CN1453258A - 腺梗豨莶中抗血栓作用的活性组分与它的制备方法及应用 - Google Patents

腺梗豨莶中抗血栓作用的活性组分与它的制备方法及应用 Download PDF

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CN1453258A CN 03117097 CN03117097A CN1453258A CN 1453258 A CN1453258 A CN 1453258A CN 03117097 CN03117097 CN 03117097 CN 03117097 A CN03117097 A CN 03117097A CN 1453258 A CN1453258 A CN 1453258A
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侴桂新
金若敏
王峥涛
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Abstract

本发明属中药技术领域。本发明公开了采用抗血栓活性指标对豨莶草进行活性筛选，得到豨莶草抗血栓有效组分，并分离得到10余个化合物，通过化学成分分析确定了主要成分的化学结构，建立了该组分的分析方法及指纹图谱，为创制抗血栓中药奠定基础，有较好的发展前景。

Description

腺梗豨莶中抗血栓作用的活性组分与它的制备方法及应用
技术领域：
本发明属中药技术领域。具体涉及一种腺梗豨莶抗血栓活性组分及制备方法。
背景技术：
豨莶草为常用中药，始载于唐代《新修本草》。《中国药典》(2000年版)收载菊科植物豨莶Siegesbeckia orientalis L.、腺梗豨莶Siegesbeckia pubescens Makino和毛梗豨莶Siegesbeckia glabrescensMakino三种的地上部分作为中药豨莶草入药，其单味制剂豨莶丸，具有祛风湿、利关节、解毒之功效，用于风湿痹痛、腰膝酸软、四肢麻痹、半身不遂、高血压、风疹湿疮等症。
近年来，国内外学者对豨莶草进行了较深入的化学、药理学研究。
豨莶草中主要含有二萜类、倍半萜类、黄酮类等成分，三种原植物中所含成分类似。其中的主要活性成分为二萜及其甙类成分。
豨莶中二萜类成分豨莶甙(darutoside)及其甙元豨莶苦味三醇(darutigenol)最早由法国人Diara分离得到，后又报道从中得到异豨莶苦味三醇B和C(isodalutogenol B、C)、豨莶苦味四醇(pimar-8(14)-ene-6β，15，16，18-tetraol)、豨莶苦味醇酸(16、17-dihydroxy-16β-kauran-19-oic acid)等二萜类成分，最近报道从该种中又得到二个新的二萜类化合物豨莶酯酸(Siegesesteric acid)和豨莶醚酸(Siegesetheric acid)。
腺梗豨莶中的二萜类成分除豨莶甙、豨莶苦味四醇外，主要为海松烷型和贝壳杉烷型二萜类成分：腺梗豨莶萜二醇酸、腺梗豨莶萜醇酸、腺梗豨莶萜四醇、腺梗豨莶萜三醇甙、腺梗豨莶萜二酸，近年来报道的新二萜成分有豨莶醚酸(siegesmethyletheric acid)、12-羟基奇壬醇(12-hydroxy-kirenol)、2-酮基-16-乙酰基奇壬醇(2-keto-16-acetyloxykirenol)，最近从该种中得到的一木脂素类化合物二香草基四氢呋喃(epoxylignan)，具有显著的抗血小板聚集作用。
毛梗豨莶中二萜类成分也有豨莶甙及其甙元豨莶苦味三醇、豨莶苦味醇酸，另含有豨莶新甙(neodarutoside)、siegesbeckioside、豨莶精醇(darutigenol)，豨莶糖甙(darutoside)等[9]二萜类成分。最近，许云龙等又其中分到四个化合物：对映-16β、17-二羟基、贝壳杉烷-19-羧酸(ent-16β、17-dihydroxy-19-oic acid)、奇壬醇(kirenol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)和胡萝卜甙(daucos terol)。
                       表1、豨莶草中主要二萜类成分
    化合物名称                           存在的原植物        结构类型         文献
16，17-dihydroxy-16β                                          Siegesbeckia       贝壳杉烷型       29，30，31
(-)-kauran-19-oic acid                   pubescens
腺梗豨莶萜二酸                           S.pubescens        贝壳杉烷型       31
腺梗豨莶萜醇酸                           S.pubescens        贝壳杉烷型       3，30
腺梗豨莶萜醇酸异丁酸酯                   S,pubescens        贝壳杉烷型       3，30
腺梗豨莶萜四醇                           S.pubescens        贝壳杉烷型       29
豨莶酯酸                                 S.orientalis       贝壳杉烷型       4
豨莶醚酸                                 S.orientalis       贝壳杉烷型       4
豨莶苦味醇酸                             S.orientalis       贝壳杉烷型       3
