CN104225167A - 六味地黄汤提取物在治疗痴呆或认知功能障碍中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及六味地黄汤提取物的用途，具体涉及六味地黄汤提取物在制备预防和/或治疗痴呆或认知功能障碍的药物中的用途。本发明的六味地黄汤提取物能够明显改善痴呆模型小鼠的物体识别记忆能力、空间学习记忆能力、被动回避反应能力和主动回避反应能力，可用于预防和/或治疗痴呆或认知功能障碍，具有很好的应用前景。

Description

六味地黄汤提取物在治疗痴呆或认知功能障碍中的用途

技术领域

本发明涉及六味地黄汤提取物的用途，具体涉及六味地黄汤提取物在制备预防和/或治疗痴呆或认知功能障碍的药物中的用途。

背景技术

痴呆是脑部疾病所致的综合征，它通常具有慢性进行性的性质，并在意识清楚的情况下，出现多种高级皮层功能紊乱，通常伴有认知功能的损伤，偶尔以情绪控制和社会行为或动机的衰退为前驱症状。它不同于先天精神发育迟滞，并且通常要求认知功能障碍持续存在至少6个月。轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)特指那些记忆或认知功能下降但未达到痴呆标准的人，MCI发展成痴呆的危险性高于正常人群，向阿尔茨海默病(Alzheimer`s Disease，AD)的年转化率是正常人群的10倍，MCI被认为是正常衰老向痴呆的过渡阶段。

目前国际上对痴呆的分类主要有3类：①老年性痴呆也称阿尔茨海默病(Alzheimer`s Disease，AD)，是发生在老年期及老年前期的一种慢性进行性退化性脑变性疾病，以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变为主要特征。分为家族遗传性老年性痴呆和散发性两种，而家族遗传性老年性痴呆又分为早发型和晚发型。②血管性痴呆(Vascular Dementia，VaD)，是由于脑血管疾病的原因，造成缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上产生的以高级神经认知功能障碍为主的一组临床综合征。主要包括多发梗死性痴呆、多发性腔隙性痴呆、脑淀粉样血管病变、脑低灌注性痴呆以及出血性痴呆等。③混合性痴呆，指既有老年性痴呆又有血管性痴呆或其他类型痴呆，其他类型痴呆主要包括额颞叶痴呆(Fronto-Temproal Dementia，FTD)、路易体痴呆(Dementia of LewyBody，DLB)、帕金森病性痴呆(Parkinson Disease Dementia)、亨廷顿病伴痴呆(Huntington Disease Dementia)、皮质基底节变性(Corticobasal Degeneration)等痴呆类型。其中阿尔茨海默病占痴呆症50％～60％，位于第一，而第二位便是血管性痴呆。

对于痴呆的治疗药物主要包括：①抗精神病药，其适应症为痴呆伴发的幻觉和妄想等精神病性症状，还有严重的激越和兴奋情况下也可用，在谵妄也可以应用。临床研究资料表明，所有传统抗精神病药物在用于痴呆的治疗中都有一定疗效，但疗效相当，并且在使用传统抗精神病药物治疗痴呆患者伴发的激越中，只有18％的患者能从中获益，而且传统药物很容易产生难以耐受的副反应。由于传统抗精神病药物的副反应，近年来开始使用非传统抗精神病药物：氯氮平、利培酮、奥氮平、奎的平。虽然非传统抗精神药物的疗效和安全性较传统抗精神药物有一定的提高，但也会出现锥体外系、嗜睡、过度镇静和粒细胞缺乏等副反应，同时氯氮平有明显的抗胆碱能的作用，因此也不适用于痴呆患者。②情感调节药物，其适应症为痴呆伴发的激越和攻击性，但会产生皮疹、镇静、运动不能、肝损伤等副作用，并且对于患者的认知功能改善效果较差。③抗抑郁药，其适应症为痴呆患者伴随激越或攻击性而发生的抑郁表现，它虽然可以有效的抗抑郁，改善患者的感情淡漠、抑郁、易激惹、意识混浊、焦虑、恐惧及坐立不安。但其副作用也较为明显，主要包括：镇静、体位性低血压以及谵妄。④乙酰胆碱酯酶抑制剂，越来越多的临床试验证明乙酰胆碱酯酶抑制剂不但能改善认知功能，而且对于轻度和中度AD患者伴发的行为与精神症状也有效，但其只能延缓病程而不能从根本上改善痴呆患者认知功能。⑤N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体拮抗剂，NMDA受体在涉及学习和记忆的各种形式的突触可塑性方面起重要作用，NMDA受体被明显激活而产生兴奋性毒性。但是完全阻断NMDA受体也损害正常突触传递。

