CN101724009A

CN101724009A - 一种泽泻三萜类化合物提取纯化工艺

Info

Publication number: CN101724009A
Application number: CN200810197317A
Authority: CN
Inventors: 尹春萍
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2010-06-09

Abstract

本发明提供了一种泽泻三萜类化合物的提取纯化工艺，本发明通过对5种大孔吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，筛选出吸附泽泻中三萜化合物的最佳树脂，即HPD-100型大孔吸附树脂。本发明分离纯化工艺上样前采用50％乙醇溶解，使树脂的吸附量不降低，本发明披露了80％乙醇溶液基本能把泽泻三萜类化合物和23-乙酰泽泻醇B洗脱完全的结果，本发明工艺中的洗脱溶液浓度选择80％乙醇，因而本发明工艺基本能把泽泻三萜类化合物和23-乙酰泽泻醇B洗脱完全。本发明工艺综合考虑了泽泻三萜类化合物含量和23-乙酰泽泻醇B的含量两个指标，使提取纯化工艺更加合理，更加科学。

Description

一种泽泻三萜类化合物提取纯化工艺

技术领域

本发明涉及中药，特别涉及中药有效成分提取纯化工艺，具体涉及泽泻三萜类化合物提取纯化。

背景技术

泽泻为泽泻科植物泽泻(Alisma orientalis(Sam.)Juzep.)的干燥块茎，性寒，味甘、淡，入肾、膀胱经，味甘、淡，可渗湿，性寒能泻肾及膀胱之热，为常用的利水、渗热、泻热药物，临床上常用于小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛、高血脂症等的治疗。对泽泻的化学成分研究表明：泽泻中含有挥发油、生物碱、天门冬素、脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸)、树脂、蛋白质、淀粉和系列三萜类[泽泻醇A、B、C，24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇C等]以及系列倍半萜类(orientalol A、B、C、D等)等成分，其中泽泻醇A、B、C和24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇C具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝作用，为泽泻的主要活性成分。前期的药理试验中，已经筛选出泽泻防治泌尿系统结石的有效部位，并经结构鉴定，初步确定其为三萜类化合物。本文旨在以泽泻中总三萜的含量以及23-乙酰泽泻醇B的含量为指标，考察以大孔吸附树脂富集泽泻中三萜类化学成分的工艺。

发明内容

本发明的任务是提供一种泽泻三萜类化合物提取纯化工艺。

本发明通过对5种大孔吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，筛选出吸附泽泻中三萜化合物的最佳树脂，即HPD-100型大孔吸附树脂，其他文献未见相关报道。该树脂属于非极性树脂，由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又称芳香族吸附树脂，因具有比较大的孔，适用于大分子物质的吸附，且洗脱性良好，被吸附物可以容易地被洗脱下来，因此适用范围广泛，在医药食品领域评价很好。且经本实验证明该树脂对于泽泻有效部位的纯化作用优于其它树脂。在应用大孔吸附树脂分离纯化中药有效部位的传统实验中，上样前的供试品多用蒸馏水溶解，本实验采用50％乙醇溶解是因为泽泻中所含三萜类化合物极性较小，不能用蒸馏水溶解上样，若用浓度高的乙醇溶解，虽然三萜类化合物在浓度高的醇溶液中溶解度较好，但树脂的吸附量又会降低，所以选择50％乙醇溶解。洗脱溶液浓度选择80％乙醇是因为80％乙醇溶液基本能把总三萜和23-乙酰泽泻醇B洗脱完全，而综合考虑泽泻三萜类化合物含量和23-乙酰泽泻醇B的含量两个指标使该方法更加科学合理。

实现本发明的技术方案

本发明提供的泽泻三萜类化合物提取纯化工艺的步骤是：(1)称取泽泻粗粉加入50％的甲醇，回流提取过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状，即得泽泻粗浸膏；(2)将制得的泽泻粗浸膏加入水分散，用水饱和的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥，得到泽泻精制浸膏；(3)将制得的泽泻精制浸膏用50％乙醇溶解，制得到浓度为0.2g生药/ml的上柱液，分别以1.0ml/min的流速上样于67ml体积的HPD-100树脂柱，后以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类、多糖和苷类，再用30％乙醇洗脱，然后用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇，得总固物，即为泽泻三萜类化合物。

