CN107356684B - 决明子指纹图谱的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了决明子指纹图谱的检测方法，决明子指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1、决明子供试品溶液的制备；步骤2、对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的决明子指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次决明子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成决明子的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的决明子指纹图谱，能全面，客观地表征决明子的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

决明子指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及决明子指纹图谱的检测方法。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

决明子为豆科植物决明Cassia obtusi folia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，具清热明目、润肠通便的功效。现代研究表明，决明子具有抗氧化、降血脂、降血压、保肝及抗血小板聚集等药理作用。决明子中含蒽醌类、萘骈吡喃酮类、脂肪酸类、氨基酸和无机元素等多种成分。决明子临床用药有生品决明子和炒决明子的炮制品，2015年版中国药典规定将决明子按照清炒法，炒至微鼓起、有香气，决明子炒制后能缓和寒泻之性，具有平肝养目的功效。

生、炒决明子功效各异，主要在于炒制后其内的化学成分的含量及其组成发生了变化。为研究其化学成分变化，并有效的控制生、炒决明子饮片的质量，本发明采用高效液相色谱法建立生、炒决明子指纹图谱，为决明子的药材鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种决明子的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价生品和炮制后决明子的质量，对控制生品和炮制决明子的质量和保证临床疗效具有重要意义。并且该方法也可以用于研究生品决明子和炮制决明子化学成分变化，炮制提供科学依据。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种决明子指纹图谱的检测方法，其包括以下步骤：

步骤1、决明子供试品溶液的制备：

取不同批次的决明子，粉碎，精密称定，置于锥形瓶中，加乙醇，超声提取，过滤，取滤液，0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，备用；

步骤2、对照品溶液的制备：

精密称定橙黄决明素对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成橙黄决明素对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的决明子供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次决明子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成决明子的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的决明子指纹图谱的检测方法，步骤1决明子供试品溶液制备方法为：取15批次的决明子，粉碎过50目，分别精密称量决明子药材粉末0.5g，置于锥形瓶中，加体积浓度85％乙醇30mL，超声提取30min，过滤，取滤液滤过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的决明子指纹图谱的检测方法，步骤2对照品溶液的制备：取橙黄决明素对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，用85％乙醇定容至刻度，摇匀，制成20.72μg/mL的橙黄决明素对照品溶液，0.45μm滤膜滤过。

作为优选方案，以上所述的决明子指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱YMC-Pack ODS-AC18柱；流动相选用乙腈为A相-0.1％甲酸水溶液为B相，梯度洗脱，洗脱程序：0～10min，15％～25％A；10～15min，25％～26％A；15～35min，26％～26％A；35～45min，26％～45％A；45～50min，45％～45％A；50～70min，45％～55％A；70～90min，55％～85％A；90～95min，85％～100％A；流速：0.5ml/min；检测波长：284nm；柱温：30℃；进样量：10μl。

作为优选方案，以上所述的决明子指纹图谱的检测方法，决明子为生品决明子或炒制决明子。

作为优选方案，以上所述的决明子指纹图谱的检测方法，生品决明子的指纹图谱一共有29个共有峰；炒制决明子中一共有18个共有峰；其中橙黄决明素保留时间为45.3min，为12峰。

指纹图谱检测条件的优化：

1、在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法(超声、回流)及不同提取溶剂(甲醇、水、70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇、无水乙醇)、进行实验比较，结果发现超声提取与回流提取所得的谱图差异较小且超声提取效率高，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现85％乙醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用85％乙醇进行提取。

2、在色谱条件进行优化方面

本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取254nm、280nm、284nm处的色谱图，发现检测波长为284nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选284nm为检测波长；

对流速(1mL/min、0.8mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min、0.5mL/min)进行筛选，因决明子中的蒽醌类及萘并吡喃酮类成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，故高流速下无法将其分开，故在低流速下分离效果较好，最终在流速为0.5mL/min多次等梯度条件下将极性相似的物质分开。

本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸水，乙腈-0.1％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈-0.1％甲酸水为流动相时，决明子中各成分能达到很好的分离效果，故最终选定以乙腈-0.1％甲酸水为流动相。

有益效果：

1、本发明根据决明子中所含的活性成分，包括蒽醌类、萘骈吡喃酮类、脂肪酸类、氨基酸等化合物的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的决明子指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价生品和炮制品决明子的质量，为保证临床生品决明子和炮制决明子疗效具有重要意义。并且本发明为研究决明子炮制前后化学成分变化及其炮制机理具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的决明子指纹图谱，能有效地表征生品和炮制决明子片的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定决明子质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的决明子指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明的生品决明子的对照指纹图谱。