腺梗豨莶萜二醇酸                         S.pubescens        贝壳杉烷型       3
对映-16 β、17、18-三羟基-贝             S.pubescens        贝壳杉烷型       43
壳杉-19-羧酸
奇壬醇                                   S.pubescens        海松烷型         3
15-乙酰基-奇壬醇                         S.orientalis       海松烷型         6
12-羟基奇壬醇                            S.pubescens        海松烷型         6
2-酮基-16-乙酰基奇壬醇                   S.pubescens        海松烷型         7
豨莶精醇                                 S.orientalis       海松烷型         27
豨莶糖醇                                 S.orientalis       海松烷型         3
豨莶苦味三醇                             S.orientalis       海松烷型         3
豨莶新甙                                 S.glabrescens      海松烷型         26
异豨莶苦味三醇B                          S.orientalis       海松烷型         3
异豨莶苦味三醇C                          S.orientalis       海松烷型         3
豨莶苦味四醇                             S.orientalis       海松烷型         3
腺梗豨莶糖甙                             S.pubescens        海松烷型         32
.αβ，15，                              S.orientalis       海松烷型         23
16-trihydroxy-ent-pimar-g(14)en
e
15，16-Dihydroxy-2-                      S.orientalis       海松烷型         23
oxo-ent-pimar-8(14)-ene.
15，16，18-trihydroxy-2-oxo-ent          S.orientalis       海松烷型         23
pimar-8(14)-ene
19-Acetoxy-12-oxo-10，11                 S.orientalis       链状二萜         23
-dihydrogeranylnerol
12-oxo-13，14E-dehydro-                  S.orientalis       链状二萜         23
10，11.14.15-tetrohydro-geranyln
erol
geranylnerol                             S.orientalis        链状二萜        23
                                 表2、豨莶草中其他类成分
      化合物名称                         存在的原植物         结构类型      文献
9β-hydroxy-8β-                         S.orientais          吉马烷型       23
isobytyrloxycostunolide
9β-hydroxy-8β-                         S.orientais          吉马烷型       23
methacryloxycostunolide
14-hydroxy-8β-               S.orientais      吉马烷型     23
isobutyryloxycostunolide
8β-isobytyryloxy-14-         S.orientais      吉马烷型     23
alcostunolide
9β-dihydroxy-8β-            S.orientais      吉马烷型     23
isobutyxyloxycostunolide
8-isobutyryloxy-1β，10α            S.orientais      吉马烷型     23
-epoxycostunolide
9β-hydoxy-8β                                  S.orientais      吉马烷型     23
-isobutyryloxy-1β.10α
epoxycostunolide
8β，9β-dihydroxy-1β，10α- S.orientais      吉马烷型     23
epoxy-11
β，13-dihydrocostunolide
14-hydroxy-8β-isobutyryloxy  S.orientais      吉马烷型     23
豨萜醛内酯                    S.orientais      无柄锈交酯型 31