本发明通过对5种大孔吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，筛选出吸附泽泻中三萜化合物的最佳树脂，即HPD-100型大孔吸附树脂，其他文献未见相关报道。该树脂属于非极性树脂，由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又称芳香族吸附树脂，因具有比较大的孔，适用于大分子物质的吸附，且洗脱性良好，被吸附物可以容易地被洗脱下来，因此适用范围广泛，在医药食品领域评价很好。且经本发明实验证明该树脂对于泽泻有效部位的纯化作用优于其它树脂。在应用大孔吸附树脂分离纯化中药有效部位的传统工艺中，上样前的供试品多用蒸馏水溶解，本实验采用50％乙醇溶解是因为泽泻中所含三萜类化合物极性较小，不能用蒸馏水溶解上样，若用浓度高的乙醇溶解，虽然三萜类化合物在浓度高的醇溶液中溶解度较好，但树脂的吸附量又会降低，而本发明选择50％乙醇溶解，使树脂的吸附量不降低。本发明披露了80％乙醇溶液基本能把泽泻三萜类化合物和23-乙酰泽泻醇B洗脱完全的结果，本发明工艺中的洗脱溶液浓度选择80％乙醇，因而本发明工艺基本能把泽泻三萜类化合物和23-乙酰泽泻醇B洗脱完全。本发明工艺综合考虑泽泻三萜类化合物含量和23-乙酰泽泻醇B的含量两个指标使本发明工艺更加合理，更加科学。

实验资料

1仪器和试药

1.1仪器

紫外-可见光分光光度计(UV-cary)；

精密电子分析天平(精确到十万分之一：AG285，METTLER TOLEDO)

1.2试药

泽泻：购于武汉市汉口国药有限公司，产于福建毫州，批号为：071001。经华中科技大学同济医学院药学院生药教研室尹春萍教授鉴定为泽泻科植物泽泻(Alisma orientalis(Sam.)Juzep.)的干燥块茎。乙醇、乙酸乙酯、高氯酸、冰醋酸、香草醛等试剂为分析纯，乙腈为色谱纯。

对照品23-乙酰泽泻醇B：由南京中医药大学提供，23-乙酰泽泻醇B的制备方法参见[彭国平，潘林梅，文红梅等.泽泻的对照品研究[J].南京中医药大学学报.2001；17(3)：154-156.]。经HPLC峰面积归一法确认其纯度大于98％，可供含量测定用。

2方法和结果

2.1树脂的预处理树脂先用乙醇充分浸泡，然后用乙醇洗至加适量水无白色混浊，再用纯净水洗至洗脱液无醇味，去醇后再进行酸碱处理：先用5％HCl(V/V)溶液浸泡3h，然后用去离子水洗至中性，接着用5％NaOH溶液浸泡3h，最后用去离子水洗至中性，最后用水浸泡备用。

2.2三萜类成分的含量测定

供试品溶液的制备：称取泽泻粗粉80g，加入8倍量(V/V)50％的甲醇，回流提取三次，每次为1.5h。过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状，加入100ml水分散，分别用100ml水饱和的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥。将浸膏用50％乙醇400ml溶解，制备成上柱前的泽泻供试品溶液，浓度相当于0.2g生药/ml。

对照品溶液的制备：再精密称取2.58mg干燥至恒重的23-乙酰泽泻醇B对照品，加色谱纯乙腈溶解并定容至5ml，作为对照品溶液，浓度为0.516mg/ml。

含量测定方法：采用紫外-可见光分光光度计法进行测定。取3支具塞试管，一支试管作为空白管，另两支分别精密加入对照品溶液和供试品溶液，水浴挥去溶剂，冷却，分别加入5％香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸，混匀，密塞。置60℃恒温水浴中加热20min，取出，冰水浴冷却，分别加乙酸乙酯5ml，摇匀，室温放置10min后，在554nm处测定吸光度。加入试剂的量如表1：