目前对于MCI的治疗尚无统一方案，没有通过FDA批准的预防和/或治疗的药物，一般的治疗是应用神经保护药和促智药，如维生素E、维生素C和吡拉西坦，叶酸、维生素B12低于正常水平者进行补充，但疗效还在研究。

实际中，仍需要更为有效且副作用小的治疗痴呆或认知功能障碍的药物。

传统中药因其副作用小且标本兼治广受患者信赖，六味地黄方作为其中的代表名方经过千年传承，具有显著的滋阴补肾、增强免疫、抗衰老等功效，但尚无严格的临床研究证明其对痴呆或认知功能障碍有治疗作用。而对于六味地黄汤提取物，更无证明其对痴呆或认知功能障碍有改善或治疗作用。

发明内容

本发明的发明人经过大量创造性研究，发现传统中药名方六味地黄汤经过科学处理和提取后，能够明显改善痴呆模型小鼠的物体识别记忆能力、被动回避反应能力、主动回避反应能力及空间学习记忆能力。本发明即基于以上发现而完成。

本发明提供了六味地黄汤提取物在制备预防和/或治疗痴呆或认知功能障碍的药物中的用途。

根据本发明任一项所述的用途，其中六味地黄汤的原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓六味中药配伍组成，优选地，按照(8.8～7.3)：(4.4～3.6)：(4.4～3.6)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)的重量比例配伍组成，特别优选地，按照8：4：4：3：3：3的重量比例配伍组成。

根据本发明任一项所述的用途，其中六味地黄汤提取物包括11.4-17.0重量％的多糖，1.85-2.27重量％的糖苷(糖甙)以及23.5-35.5重量％的寡糖。

在本发明的实施方案中，所述六味地黄汤提取物包括14.2重量％的多糖。

在本发明的实施方案中，所述六味地黄汤提取物包括2.06重量％的糖苷(糖甙)。

在本发明的实施方案中，所述六味地黄汤提取物包括29.5重量％的寡糖。

在本发明的具体实施方案中，所述六味地黄汤提取物含有14.2重量％的多糖，2.06重量％的糖苷(糖甙)以及29.5重量％的寡糖。

根据本发明任一项所述的用途，其中所述的多糖含有鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸。

根据本发明任一项所述的用途，所述糖苷含有莫诺苷、马钱素和芍药苷。

在本发明的实施方案中，所述莫诺苷、马钱素和芍药苷的含量分别为0.92-1.12％、0.48-0.60％和0.44-0.53％。

根据本发明任一项所述的用途，其中所述的寡糖为甘露三糖。

根据本发明任一项所述的用途，其中六味地黄汤提取物的制备方法包括以下步骤：

ⅰ)将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓按(8.8～7.3)：(4.4～3.6)：(4.4～3.6)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)的重量比例组成的混合物，优选地，按8：4：4：3：3：3组成的混合物用水蒸煮一次或多次(例如两次或三次)，然后浓缩至浸膏；

ⅱ)伴随搅拌往浸膏中加入C1-4烷基醇至浓度10-40％(v/v)(例如25-35％v/v，例如30％v/v)，放置，离心，以及任选的冲洗的步骤，将离心所得上清液与任选的洗液合并为上清液；