15-hydroxy-9α-acetoxy-8β          S.orientais      柄锈交酯型   23
isobutyryloxy-14-oxo-
melampolide
9α-15-dihydroty-8-           S.orientais      无柄锈交酯型 23
isobutyryloxy-14-oxo-
melampolide
.15-hydroxy-8β                                S.orientais      柄锈交酯型   23
isobutyryloxy-14-oxo-
melamolide
β-谷甾醇                     S.orientais      甾醇类       4
豆甾醇                        S.orientais      甾醇类       4
胡萝卜甙                      S.orientais      甾醇类       4
3，7-二甲基槲皮甙             S.orientais      黄酮类       29
二香草基四氢呋喃              S.glabrescens    香豆素类     8
药理学研究表明，豨莶草在心血管系统、抗炎、抗病原微生物、免疫系统以及抗早孕方面均有良好的活性，并证实其中的主要活性成分为二萜类成分。1、抗菌作用
通过平板打洞法试验证明：金黄色葡萄球菌对豨莶草高度敏感，大肠杆菌、绿脓杆菌、宋氏痢疾杆菌、伤寒杆菌轻度敏感，对白色葡萄球菌、卡他球菌、肠炎杆菌、猎霍乱杆菌有抑菌作用，但对副大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、炭疽杆菌、甲型链球菌无抑菌作用。2、抗炎作用
豨莶草对大鼠注射甲醛或鸡蛋清所产生的关节肿有明显的抗炎作用，其疗效与水杨酸钠300ml/kg腹腔注射相似。实验证明：腺梗豨莶萜二醇酸有较好的抗炎作用，腺梗豨莶萜醇酸也有抗炎作用。3、对心血管方面的作用
对心血管系统方面研究表明，豨莶草的水和乙醇浸出液有降低麻醉动物血压的作用，口服二萜类成分腺梗豨莶萜二醇酸(50mg/kg.d)连续10天，对肾型高血压大鼠有降压作用。以Okamoto-SHR高血压动物为模型，口服腺梗豨莶萜二醇酸(50mg/kg.d)并与心得安(75mg/kg.d)对照，示该成分有显著抗高血压作用[13]。腺梗豨莶提取液能使保留神经的兔耳血管舒张，并能阻断刺激神经引起的收缩血管反应，其血管舒张作用是通过阻断交感收缩血管神经的影响而产生的。另外豨莶草90％的甲醇提取物对ACE(血管紧张肽转变因子酶)抑制率可达30％-40％。豨莶草还能改善微循环，减轻血栓湿重。用0.6g(生药)/ml的豨莶草注射液对小鼠肠系膜微循环障碍后的血流恢复作用与0.3g(生药)/ml的复方丹参注射液的作用相当，家兔静脉注射豨莶草提取物，可使血栓湿重明显减轻，表明豨莶草对血栓形成有抑制作用，其抑制率为51.41％。4、免疫抑制作用
实验表明，豨莶草煎剂对小鼠的免疫功能有显著的影响，结合淋巴细胞绝对值减少和Ea、Et花环形成率下降，结合血清抗体滴度降低细胞内DNA和RNA吖橙荧光减弱，小白鼠腹腔巨噬细胞功能下降，血清溶菌酶活性降低。说明豨莶草对小白鼠细胞免疫、体液免疫和非特免疫均有抑制作用。5、抗疟作用
豨莶草煎剂按100g/kg给大鼠灌胃，对鼠疟原虫抑制率达90％。6、抗生育作用
等观察到大鼠腹腔注射毛梗豨莶醇提取物至1.7g生药/kg剂量时，有明显抗早孕作用。从中分离到的豨莶甙在20-40mg/kg剂量时，对大鼠有明显，抗早孕作用。
最近报道腺梗豨莶甲醇提取液对爱滋病病毒蛋白酶(HIV-lprotease)也有较强的抑制作用。
发明内容：
本明所要解决的技术问题在于通过追踪性筛选，筛选出豨莶草抗血栓活性组分，并对其进行分离鉴定和分析，建立活性组分的质量标准。
本发明提供了腺梗豨莶草的抗血栓活性组分，该活性组分包括：
奇壬醇(kirenol 1)、豨莶精醇(darutigenol 2)、对映-17、18-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸(ent-17，18-dihydroxy kauran-19-oic acid 3)、对映-16、17-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸(ent-16，17，-dihydroxy kauran-19-oic acid4)、对映-17-羟基贝壳杉烷-19-羧酸(ent-16αH，17-hydroxykauran-19-oic acid 5)、3’、5’、β-三羟基，3、4、4’、α、-四甲氧基查儿酮(3’、5’、β-trihydroxy，3、4、4’、α、-tetramethoxy-chalcone 6)、以及豆甾醇(Stigmasterol7)。其中3’、5’、β-三羟基，3、4、4’、α、-四甲氧基查儿酮是新化合物，对映-17-羟基贝壳杉烷-19-羧酸为首次从豨莶属植物中分离得到。
Figure A0311709700091
化合物6的结构式
 序号   1Hδ(ppm)   13Cδ(ppm) long-range C/H correlation(1Hto 13C)HMBC
 β  155.8s
 α  139.0s
 CO  178.7s
 1  122.9s
 2  7.70(1H，d，J＝2.1)  111.2d  C-3、C-6、C-β
 3  148.7s
 4  151.3s
 5  7.00(1H，d，J＝8.6)  110.8d  C-1、C-3、C-4
 6  7.73(1H，dd，J＝8.6，2.1)  122.1d  C-2、C-4、C-β
