合物1之單晶x射線繞射分析圖
Claims (5)
- 一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(II)化合物，
- 一種醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(III)化合物，
- 一種強心苷化合物，具有如式(II)所示之結構，
- 一種強心苷化合物，具有如式(III)所示之結構，
- 一種製備臺灣梭羅木根部萃取物之方法，其係將採集之臺灣梭羅木根部經風乾後細切成薄片，於室溫下以冷卻之甲醇萃取，經揮除溶劑後，甲醇粗萃取物則以乙酸乙酯(EtOAc)和水分配(partition)，分別乙酸乙酯可溶性劃分區(fraction)及水可溶性劃分區；其中乙酸乙酯可溶性劃分區充填於矽膠管柱，運用正己烷-乙酸乙酯梯度溶媒沖提，最後以甲醇沖提。
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