表1加入试剂的量

2.3静态吸附实验

2.3.1大孔吸附树脂的筛选精确称取约1.0g抽滤至干的预处理过的下列树脂，置于250mL具塞磨口锥形瓶中，加100mL上述泽泻供试品溶液，置于恒温摇床上震荡吸附24h，充分吸附后过滤，测定剩余总三萜乙醇溶液中总三萜的浓度，计算各树脂对总三萜的吸附容量(mg/g干树脂)。过滤后的树脂精密加入80％乙醇100ml进行解吸附，解吸完过滤，紫外-可见光分光光度计法测定各滤液浓度，并计算解吸率。结果如表2：

表2 5种大孔吸附树脂对于泽泻总三萜的静态吸附效果

结论：选择HPD-100型，满足Q最大，而且解吸率达到85％以上。

2.4上样流速对HPD-100型树脂吸附的影响

以相同浓度(0.2g/ml)及体积(150ml)的泽泻供试品溶液，控制流速分别为0.5ml/min、1.0ml/min、1.5ml/min进行动态吸附，柱床体积(BV)为10ml。结果见图1。从图1可得，流速为2ml/min时，第1BV过柱液就发生泄漏，上样11BV附近吸附速度明显减缓；而流速为0.5ml/min，1.0ml/min时，第2BV过柱液开始检测到总三萜，两者均在上样12BV时吸附缓慢，为使上样液在树脂间充分扩散，吸附，流速不宜过快，故选择以1.0ml/min的流速上样。

2.5动态吸附曲线的考察

取HPD-100型树脂，湿法装柱，柱床体积为10ml，取上述泽泻供试品溶液以1ml/min的速度上柱吸附，10ml树脂共计吸附15BV的泽泻供试溶液，每处理1BV收集过柱液，每次1BV，紫外法分别测定以上过柱液中总三萜的含量，动态吸附曲线结果见图2。由图2可见，HPD-100型树脂吸附此浓度的供试品溶液，过柱泄漏点在第6BV，从第7BV开始泄漏已达30％以上。即10ml的HPD-100型树脂达到过柱泄漏点对于总三萜的吸附量为108.48mg。

2.6HPD-100型树脂洗脱液的选择

按照上述实验确定的最大上样量，另取20g泽泻，按供试品溶液的制备项下方法制备，所得泽泻供试品溶液上样于已处理的树脂柱，以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类，多糖和苷类。再依次用浓度为10％，30％，50％，70％，80％，95％的乙醇溶液各150ml以2ml/min流速洗脱，分别用试管收集各乙醇洗脱液，收集溶液体积分别为(50ml，50ml，25ml，25ml)，各取1ml挥干溶剂后作为样品，测定泽泻总三萜的含量，把剩下的各浓度洗脱液分别合并，减压蒸馏并定容至10ml，进行HPLC-ELSD测定其23-乙酰泽泻醇B的含量，结果见图3和图4。结果表明：80％乙醇洗脱液对泽泻三萜类化合物的洗脱效果最好，而且80％乙醇可将泽泻中大约90％的三萜类化合物洗脱下来，因此确定HPD-100型树脂分离纯化泽泻总三萜的最佳洗脱溶剂为80％乙醇。操作步骤为：上样后，先以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类，多糖和苷类。再用浓度为30％的乙醇溶液洗脱水溶性杂质，然后用80％乙醇溶液以2ml/min流速洗脱，收集80％乙醇洗脱液。

2.7洗脱溶剂用量的考察

按照上述实验确定的最大上样量，将20g泽泻所得供试品溶液上样于已处理的树脂柱，以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类，多糖和苷类。再以400ml30％乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，每100ml为一份，分别挥干溶剂，干燥称重。然后以500ml80％乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，每100ml为一份，适当浓缩后，取适量分别用紫外和HPLC方法测定其中泽泻总三萜和23-乙酰泽泻醇B的含量，结果见表3，表4。

表3 30％乙醇用量的考察

结果表明，采用HPD-100型树脂，用300ml的30％乙醇溶液可以将20g泽泻所得供试品溶液中的杂质基本洗脱干净，再用300ml的80％乙醇溶液可将泽泻供试品溶液中总三萜成分包括23-乙酰泽泻醇B基本洗脱完全。累积洗脱率达90％以上。

