CN111766309B - 一种安神宝颗粒特征图谱的检测方法 - Google Patents

一种安神宝颗粒特征图谱的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法，属于中药制剂质量控制的技术领域。本发明采用特征图谱相似度评价直观控制安神宝颗粒药材来源、控制提取工艺、控制制剂的质量差异，用于指导安神宝颗粒生产全过程，具有整体性、特征性、稳定性的特性，为安神宝颗粒的生产质控提供了新的方法，确保安神宝颗粒产品质量和稳定性。

Description

一种安神宝颗粒特征图谱的检测方法
技术领域
本发明属于中药制剂质量控制领域，涉及一种安神宝颗粒特征图谱的检测方法。
背景技术
安神宝颗粒补肾益精，养心安神。用于失眠健忘，眩晕耳鸣，腰膝酸软。本品以酸枣仁为君药，枸杞子、藤合欢为臣药，组方简洁科学、配伍合理，效果明确。随着国家对中医药发展的重视，本着“传承精华，守正创新”，一定让中医药产业在保护人民健康方面发挥重要作用的理念，对现有中药成方制剂疗效、生产工艺、质量控制等方面进行深入挖掘已迫在眉睫。中药成方制剂里发挥作用的有效成分复杂，不同产地的中药材制成制剂发挥的疗效作用有所不同，所以国家对中药制剂使用的中药材来源进行严格管理，以保证产品质量稳定均一。
安神宝颗粒质量标准中未收载含量测定方法，这对安神宝颗粒制剂质量的控制是很片面的。本发明根据安神宝颗粒处方药味的组方、成分特性，工艺特性，建立一个科学、可行的特征图谱方法，整体评价原药材产地与成品的质量状况，对安神宝颗粒提高药材质量、精细生产工艺参数、提高质量标准提供新方法。特征图谱能够全面、系统的反映中药化学成分及其含量，可以进一步完善安神宝颗粒质量标准。通过《中国药典》2015年一部收载质量标准检测筛选出合格批次，采用高效液相色谱法，对不同产地酸枣仁、枸杞子、腾合欢药材制成的制剂建立特征图谱，最终选择11批安神宝颗粒制剂建立特征图谱分析方法，生成11批安神宝颗粒的共有模式，进行相似度评价。
发明内容
本发明是为了提供一种采用特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法。
本发明针对采用特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法，中药特征图谱是一种多指标的质量控制模式，它可以比较全面的反映所含化学成分的种类和数量，从而能够全面、综合地反映和控制中药的质量。安神宝颗粒组成成分中化学成分复杂，有黄酮类、三萜类类、生物碱类、阿魏酸、氨基酸等多种化学有效成分，安神宝颗粒的主要工艺是水提法，提取的目标成分包含黄酮类，选择黄酮类成分槲皮素作为特征峰进行相似度评价，同时探索安神宝颗粒含量测定参数，使安神宝颗粒的质量标准更具有整体性、特征性、和稳定性，并且对仪器、色谱柱、检测器、检测波长、色谱流动相、柱温进行了反复研究、优化，通过建立特征图谱，能够综合反映安神宝颗粒的内在质量，提升制剂的质量控制水平，保证多批次制剂的质量稳定均一。
本发明所述的采用特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法，建立安神宝颗粒含量测定方法。
本发明所述的特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法由以下步骤组成：
一、色谱条件与系统适应性试验：
色谱柱：Inertsil®ODS-2C18（4.6 mm×250 mm，5 m）
柱温：柱温25℃
检测：紫外检测器
进样量：10μL
流动相梯度洗脱表：流动相：A为乙腈，B为0.2%冰乙酸
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
二、对照品溶液的制备：取适量槲皮素，用甲醇溶解，制备成50 g/ml的槲皮素对照品溶液。
三、供试品溶液的制备：取安神宝颗粒粉末约0.5 g于锥形瓶中，加入甲醇25 ml溶解，超声45 min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液为供试品溶液。
四、测定法：将安神宝颗粒样品，在上述色谱条件下进样检测，采集了80 min的色谱图。将色谱图以AIA格式导入到“中药色谱特征图谱相似度评价系统（2012.130723版本）”软件进行分析。得到了11批安神宝颗粒的特征图谱。
本发明所述的特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法是经过大量筛选试验得到的最佳方案，以下试验研究为本发明的优选过程，色谱条件与系统适应性试验：
安神宝颗粒配方为酸枣仁、枸杞子、藤合欢，其中，酸枣仁中主要成分富含脂肪油，大部分为不饱和脂肪酸，其它成分有白桦脂酸、白桦脂醇、当药素、酸枣仁皂苷及阿魏酸、维生素C等，且含多种氨基酸及微量元素。其药用的物质基础较受关注的是皂苷类、黄酮类成分。枸杞主要成分为枸杞多糖、微量元素、甜菜碱、东莨菪内酯、多种氨基酸、维生素、挥发油。藤合欢主要成分为黄酮类成分，槲皮素、山奈酚等，为了减少试验操作，提高检测的效率，我们针对主要成分进行了研究，力图利用特征图谱同时表征上述主要成分，对安神宝颗粒质量控制和评价提供科学、有效的依据。
通过对比分析研究，安神宝颗粒三种药材中全部含有黄酮类成分，本发明以黄酮类成分槲皮素为目标，展开研究。槲皮素的检测波长大致在362nm，通常采用甲醇提取进行检测。
1、检测波长的选择