图2为本发明生品决明子的15批次供试品指纹图谱。

图3为本发明炮制决明子的对照指纹图谱。

图4为本发明炮制决明子的15批次供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂如下：

1、仪器与试药

1.1、仪器

日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和柱温箱CTO-20A；Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪(SPD-20A紫外-可见光检测器，岛津LC-Solusion工作站)；ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)；BP121S分析天平(梅特勒-托雷多公司)；GVS型超声波清洗器(深圳市够威科技有限公司)；DY-20流水式中药打粉机(温岭市奥力中药器械有限公司)。

1.2、试药

乙腈、甲醇及无水乙醇均为色谱纯，水为超纯水，磷酸、甲酸等均为分析纯，购自南京维之诚化学试剂有限公司；对照品橙黄决明素购自南京森贝伽生物科技有限公司，纯度>98％。

共收集了15个产地的生决明子样品，经鉴定,为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟种子。15个产地的生品决明子样品见表1：

表1决明子药材来源

样品编号	产地(生产批号)	样品编号	产地(生产批号)
				1	贵州(20160606)	9	甘肃(20160701)
2	广东(20160906)	10	浙江(20161101)
				3	四川(20161008)	11	河北(20160201)
4	陕西(20160606)	12	河南(20160608)
				5	云南(20160822)	13	湖南(20160709)
6	山东(20160906)	14	福建(20160810)
				7	江苏(20160709)	15	安徽(20160110)
8	湖北(20160901)

炮制决明子的制备方法为：

取生品决明子200g，180℃热锅下药，炒至药温升至180℃，持续此温度10min，炒至决明子为鼓起、有香气溢出。炒决明子表面暗棕色，偶见焦斑，符合2015版《中国药典》中炒决明子的性状特征。

实施例1一种生品决明子指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、决明子供试品溶液的制备：

取以上表1的15批生品决明子，粉碎过50目，分别精密称量决明子药材粉末0.5g，置于锥形瓶中，加体积浓度85％乙醇30mL，超声提取30min，过滤，取滤液滤过0.45μm微孔滤膜，即得15批生品决明子供试品溶液。

步骤2、对照品溶液的制备：

取橙黄决明素对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，用85％乙醇定容至刻度，摇匀，制成20.72μg/mL的橙黄决明素对照品溶液，0.45μm滤膜滤过，制成橙黄决明素对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取15批生品决明子供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱YMC-Pack ODS-AC18柱；流动相选用乙腈为A相-0.1％甲酸水溶液为B相，梯度洗脱，洗脱程序：0～10min，15％～25％A；10～15min，25％～26％A；15～35min，26％～26％A；35～45min，26％～45％A；45～50min，45％～45％A；50～70min，45％～55％A；70～90min，55％～85％A；90～95min，85％～100％A；流速：0.5ml/min；检测波长：284nm；柱温：30℃；进样量：10μl。

步骤4，将步骤3中获得的15批生品决明子供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择15批次生品决明子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成15批次生品决明子的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果15批生品决明子中有29个共有峰，对照指纹图谱见图1，15批次供试品的指纹图谱如图2所示。以橙黄决明素为参照峰，并计算生决明子中各共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表2和表3。

表2 15个产地决明子样品共有峰相对保留时间表

表3 15个产地决明子样品共有峰相对峰面积表

相似度评价

将15个产地的生品决明子的指纹图谱(AIA格式)用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A”软件进行匹配分析，将生决明子1号产地作为参照图谱，计算生决明子各个产地的相似度。其相似度分析结果见表4，由相似度分析结果可知，在以生决明子贵州产地(1号)作为参照图谱的情况下，15个产地的生决明子间的相似度较高。

表4相似度分析评价表

实施例2一种炮制决明子指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、决明子供试品溶液的制备：

分别取以上表1的15批生品决明子200g，在180℃热锅下药，炒至药温升至180℃，持续此温度10min，炒至决明子为鼓起、有香气溢出。炒决明子表面暗棕色，偶见焦斑，符合2015版《中国药典》中炒决明子的性状特征。分别粉碎过50目，分别精密称量炮制决明子药材粉末0.5g，置于锥形瓶中，加体积浓度85％乙醇30mL，超声提取30min，过滤，取滤液滤过0.45μm微孔滤膜，即得15批生品决明子供试品溶液。