3.泽泻三萜类化合物提取纯化工艺的验证试验

称取泽泻粗粉80g，加入8倍量50％的甲醇，回流提取三次，每次为1.5h。过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状，加入100ml水分散，分别用100ml水饱和的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥。将浸膏用400ml50％乙醇溶解。得到浓度为0.2g生药/ml的上柱液，分别以1.0ml/min的流速上样于67ml体积的HPD-100树脂柱，后以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类，多糖和苷类，再用1200ml的30％乙醇洗脱，然后用1200ml80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，紫外法和HPLC-ELSD法分别测定总三萜和23-乙酰泽泻醇B含量，余下溶液回收乙醇，得总固物，平行操作3份，计算总固物中三萜类化合物和23-乙酰泽泻醇B的含量，结果见表5。

表5泽泻三萜类化合物提取纯化工艺的验证

批号	71022	71023	71024
批号	71022	71023	71024	泽泻质量(g)	80	80	80
上样浓度按生药计算(g/ml)	0.2	0.2	0.2	泽泻质量(g)	80	80	80
上样浓度按生药计算(g/ml)	0.2	0.2	0.2	HPD树脂体积(ml)	67	67	67
总固物(g)	0.8438	0.7678	0.5808	HPD树脂体积(ml)	67	67	67
总固物(g)	0.8438	0.7678	0.5808	总三萜含量(％)	58.2	59.8	54.2
23-乙酰泽泻醇B含量(％)	1.33	1.31	1.29	总三萜含量(％)	58.2	59.8	54.2

4.泽泻总三萜提取纯化工艺的概述

步骤1：泽泻粗浸膏的制备：

称取泽泻粗粉80g，加入8倍量50％的甲醇，回流提取三次，每次为1.5h。过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状，即得泽泻粗浸膏。

步骤2：泽泻浸膏精制：

泽泻粗浸膏加入l00ml水分散，分别用100ml水饱和的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥，得到泽泻精制浸膏。

步骤3：泽泻总三萜部位的制备：

将泽泻精制浸膏用400ml50％乙醇溶解。得到浓度为0.2g生药/ml的上柱液，分别以1.0ml/min的流速上样于67ml体积的HPD-100树脂柱，后以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类，多糖和苷类，再用1200ml的30％乙醇洗脱，然后用1200ml80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，紫外法和HPLC-ELSD法分别测定总三萜和23-乙酰泽泻醇B含量，余下溶液回收乙醇，得总固物，即为泽泻总三萜部位。

5.以下将采用大孔吸附树脂分离中药有效部位的传统方法和本实验所用方法作比较：

本实验通过对5种大孔吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，筛选出吸附泽泻中三萜化合物的最佳树脂，即HPD-100型大孔吸附树脂，其他文献未见相关报道。该树脂属于非极性树脂，由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又称芳香族吸附树脂，因具有比较大的孔，适用于大分子物质的吸附，且洗脱性良好，被吸附物可以容易地被洗脱下来，因此适用范围广泛，在医药食品领域评价很好。且经本实验证明该树脂对于泽泻有效部位的纯化作用优于其它树脂。在应用大孔吸附树脂分离纯化中药有效部位的传统实验中，上样前的供试品多用蒸馏水溶解，本实验采用50％乙醇溶解是因为泽泻中所含三萜类化合物极性较小，不能用蒸馏水溶解上样，若用浓度高的乙醇溶解，虽然三萜类化合物在浓度高的醇溶液中溶解度较好，但树脂的吸附量又会降低，所以选择50％乙醇溶解。洗脱溶液浓度选择80％乙醇是因为80％乙醇溶液基本能把总三萜和23-乙酰泽泻醇B洗脱完全，而综合考虑总三萜含量和23-乙酰泽泻醇B的含量两个指标使该方法更加合理，更加科学。HPD-100型大孔吸附树脂适合分离纯化泽泻中极性较小的三萜类成分。