 1’  106.1s
 2’  6.37(1H，d，J＝2.2)  97.8d  C-1、C-3、C-6
 3’  162.1s
 4’  165.4s
 5’  156.7s
 6’  6.48(1H，d，J＝2.2)  92.2d  C-1’、C-2’、C-4’、C-5’
 α-OCH3  60.2q  C-α
 4’-OCH3  55.8q  C-4’
 3-OCH3  56.1q  C-3
 4-OCH3  56.0  C-4
化合物6的NMR波谱数据。化合物6的主要HMBC相关示意图见图1。抗血栓有效组分化学成分分析(一)豨莶草抗血栓有效组分化学成分的指纹图谱分析
为确保豨莶草抗血栓有效组分质量的稳定及可控，我们采用HPLC的方法对5批豨莶草抗血栓有效组分进行了指纹图谱分析，得到了分离、检测的最佳条件。1、仪器和材料
Agilentl100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器(DAD)，四元泵，Agilent-ChemStation化学工作站。Pall纯水器(美国Pall公司)，乙腈(色谱纯，美国默克公司)。
样品制备：称取5份腺梗豨莶，各20g，按有效组分的提取方法，平行操作，得到5个有效组分样品。各取0.1g样品，加入适量甲醇∶水1∶4的溶液，过C18预柱，再用甲醇洗脱，收集甲醇液，再用0.45μm的有机相滤膜过滤，作为样品溶液。
对照品溶液制备：取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有机相滤膜过滤，定容到10ml的容量瓶中，作为对照品溶液。2、色谱条件
色谱柱：Polaris C8-A5u，150×4.6mm
检测器：DAD，215nm
流动相：乙腈-水(梯度，乙腈：0min，20％；15min，35％；40min，
80％)
柱温：40℃
流速：1ml/min3、方法学考察
(1)稳定性试验：取同一样品溶液，分别在不同时间(0hr、2hr、4hr、12hr、24hr)检测，其各峰的相对保留时间基本一致(见表3)，结果表明，样品溶液稳定性好。
(2)
                  表3、抗血栓有效组分指纹图谱稳定性试验(相对保留时间)
                                 (以奇壬醇为对照品)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12  13  14
0hr 1 1.144 1.339 1.410 1.720  2.000 2.263 2.444 2.678 2.873 3.050 3.110  3.527  3.622
2hr 1 1.146 1.342 1.412 1.725  2.001 2.265 2.447 2.681 2.876 3.055 3.112  3.529  3.624
4hr 1 1.150 1.346 1.417 1.729  2.003 2.269 2.449 2.686 2.880 3.059 3.117  3.534  3.630
12hr 1 1.148 1.344 1.415 1.729  2.005 2.268 2.450 2.689 2.881 3.056 3.117  3.528  3.626
24hr 1 1.151 1.347 1.419 1.730  2.008 2.272 2.451  2.690 2.883  3.060 3.119  3.530  3.631
(3)精密度试验：取同一样品，连续进样5次，其相对保留时间见
表4，RSD小于2％，符合规定。
                   表4、抗血栓有效组分指纹图谱精密度试验(相对保留时间)
                                       (以奇壬醇为对照品)
1 2 3 4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14
 1 1 1.144 1.339 1.410 1.720  2.000  2.263  2.444  2.678  2.873  3.050  3.110  3.527  3.622
 2 1 1.143 1.338 1.410 1.722  2.001  2.265  2.446  2.670  2.875  3.052  3.112  3.527  3.623
 3 1 1.144 1.338 1.411 1.723  2.002  2.264  2.445  2.679  2.874  3.051  3.111  3.526  3.622
 4 1 1.146 1.341 1.412 1.721  2.001  2.264  2.445  2.679  2.873  3.051  3.110  3.528  3.623
 5 1 1.145 1.340 1.411 1.721  2.000  2.263  2.446  2.678  2.874  3.052  3.111  3.527  3.622
(4)样品测定：取已制备好的5个样品，分别进同样的量，其相对保留时间见表5，共有峰相对峰面积见表6，相对峰面积的RSD小于2，符合规定。
                         表5、抗血栓有效组分指纹图谱相对保留时间数据
                                         (以奇壬醇为对照品)
1 2 3 4 5  6  7  8  9  10  11  12  13  14
1 1 1.144 1.339 1.410 1.720  2.000  2.263  2.444  2.678  2.873  3.050  3.110  3.527  3.622