用上述方法条件进样，样品色谱图在180 nm-800 nm范围内进行全波长扫描，综合考虑特征色谱峰的最大吸收波长及安神宝颗粒中多种化学成分分离情况的整体效果，最终选定362nm作为安神宝颗粒特征图谱的检测波长。
2、流动相的选择
分别考察了样品在甲醇-水、甲醇-0.5%冰乙酸、乙腈-0.5%冰乙酸、乙腈-磷酸pH3.8四种不同流动相系统中的色谱图情况（见图二），发现有乙腈存在的系统分离效果优于甲醇，加入了酸的系统中组分更多，峰型更好，冰乙酸效果优于磷酸。所以选择了乙腈-冰乙酸系统。又分别考察了乙腈-0.1%冰乙酸、乙腈-0.2%冰乙酸、乙腈-0.5%冰乙酸、乙腈-1%冰乙酸等不同酸浓度，最后选择了乙腈-0.2%冰乙酸系统。
3、色谱柱的选择
考察了Thermo、Agilent、Inertsil®ODS三个品牌的C18色谱柱（见图三），发现安神宝颗粒在Inertsil ODS 柱分离效果最好，最终选择Inertsil®ODS-2色谱柱。
4、柱温的选择
考察了20℃、25℃、30℃柱温下，各峰分离效果、出峰时间等情况（见图四）。发现，随着温度的升高，色谱峰的保留时间稍有提前，温度较低时，各色谱峰之间的分离程度更好，因此选用25℃。
5、流速的选择
考察了流速为0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min时，各峰分离度情况（见图五）。发现，1.2 ml/min时色谱峰分离效果较差；0.8 ml/min、1.0 ml/min时分离度均较好，但0.8 ml/min出峰时间相对较长，因此选用1.0 ml/min流速。
6、流动相梯度的选择
安神宝颗粒组成成分中化学成分复杂，有黄酮类、三萜类类、生物碱类、阿魏酸、氨基酸等多种化学有效成分，所以采用梯度洗脱的方法以更好的分离各个成分。探索了以下五个梯度洗脱方法（见图六），最终确定梯度五为安神宝颗粒的液相条件。
表2 梯度一
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表3梯度二
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表4 梯度三
Figure 350735DEST_PATH_IMAGE006
表5 梯度四
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表6 梯度五
Figure 330192DEST_PATH_IMAGE008
7、特征图谱共有峰的标定
将11批安神宝颗粒样品，在上述色谱条件下进样检测，采集了80 min的色谱图。将色谱图以AIA格式导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）”软件进行分析，得到了11批安神宝颗粒的特征图谱（如图七）。
对11批样品测定结果对比分析，选择了分离效果较好、色谱信号值较高、每批样品均有的样品峰为特征峰，选择出了12个特征峰。共有峰面积占总峰面积的90%以上，达到了共有峰的要求。
8、特征峰相对保留时间确定
根据供试品的检测结果（见图九），12个特征峰中10号峰为槲皮素，其在特征图谱中峰面积最大、重复性较好，所以选择10号峰为参照峰（S）。将参照峰的保留时间定为1，计算各个特征峰与参照峰的相对保留时间，结果显示11批安神宝颗粒相对保留时间RSD值<3%，以相对保留时间的平均值为标准值，分别为：0.224（峰1），0.285（峰2），0.384（峰3），0.515（峰4），0.557（峰5），0.581（峰6），0.657（峰7），0.744（峰8），0.977（峰9），1（峰10），1.322（峰11），1.386（峰12）。
表7 12个特征峰的相对保留时间
Figure 795415DEST_PATH_IMAGE010
9、相似度评价
将11批安神宝颗粒特征图谱导入到相似度评价软件，以ASB-01为对照图谱，12个特征峰多点矫正，全谱峰匹配，时间窗为0.4，得到相似度数据。相似度数据均在0.945以上，说明11批不同来源的安神宝颗粒的化学成分具有良好的相似性。
表8 安神宝颗粒特征图谱相似度数据
Figure 315258DEST_PATH_IMAGE012
10、方法学考察
(1)精密度试验
取ASB-01样品1份，在上述色谱条件下连续进样6次，得到的色谱图在相似度评价软件中分析，以10号峰为对照峰，计算其它峰的相对保留时间和相对峰面积，以考察相对保留时间、相对峰面积的一致性。结果显示，相对保留时间RSD<0.22%，相对峰面积RSD<2.50%，说明该方法精密度良好。
表9 精密度试验结果（相对保留时间）
Figure 67314DEST_PATH_IMAGE013
表10 精密度试验结果（相对峰面积）
Figure 515875DEST_PATH_IMAGE014
(2)重复性试验
取ASB-01样品5份，在2.7.2色谱条件下进样，得到的色谱图在相似度评价软件中分析，以10号峰为对照峰，计算其它峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间RSD<0.25%，相对峰面积RSD<2.66%，说明该方法重复性良好。
表11 重复性试验结果（相对保留时间）
Figure 969859DEST_PATH_IMAGE015
表12 重复性试验结果（相对峰面积）
Figure 106442DEST_PATH_IMAGE016
(3)稳定性试验