附图说明

图1为吸附流速与吸附量关系图，从图1可得，流速为2ml/min时，第1BV过柱液就发生泄漏，上样11BV附近吸附速度明显减缓；而流速为0.5ml/min，1.0ml/min时，第2BVB过柱液开始检测到总三萜，两者均在上样12BV时吸附缓慢，为使上样液在树脂间充分扩散，吸附，流速不宜过快，故选择以1.0ml/min的流速上样。

图2为HPD-100型树脂对泽泻总三萜的动态吸附曲线，由图2可见，HPD-100型树脂吸附此浓度的供试品溶液，过柱泄漏点在第6BV，从第7BV开始泄漏已达30％以上。即10ml的HPD-100型树脂达到过柱泄漏点对于总三萜的吸附量为108.48mg。

图3为不同浓度乙醇中总三萜洗脱曲线，图中：1～4为10％乙醇洗脱液；5～8为30％乙醇洗脱液；9～12为50％乙醇洗脱液；13～16为70％乙醇洗脱液；17～20为80％乙醇洗脱液；21～24为95％乙醇洗脱液。

图4为不同浓度乙醇洗脱液中23-乙酰泽泻醇B洗脱曲线，图中：1为10％乙醇洗脱液；2为30％乙醇洗脱液；3为50％乙醇洗脱液；4为70％乙醇洗脱液；5为80％乙醇洗脱液；6为95％乙醇洗脱液。

结果表明：80％乙醇洗脱液对泽泻三萜类化合物的洗脱效果最好，而且80％乙醇可将泽泻中大约90％的三萜类化合物洗脱下来，因此确定HPD-100型树脂分离纯化泽泻总三萜的最佳洗脱溶剂为80％乙醇。操作步骤为：上样后，先以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类，多糖和苷类。再用浓度为30％的乙醇溶液洗脱水溶性杂质，然后用80％乙醇溶液以2ml/min流速洗脱，收集80％乙醇洗脱液。

具体实施方式

实施例1

泽泻总三萜提取纯化工艺：

(1)制备泽泻粗浸膏：

称取泽泻粗粉80g，加入8倍量50％的甲醇，回流提取三次，每次为1.5小时，过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状，即得泽泻粗浸膏；

(2)精制泽泻浸膏：

将制得的泽泻粗浸膏加入100ml水分散，用100ml水饱和的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥，得到泽泻精制浸膏；

(3)泽泻总三萜部位的制备：

将制得的泽泻精制浸膏用50％乙醇400ml溶解，得到浓度为0.2g生药/ml的上柱液，分别以1.0ml/min的流速上样于67ml体积的HPD-100树脂柱，后以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类，多糖和苷类，再用1200ml的30％乙醇洗脱，然后用80％乙醇1200ml洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇，得总固物，即为泽泻三萜类化合物。

实施例2

应用大孔吸附树脂对中药泽泻中三萜类化合物成分进行富集

方法：80g泽泻所得浸膏用400ml50％乙醇溶解后，上样于HPD-100型大孔吸附树脂，充分吸附后，再用蒸馏水洗脱至molish反应呈阴性，然后用1200ml30％乙醇，1200ml80％乙醇依次洗脱，收集80％乙醇洗脱液，蒸干溶剂，干燥，即为所得。结果：以23-乙酰泽泻醇B为对照品计算，富集产物中总三萜类含量可达50％以上，23-乙酰泽泻醇B含量可达1.29％以上。

Claims

1.一种泽泻三萜类化合物提取纯化工艺，其步骤是：

(1)称取泽泻粗粉加入50％的甲醇，回流提取过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状，即得泽泻粗浸膏；

(2)将制得的泽泻粗浸膏加入水分散，用水饱和的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥，得到泽泻精制浸膏；

(3)将制得的泽泻精制浸膏用50％乙醇溶解，制得到浓度为0.2g生药/ml的上柱液，分别以1.0ml/min的流速上样于67ml体积的HPD-100树脂柱，后以蒸馏水洗至molish反应呈阴性，除去糖类、多糖和苷类，再用30％乙醇洗脱，然后用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，回收乙醇，得总固物，即为泽泻三萜类化合物。