ⅲ)浓缩上清液，伴随搅拌往浓缩液中加C1-4烷基醇至浓度50-95％(v/v)(例如55-80％v/v，例如60％v/v)，放置，分离得部位A和上清液；

ⅳ)将ⅲ)中上清液进行大孔吸附树脂柱层析，用水和极性有机溶剂依次洗脱，极性有机溶剂洗脱液浓缩后得部位B；

ⅴ)将ⅳ)中水洗脱液浓缩后上活性炭柱，用水和极性有机溶剂依次洗脱，极性有机溶剂洗脱液浓缩后得部位C；

ⅵ)将ⅲ)中部位A，ⅳ)中部位B和ⅴ)中部位C合并即得所述六味地黄汤提取物。

在本发明的实施方案中，其中六味地黄汤提取物的制备方法包括以下(1)-(3)项中的一项或多项：

(1)步骤ⅳ)中的大孔吸附树脂可以为所有型号的弱极性大孔吸附树脂，例如为HP-20；

(2)其中C_1-4烷基醇选自甲醇、乙醇中的一种或两种；

(3)其中所述极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和丙酮中的一种或多种，其浓度范围为10-95％，例如为20-60％，例如为30％。

根据本发明任一项所述的用途，其中所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明任一项所述的用途，所述痴呆或认知功能障碍疾病选自⑴中枢神经系统变性疾病：阿尔茨海默病、轻度认知障碍、额-颞叶痴呆、Prion病、路易体痴呆、帕金森病、亨廷顿病；⑵非变性病痴呆：①血管性痴呆；②占位性病变引起的痴呆：肿瘤、慢性硬膜下血肿、慢性脑脓肿引起的痴呆；③感染引起的痴呆：脑膜脑炎、神经梅毒、艾滋病、阮蛋白病引起的痴呆；④脑外伤性痴呆；⑤正常颅压性脑积水引起的痴呆；⑥内分泌代谢障碍引起的痴呆：内分泌障碍、库欣综合征、高胰岛素血症、甲状腺功能低下、垂体功能减退、低血糖、肝功能衰竭、肾衰竭、肺功能衰竭、慢性电解质紊乱、血卟啉病、维生素(B1、烟酸、叶酸、维生素B12等)缺乏引起的痴呆；⑦中毒、缺氧(酒精、重金属、一氧化碳、药物、缺氧等)引起的痴呆；⑧副肿瘤综合征引起的痴呆。

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望再次对这些术语和短语更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明所述“六味地黄汤”为中药汤剂，是由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓六味中药按照一定的重量比例配伍组成而制作的水煎剂。

本发明所述“六味地黄汤提取物”，是以熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓为原料，按照一定配比，经过物理化学提取分离过程，定向获取和浓集其中的某一种或多种有效成分而形成的混合物产品。在本发明的实施方案中，所述六味地黄汤提取物的制备方法和各组分含量测定方法参照中国发明专利CN1626228A。在本发明的具体实施方案中，所述六味地黄汤提取物参照中国发明专利CN1626228A中实施例1的方法制备，也称为六味地黄苷糖。

在本发明的实施方案中，所述“六味地黄苷糖”是指包括14.2重量％的多糖，2.06重量％的糖苷(莫诺苷、马钱素和芍药苷)和29.5重量％的甘露三糖的六味地黄汤提取物，其中六味地黄汤的原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓六味中药以8：4：4：3：3：3的重量比例配伍组成。

本文所用术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患痴呆或认知功能障碍的哺乳动物采用本发明的联合用药物或药盒产品进行处理，以期对所述痴呆或认知功能障碍产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。

类似地，本文所用术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患痴呆或认知功能障碍或者对本发明所述痴呆或认知功能障碍具有罹患风险的哺乳动物采用本发明的联合用药物或药盒产品进行处理，以期对所述痴呆或认知功能障碍产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

本文所用术语“药学可接受的”通常是指制药领域可使用，对产品或者对哺乳动物无害，或具有合理的或可接受的利益/风险比。

本文所用术语“载体”或“赋形剂”可以是制药领域中任何常规的载体和赋形剂。具体的载体和赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的载体或赋形剂包括药学领域常规的载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、溶剂、支持剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以包括香味剂、防腐剂和甜味剂等。