步骤2、对照品溶液的制备：

取橙黄决明素对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，用85％乙醇定容至刻度，摇匀，制成20.72μg/mL的橙黄决明素对照品溶液，0.45μm滤膜滤过，制成橙黄决明素对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取15批炮制决明子供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱YMC-Pack ODS-AC₁₈柱；流动相选用乙腈为A相-0.1％甲酸水溶液为B相，梯度洗脱，洗脱程序：0～10min，15％～25％A；10～15min，25％～26％A；15～35min，26％～26％A；35～45min，26％～45％A；45～50min，45％～45％A；50～70min，45％～55％A；70～90min，55％～85％A；90～95min，85％～100％A；流速：0.5ml/min；检测波长：284nm；柱温：30℃；进样量：10μl。

步骤4，将步骤3中获得的15批炮制决明子供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择15批次炮制决明子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成15批次炮制决明子的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果15批生品决明子中有29个共有峰，对照指纹图谱见图3，15批次供试品的指纹图谱如图4所示。以橙黄决明素为参照峰，并计算生决明子中各共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表5和表6。

表5 15个产地炒决明子样品共有峰相对保留时间表

表6 15个产地炒决明子样品共有峰相对峰面积表

相似度评价

将15个产地的炮制决明子的指纹图谱(AIA格式)用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A”软件进行匹配分析，将炮制决明子1号产地作为参照图谱，计算生决明子各个产地的相似度。其相似度分析结果见表7，由相似度分析结果可知，在以炮制决明子贵州产地(1号)作为参照图谱的情况下，15个产地的生决明子间的相似度较高。

表7相似度分析评价表

根据本发明建立的生品决明子和炮制决明子的指纹图谱方法，依法分别将生，炒决明子各15批次样品进样分析，根据测定结果，以“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A”软件进行匹配分析，如图2和图4。通过对生决明子与炒决明子指纹图谱的分析对比，发现与生决明子相比，炒决明子在保留时间在0min～40min所对应的共有峰明显变小，保留时间在70min～87min所对应的5个共有峰明显变大，表明生决明子经过炒制后，化学成分含量有显著变化。对决明子的炮制机理具有重要的指导意义。

指纹图谱检测方法的法学研究：

1、精密度考察

取河北产地样品(11号)，按照实施例1下方法制备供试品溶液，按照实施例1下色谱条件连续进样6次，每次10μL。以橙黄决明素(12号峰)作为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差。其计算结果表明各色谱峰的相对保留时间的RSD值为0.01％～0.54％；相对峰面积的RSD值为0.18％～3.08％，说明仪器的精密度良好。

2、重复性考察

取河北产地样品(11号)6份，按实施例1下方法制备供试品溶液，按照实施例1下色谱条件进样。以橙黄决明素(12号峰)作为参照峰，计算其各共有峰各色谱的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差。结果其各色谱峰的相对保留时间的RSD值为0.01％～0.48％，相对峰面积的RSD值为0.17％～2.70％，均小于3％，符合相关要求。说明仪器重现性良好。

3、稳定性考察

取河北产地样品(11号)，按实施例1下色谱条件梯度洗脱，分别在0，4，12，14，16，27小时进样，记录色谱图，以橙黄决明素(12号峰)作为参照峰，计算其各共有峰各色谱的相对保留时间的与相对峰面积的RSD，其相对保留时间的RSD值为0.01％～0.58％，相对峰面积的RSD值为0.16％～2.99％，符合指纹图谱的要求(不大于3％)。表明样品至少在27小时内基本稳定。

以上实验结果表明，本发明提供的决明子指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价决明子的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种决明子指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、决明子供试品溶液的制备：

取15批次的决明子，粉碎过50目，分别精密称量决明子药材粉末0.5g，置于锥形瓶中，加体积浓度85%乙醇30mL，超声提取30min，过滤，取滤液滤过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液，备用；

步骤2、对照品溶液的制备：

取橙黄决明素对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，用85%乙醇定容至刻度，摇匀，制成20.72μg/mL的橙黄决明素对照品溶液，0.45μm滤膜滤过；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱YMC-Pack ODS-A C₁₈柱；流动相选用乙腈为A相-0.1%甲酸水溶液为B相，梯度洗脱，洗脱程序：0~10min，15%~25% A；10~15min，25%~26% A；15~35min，26%~26% A；35~45min，26%~45% A；45~50min，45%~45% A；50~70min，45%~55% A；70~90min，55%~85% A；90~95min，85%~100% A；流速：0.5ml/min；检测波长：284nm；柱温：30℃；进样量：10μl；

步骤4、 将步骤3中获得的决明子供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次决明子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成决明子的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

2.根据权利要求1所述的决明子指纹图谱的检测方法，其特征在于，决明子为生品决明子或炒制决明子。