取ASB-01样品1份，在2.7.2色谱条件下分别在0、2、4、6、8、12 h测定，得到的色谱图在相似度评价软件中分析，以10号峰为对照峰，计算其它峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间RSD<0.28%，相对峰面积RSD<2.55%，说明样品溶液在12 h内稳定。
表13 稳定性试验结果（相对保留时间）
Figure 404349DEST_PATH_IMAGE017
表14 稳定性试验结果（相对峰面积）
Figure 584664DEST_PATH_IMAGE018
11、药材特征图谱验证
按上述色谱条件进行操作，制备酸枣仁、枸杞子、藤合欢药材的特征图谱（见图十、图十一、图十二），结果与安神宝颗粒的配方理论吻合。
综上所述，特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法确定为：
一、色谱条件与系统适应性试验：
色谱柱：Inertsil®ODS-2C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）
柱温：柱温25℃
检测：紫外检测器
进样量：10μL
流动相梯度洗脱表：流动相：A为乙腈，B为0.2%冰乙酸
时间 流动相A% 流动相B%
0.01-15 10-20 90-80
15-40 20-25 80-75
40-65 25-60 75-40
65-70 60-80 40-20
70-72 80-10 20-90
72-80 10 90
二、对照品溶液的制备：取适量槲皮素，用甲醇溶解，制备成50μg/ml的槲皮素对照品溶液。
三、供试品溶液的制备：取安神宝颗粒粉末约0.5 g于锥形瓶中，加入甲醇25 ml溶解，超声45 min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液为供试品溶液。
四、测定法：将安神宝颗粒样品，在上述色谱条件下进样检测，采集了80 min的色谱图。将色谱图以AIA格式导入到“中药色谱特征图谱相似度评价系统（2012.130723版本）”软件进行分析。得到了11批安神宝颗粒的特征图谱。
附图说明
图1：安神宝颗粒特征图谱全波长扫描图
图2：不同流动相色谱图
图3：不同品牌C18柱色谱图
图4：不同柱温色谱图
图5：不同流速色谱图
图6：不同洗脱梯度色谱图
图7：11批安神宝颗粒HPLC特征图谱
图8：槲皮素对照品特征图谱
图9：安神宝颗粒特征图谱特征峰
图10：酸枣仁药材特征图谱特征峰
图11：枸杞子药材特征图谱特征峰
图12：藤合欢药材特征图谱特征峰
具体实施方式
下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。
实施例1：特征图谱控制安神宝颗粒质量的新方法：
一、色谱条件与系统适应性试验：
色谱柱：Inertsil®ODS-2C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）
柱温：柱温25℃
检测：紫外检测器
进样量：10μL
流动相梯度洗脱表：流动相：A为乙腈，B为0.2%冰乙酸
时间 流动相A% 流动相B%
0.01-15 10-20 90-80
15-40 20-25 80-75
40-65 25-60 75-40
65-70 60-80 40-20
70-72 80-10 20-90
72-80 10 90
三、对照品溶液的制备：取适量槲皮素，用甲醇溶解，制备成50μg/ml的槲皮素对照品溶液。
三、供试品溶液的制备：取安神宝颗粒粉末约0.5 g于锥形瓶中，加入甲醇25 ml溶解，超声45 min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液为供试品溶液。
四、测定法：将安神宝颗粒样品，在上述色谱条件下进样检测，采集了80 min的色谱图。将色谱图以AIA格式导入到“中药色谱特征图谱相似度评价系统（2012.130723版本）”软件进行分析。得到了11批安神宝颗粒的特征图谱。

Claims (1)

1.一种安神宝颗粒特征图谱的检测方法，其特征在于：利用中药特征图谱、运用
现代分析仪器进行分析、准确度高、重复性良好，有效检测安神宝颗粒质量，同
时对安神宝颗粒中所用药材的产地来源进行鉴定：所述特征图谱测定方法按下述步骤进行：
一、色谱条件与系统适应性试验：
色谱柱：ODS-2C18，4.6mm×250mm，5μm；
柱温：柱温25℃；
检测：紫外检测器；
进样量：10μL；
检测波长：362nm；
流动相梯度洗脱表：流动相：A为乙腈，B为0.2％冰乙酸；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
二、对照品溶液的制备：取适量槲皮素，用甲醇溶解，制备成50μg/ml的槲皮素对照品溶液；
三、供试品溶液的制备：取安神宝颗粒粉末约0.5g于锥形瓶中，加入甲醇25ml溶解，超声45min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液为供试品溶液；
四、测定法：将安神宝颗粒样品，在上述色谱条件下进样检测，采集了80min的色谱图；将色谱图以AIA格式导入到“中药色谱特征图谱相似度评价系统”软件进行分析。
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