根据本发明，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明所述的六味地黄汤提取物能明显改善痴呆模型小鼠的物体识别记忆能力、空间学习记忆能力、被动回避反应能力和主动回避反应能力，可用于痴呆或认知功能障碍的预防和/或治疗。

尤其地，在家族遗传性痴呆模型小鼠试验中，本发明的六味地黄汤提取物在各实验中的治疗作用普遍优于阳性对照药物。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的痴呆模型小鼠分为两类，一类属于散发或自发型痴呆模型，为快速老化模型小鼠P系(Senescence Accelerated Mouse-Prone)中SAMP8亚系，10月龄，对照小鼠为抗快速老化模型小鼠R系(Senescence Accelerated Mouse-Resistant)中SAMR1亚系，10月龄，本实验自繁殖；一类属于家族或遗传型痴呆模型，为APPswe/PS1_dE9双转基因小鼠，12月龄。野生型为C57BL/6J小鼠，12月龄，购自北京华阜康生物科技有限公司(SCXK北京2009-0004)。

本发明分别选取盐酸美金刚和盐酸多奈哌齐作为阳性药对照组，采用灌胃给药。

盐酸多奈哌齐(北京偶合科技有限公司，120014-06-4)，分子式：C24H29NO3·HCl，分子量：416；

盐酸美金刚。(北京偶合科技有限公司，41100-52-1)，分子式：C12H21N，分子量：216。

本发明以六味地黄苷糖作为供试药物，采用灌胃给药，

该药物参照中国发明专利CN1626228A中实施例1的方法制备得到。

本发明的六味地黄苷糖进行了3批动物实验，连续给药4个月。

下述实施例中所用的药物剂量如下：

盐酸多奈哌齐10毫克/kg体重，盐酸美金刚30毫克/kg体重，六味地黄苷糖160毫克/kg体重。

实施例1.本发明的六味地黄苷糖对于快速老化模型小鼠的物体识别 记忆能力的影响

1.材料

1.1动物：快速老化模型小鼠SAMP8(清洁级)和抗快速老化模型小鼠SAMR1(清洁级)，体重29～33g。

1.2试剂药品：盐酸多奈哌齐；盐酸美金刚；六味地黄苷糖。

1.3实验仪器：订制测试箱尺寸为30×30×30cm(宽×长×高)，箱体为黑色不透明有机玻璃，箱底为透明有机玻璃。通过Anymaze软件对小鼠探究物体视频的采集。

2.方法

2.1给药方法

根据小鼠的体重，采取随机分组的方法将小鼠分为五组：正常对照组(SAMR1型正常小鼠)，模型对照组(SAMP8型散发自发型痴呆模型小鼠)，阳性药对照组(盐酸多奈哌齐组和盐酸美金刚组)，六味地黄苷糖组，每组10只。用药剂量参照成人临床剂量，盐酸多奈哌齐10毫克/kg体重，盐酸美金刚30毫克/kg体重，六味地黄苷糖160毫克/kg体重，均以去离子水为溶剂配成溶液对小鼠进行灌胃，每日1次，每次按小鼠体重0.01ml/g，正常溶剂对照组和模型溶剂对照组则以等体积去离子水灌胃，其中正常溶剂对照组是指正常小鼠给予去离子水为溶剂作为对照，模型溶剂对照组是指模型小鼠给予去离子水为溶剂作为对照。

2.2新异物体识别实验

实验开始前对Anymaze软件进行设置，并检测其工作状态是否正常。

适应期：将每只小鼠放入不含测试物体的测试箱内20min，小鼠自由活动,以适应新环境。两小鼠之间需对箱体内的环境进行必要的清理，除去异味，供识别物体使用5％酒精擦拭，箱体使用自来水清洁。

学习期：将两个相同的物体分别标记为a和b，放入箱体两端一侧，分别将每一组小鼠放入测试箱体另一侧中央。分别累计16min内小鼠探查两个物体各自总时间(Exploratory Time)：Ta1和Tb。判断标准为：小鼠面向物体，鼻子触碰或者贴近物体距离小于1cm。任何非正面身体与物体接触，或者越过、爬上物体眺望均不计入小鼠探查物体时间。

测试期：分为短时记忆与长期记忆两阶段考察。短时记忆于训练期后1hr，长时记忆则于训练期24hr或者更长时间(根据具体情况选择时间的长短，短期记忆或者长期记忆也可根据情况进行选择)。将两个相同物体之一b替换为新物体(Novel object)c，其他条件不变。依次将小鼠放入测试箱内，分别累计4min内小鼠探查新旧物体各自总时间(Exploratory Time)：Ta2和Tc。以优先指数Preferential index(P.I)＝(T c/(Ta2+Tc))作为小鼠认知功能的指标。该指标越高代表小鼠的记忆能力越高。正常小鼠优先指数在70％以上。

2.3统计方法

统计学处理：数据以均数±标准差表示，采用GraphPad 5.03软件进行统计分析。

3.结果

实验结果详见表1。

表1各给药组对痴呆模型小鼠(SAMP8和SAMR1)新异物体识别实验中优先指数的影响(n＝10)

注：与正常溶剂对照组比，^*P<0.05、^***P<0.001；与模型溶剂对照组比^#P<0.05、^###P<0.001

结果表明，六味地黄苷糖能够在学习期1hr和24hr后显著提高SAMP8小鼠的优先指数，说明六味地黄苷糖能够在学习期1hr和24hr后显著提高SAMP8小鼠的新异物体识别记忆能力。

实施例2.本发明的六味地黄苷糖对于快速老化模型小鼠的被动回避 反应能力的影响

1.材料

1.1动物：同实施例1。

1.2试剂药品：同实施例1。

1.3实验仪器：跳台装置(DTT-2，中国医学科学院)，箱体为上盖开放两侧不透光的塑料长方体尺寸为22×28×36cm(宽×长×高)，底面为不锈钢网栅，网栅间距为1.5cm(可通36v电压)。站台为一长方体塑料泡沫：8×8×2.5cm(宽×长×高)。将站台放于箱体中央，距箱体两侧分别为7、10cm。

2.方法

2.1给药方法：同实施例1。

2.2跳台实验

实验前对实验设备进行检测，观察其工作状态是否正常。

环境适应期：首先将小鼠轻轻放入箱体一角，让其适应环境2min；此时环境中不含安全站台。适应结束后，将站台置于箱体中央。

训练期：将小鼠轻轻放到站台，记录其下站台(以四个爪子全部着地为准)时间即为潜伏期(T0)，下台同时打开电源给予持续电刺激(～36V)，电击10s。再次将小鼠放回到平台上，观察小鼠在站台上时间，若3min内小鼠不跳下站台，则视为该小鼠已经学会；若小鼠跳下站台，则再次给予10s、36V的电击，如此反复操作，同时记录下台次数(N)，直至小鼠站台时间超过3min结束，记录中训练时间(不含站台测试3min)(T)。初次15s内不下站台，该小鼠舍弃不用但仍参加之后实验记录错误次数；训练期(不含站台测试3min)超过10min，该小鼠舍弃不用但仍参加之后实验记录错误次数。

测试期：训练90min后，将小鼠重新放到站台中央，观察其是否能够保持3min。若3min内下台，记录其下站台的时间(T1)。

2.3统计方法：同实施例1。

3.结果

实验结果详见表2。

表2各给药组对痴呆模型小鼠(SAMP8和SAMR1)跳台实验中下台次数和逃避潜伏期的影响(n＝10)

注：与正常溶剂对照组比，^**P<0.01、^***P<0.001；与模型溶剂对照组比^#P<0.05、^##P<0.01

结果表明，六味地黄苷糖能够明显降低SAMP8小鼠的下台次数和提高其测试期的站台时间，说明六味地黄苷糖可以显著提高SAMP8小鼠的被动回避反应能力。

实施例3.本发明的六味地黄苷糖对于快速老化模型小鼠的空间学习 记忆能力的影响

1.材料

1.1动物：同实施例1。

1.2试剂药品：同实施例1。

1.3实验仪器：Morris水迷宫(DNS-2，中国医学科学院)包括以下三个部分：实验装置由迷宫宫体(水池)、视频采集系统、相关的图形处理软件和电脑组成：宫体直径100cm，迷宫壁高出水面30cm，安全平台(圆形，直径10cm，表面粗糙以利于动物抓住)匿藏于1-2cm的水面下，水温为23℃±3℃。

2.方法

2.1给药方法：同实施例1。

2.2Morris水迷宫实验

实验前将水池接满自来水，高度以超过安全平台1～2cm为限。剪取大小为15×20cm的长方形纸片悬挂于水迷宫墙壁上，注意：实验全程中室内物体位置须保持固定。关闭室内日光灯，打开电脑以及图像采集软件，将安全平台置于水池的第二象限中心位置，并使实物位置与程序中虚拟位置统一。在程序中设置动物组别，设置动物游泳时间(60s)和站台停留时间(10s)。

站台适应：定向航行实验前，将动物放置于站台上60s，作站台适应训练；然后引导动物从距站台2-3cm处登上站台，作登台适应训练。

定向航行实验：即学习训练实验，共进行5天，每只动物每天训练4次。每次将动物从不同入水点分别放入水池中，头朝池壁。记录动物自入水到爬上站台所需的时间，作为潜伏期；并记录动物在水中的游泳轨迹，作为分析动物搜索目标时所采用的策略的依据。动物爬上站台后，让其在站台上站立10s；若动物在60s内未找到站台或未能爬上站台，则将动物引领至站台上站立10s，之后将动物从站台上取下。统计每只动物每天4个入水点的平均逃避潜伏期(未爬上站台者潜伏期以60s计算)、游泳距离、游泳速度、在外环区域的游泳时间，并绘制波动曲线以观察趋势。

空间探索实验：即记忆测试实验。将站台从其所在位置移走，将动物从一个入水点放入水池中，记录动物初次探索游过原站台位置的时间、60s内探索游过原站台所在位置区域的次数(记为穿环次数)和动物在站台所在目标象限的游泳时间。

2.3统计方法：同实施例1。

3.结果

实验结果详见表3。

表3各给药组对痴呆模型小鼠(SAMP8和SAMR1)Morris水迷宫实验中逃避潜伏期和穿环次数的影响(n＝10)

注：与正常溶剂对照组比，^***P<0.001；与模型溶剂对照组比^#P<0.05、^##P<0.01、^###P<0.001

结果表明，六味地黄苷糖能够显著提高SAMP8小鼠的逃避潜伏期及穿环次数，说明六味地黄苷糖能够显著提高SAMP8小鼠的空间学习记忆能力。

实施例4.本发明的六味地黄苷糖对于快速老化模型小鼠的主动回避 反应能力的影响

1.材料

1.1动物：同实施例1。

1.2试剂药品：同实施例1。

1.3实验仪器：穿梭箱(Med Corporation)，每个箱体为50cm×15cm×40cm的方形结构，侧壁为金属，底部为可通电的栅栏，箱体内部由被螺线管控制的门(10cm×10cm)分离为两个25cm的小室。每个室用安在有机玻璃盖上的20W灯泡照明，使用带有自定开关(0.5s开、1.5s关)固定电阻的刺激器进行电刺激，实验环境为避光、60dB(无噪音)。

2.方法

2.1给药方法：同实施例1。

2.2穿梭箱实验

学习期：开启软件，将噪音刺激和光刺激时间设为10s，而后电刺激时间为5s、强度为0.2mA，实验中间间隔(Intertrial Interval，ITI)为30s；将动物放入穿梭箱内，开启程序。若动物在开始的10s内，从所在一端穿到另一端，则灯光和噪音消失，电击也消失，此种反应记为回避；若动物在10s内没有穿到另一端就要接受电击，5s后电击停止，小鼠在5s内穿到对侧，记为逃避；若动物整个过程中均没有穿到对侧，记为逃避失败；每只小鼠每天接受训练30次(约30min)，最少训练5天，天数视训练结果而定。以正常对照组(C57)小鼠在达到80％的回避次数作为终止训练的标准。

测试期：重设软件，将噪音刺激和光刺激时间设为10s，而后电刺激取消，ITI为35s；将动物放入穿梭箱内，开启程序。若动物在开始的10s内，从所在一端穿到另一端，则灯光和噪音消失，此种反应记为回避；若动物在15s内穿到另一端，记为逃避；若动物整个过程中均没有穿到对侧，记为逃避失败。

2.3统计方法：同实施例1。

3.结果

实验结果详见表4。

表4各给药组对痴呆模型小鼠(SAMP8和SAMR1)穿梭箱实验中主动回避次数的影响(n＝10)

注：与正常溶剂对照组比，^***P<0.001；与模型溶剂对照组比，^##P<0.01

结果表明，六味地黄苷糖能够显著提高SAMP8小鼠的主动回避次数，说明六味地黄苷糖能够显著提高SAMP8小鼠的主动回避反应能力。

实施例5.本发明的六味地黄苷糖对于双转基因小鼠的物体识别记忆 能力的影响

1.材料

1.1动物：APP_swe/PS1_dE双转基因模型小鼠APP_swe/PS1_dE9(SPF级)和C57BL/6J小鼠(SPF级)，体重28～32g。

1.2试剂药品：同实施例1。

1.3实验仪器：同实施例1。

2.方法

2.1给药方法

同实施例1。

2.2新异物体识别实验

同实施例1。

2.3统计方法

同实施例1。

3.结果

实验结果见表5。

表5各给药组对痴呆模型小鼠(APP_swe/PS1_dE和C57BL/6J)新异物体识别实验中优先指数的影响(n＝9～15)

注：与正常溶剂对照组比，^*P<0.05、^***P<0.001；与模型溶剂对照组比，^###P<0.001

结果表明，六味地黄苷糖能够提高APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠学习期后1hr的优先指数，说明六味地黄苷糖能够在学习期1hr后显著提高APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠的新异物体识别记忆能力。

实施例6.本发明的六味地黄苷糖对于双转基因小鼠的被动回避反应 能力的影响

1.材料

1.1动物：同实施例5。

1.2试剂药品：同实施例1。

1.3实验仪器：同实施例2。

2.方法

2.1给药方法

同实施例1。

2.2跳台实验

同实施例2。

2.3统计方法

同实施例1。

3.结果

实验结果详见表6。

表6各给药组对痴呆模型小鼠(APP_swe/PS1_dE和C57BL/6J)跳台实验中下台次数和逃避潜伏期的影响(n＝9～15)

注：与正常溶剂对照组比，^***P<0.001；与模型溶剂对照组比，^##P<0.01、^###P<0.001

结果表明，六味地黄苷糖能够显著降低APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠的下台次数和提高其下台时间，说明六味地黄苷糖能够显著提高APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠的被动回避反应能力。

实施例7.本发明的六味地黄苷糖对于双转基因小鼠的空间学习记忆 能力的影响

1.材料

1.1动物：同实施例5。

1.2试剂药品：同实施例1。

1.3实验仪器：同实施例3。

2.方法

2.1给药方法

同实施例1。

2.2Morris水迷宫实验

同实施例3。

2.3统计方法

同实施例1。

3.结果

实验结果详见表7。

表7各给药组对痴呆模型小鼠(APP_swe/PS1_dE和C57BL/6J)Morris水迷宫实验中逃避潜伏期和穿环次数的影响(n＝9～15)

注：与正常溶剂对照组比，^***P<0.001；与模型溶剂对照组比，^#P<0.05、^##P<0.01、^###P<0.001

结果表明，六味地黄苷糖能够显著提高APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠的逃避潜伏期和穿环次数，说明六味地黄苷糖能够显著提高APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠的空间学习记忆能力。

实施例8.本发明的六味地黄苷糖对于双转基因小鼠的主动回避反应 能力的影响

1.材料

1.1动物：同实施例5。

1.2试剂药品：同实施例1。

1.3实验仪器：同实施例4。

2.方法

2.1给药方法

同实施例1。

2.2穿梭箱实验

同实施例4。

2.3统计方法

同实施例1。

3.结果

实验结果详见表8。

表8各给药组对痴呆模型小鼠(APP_swe/PS1_dE和C57BL/6J)穿梭箱实验中主动回避次数的影响(n＝9～15)

注：与正常溶剂对照组比，^***P<0.001；与模型溶剂对照组比，^###P<0.001

结果表明，六味地黄苷糖能够显著提高APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠的主动回避次数，说明六味地黄苷糖能够显著提高APP_swe/PS1_dE9双转基因小鼠的的主动回避反应能力。

实验结论

本发明中的六味地黄苷糖能够显著提高痴呆模型小鼠小鼠的物体识别记忆能力、被动回避反应能力、主动回避反应能力及空间学习记忆能力。提示本发明中的六味地黄苷糖能够提高痴呆模型小鼠的认知功能，改善其学习记忆能力，可用于痴呆或认知功能障碍的治疗。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (9)

1.六味地黄汤提取物在制备预防和/或治疗痴呆或认知功能障碍的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述六味地黄汤的原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓六味中药配伍组成，优选地，按照(8.8～7.3)：(4.4～3.6)：(4.4～3.6)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)的重量比例配伍组成，特别优选地，按照8：4：4：3：3：3的重量比例配伍组成。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述六味地黄汤提取物包括11.4-17.0重量％的多糖，1.85-2.27重量％的糖苷以及23.5-35.5重量％的寡糖。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述的多糖含有鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述的糖苷含有莫诺苷、马钱素和芍药苷。

6.根据权利要求3所述的用途，其中所述的寡糖为甘露三糖。

7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述六味地黄汤提取物的制备方法包括以下步骤：

ⅰ)将由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓按(8.8～7.3)：(4.4～3.6)：(4.4～3.6)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)：(3.3～2.7)的重量比例组成的混合物，优选地，按8：4：4：3：3：3组成的混合物用水蒸煮一次或多次(例如两次或三次)，然后浓缩至浸膏；

ⅱ)伴随搅拌往浸膏中加入C_1-4烷基醇至浓度10-40％(v/v)(例如25-35％v/v，例如30％v/v)，放置，离心，以及任选的冲洗的步骤，将离心所得上清液与任选的洗液合并为上清液；

ⅲ)浓缩上清液，伴随搅拌往浓缩液中加入C_1-4烷基醇至浓度50-95％(v/v)(例如55-80％v/v，例如60％v/v)，放置，分离得部位A和上清液；

ⅳ)将ⅲ)中上清液进行大孔吸附树脂柱层析，用水和极性有机溶剂依次洗脱，极性有机溶剂洗脱液浓缩后得部位B；

ⅴ)将ⅳ)中水洗脱液浓缩后上活性炭柱，用水和极性有机溶剂依次洗脱，极性有机溶剂洗脱液浓缩后得部位C；

ⅵ)将ⅲ)中部位A，ⅳ)中部位B和ⅴ)中部位C合并即得到所述六味地黄汤提取物。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述药物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。

9.根据权利要求1-8任一项所述的用途，所述痴呆和/或认知功能障碍选自⑴中枢神经系统变性疾病：阿尔茨海默病、轻度认知障碍、额-颞叶痴呆、Prion病、路易体痴呆、帕金森病、亨廷顿病；⑵非变性病痴呆：①血管性痴呆；②占位性病变引起的痴呆：肿瘤、慢性硬膜下血肿、慢性脑脓肿引起的痴呆；③感染引起的痴呆：脑膜脑炎、神经梅毒、艾滋病、阮蛋白病引起的痴呆；④脑外伤性痴呆；⑤正常颅压性脑积水引起的痴呆；⑥内分泌代谢障碍引起的痴呆：内分泌障碍、库欣综合征、高胰岛素血症、甲状腺功能低下、垂体功能减退、低血糖、肝功能衰竭、肾衰竭、肺功能衰竭、慢性电解质紊乱、血卟啉病、维生素(B1、烟酸、叶酸、维生素B12等)缺乏引起的痴呆；⑦中毒、缺氧(酒精、重金属、一氧化碳、药物、缺氧等)引起的痴呆；⑧副肿瘤综合征引起的痴呆。