2 1 1.146 1.341 1.412 1.723  2.002  2.265  2.445  2.680  2.875  3.051  3.111  3.528  3.624
3 1 1.148 1.344 1.413 1.725  2.001  2.267  2.447  2.681  2.872  3.053  3.112  3.530  3.623
4 1 1.140 1.338 1.409 1.719  2.000  2.263  2.443  2.678  2.872  3.050  3.110  3.526  3.622
5 1 1.149 1.346 1.415 1.726  2.004  2.269  2.447  2.682  2.878  3.055  3.113  3.529  3.626
                   表6、抗血栓有效组分指纹图相对峰面积数据(以奇壬醇为对照品)
1 2  3  4 5 6 7 8 9 10  11  12  13 14
1 1  0.0856  0.0266 0.1854 0.1243 0.0904  0.0444 0.1548 0.0562 0.0721  0.0587  0.0365  0.0520 0.0152
2 1  0.0869  0.0269 0.1887 0.1249 0.0916  0.0455 0.1570 0.0574 0.0739  0.0590  0.0369  0.0558 0.0154
3 1  0.0874  0.0277 0.1873 0.1256 0.0918  0.0462 0.1581 0.0581 0.0741  0.0608  0.0375  0.0610 0.0158
4 1  0.0880  0.0278 0.1877 0.1265 0.0930  0.0458 0.1579 0.0586 0.0751 0.0610  0.0381  0.0630 0.0156
5 1  0.0891  0.0275 0.1895 0.1260  0.0925 0.0465 0.1594 0.0592 0.0754 0.0611  0.0379  0.0700 0.0159
4、结果：
分析结果表明，以乙腈-水梯度洗脱，在215nm下检测，能够获得较多信息的指纹图谱，且指纹图谱分离度好、重现性高，可作为该有效组分的质量标准的一个重要指标。
试验结果表明，豨莶草抗血栓有效组分指纹图谱有14个共有峰，经与对照品对照，保留时间在9.826分钟的色谱峰为奇壬醇，该有效组分的中主要有效成分为二萜类成分奇壬醇。(见图2、图3)(二)抗血栓有效组分化学成分的LC-MS分析
为阐明豨莶草抗血栓有效组分中化学成分的类型，采用LC-APCIMS的方法，对有效组分进行了分析，进一步确证了该组分中化学成分是以奇壬醇为主的二萜类成分。1、仪器与试剂Thermo Finigan Surveyor LCQ DECA XP plus液-质联用仪(美国Finigan公司)Pall纯水器(美国Pall公司)，乙腈(色谱纯，美国默克公司)。2、样品与对照品
称取腺梗豨莶20g，按有效组分的提取方法提取制备。取0.1g样品，加入适量甲醇∶水1∶4的溶液，过C18预柱，再用甲醇洗脱，收集甲醇液，再用0.45μm的有机相滤膜过滤，作为样品溶液。
对照品溶液制备：取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有机相滤膜过滤，定容到10ml的容量瓶中，作为对照品溶液。3、分析条件液相条件
色谱柱：C8，150×4.6mm，5um
流动相：乙腈∶水
乙腈：0min，20％；15min，35％；40min，80％
柱温：40℃
检测器：PDA，215nm
流速：1ml/min质谱条件正离子模式：
源电压：4.50kV
毛细管电压：15V
管透镜补偿电压：30V
APCI气化温度：450℃
毛细管温度：250℃
雾化气：N2(80units)
辅助气：N2(10units)负离子模式：
源电压：6.00kV
毛细管电压：-15V
管透镜补偿电压：-30V
APCI气化温度：450℃
毛细管温度：250℃
雾化气：N2(80units)
辅助气：N2(10units)4、结果1)对照品奇壬醇的LC-APCIMS测试采用上述分析条件测定了奇壬醇的正碳离子和负碳离子，分析结果见图4、图5、图6、图7。
奇壬醇APCIMS(正碳离子)给出准分子离子峰为356(M+NH4 +)，其他主要碎片分别为321(M-OH)，303(M-H2O-OH)，285(M-2H2O-OH)。奇壬醇的APCIMS(负碳离子)只给出准分子离子峰为397(M+CH3CN+H2O)。2)有效组分的LC-APCIMS测定
采用上述分析条件测定了抗血栓有效组分中化学成分的正碳离子和负碳离子，分析结果表7及见图8、图9、图10。
表7、抗血栓有效组分LC-APCI-MS(正离子)数据分析结果
保留时间(min) 质谱峰(m/z)   鉴定结果
7-40  356(M+NH4)，321(M-OH)，303(M-H2O-OH)，285(M-2H2O-OH) 奇壬醇
8.65  391，374，354，337，319，212，195，181，99 贝壳杉烷型二萜
10.90  422，393，375，363，345，321，303，285，99 海松烷型二萜
13.84  398，363，345，327，303，285，267，99 海松烷型二萜
16.36  403，385，99 贝壳杉烷型二萜
21.28  445，385 贝壳杉烷型二萜
表8、抗血栓有效组分LC-APCI-MS(负离子)数据分析结果
保留时间(min) 质谱峰(m/z)   鉴定结果
7.40  397(M+CH3CN+H2O) 奇壬醇
8.65  395，335，329 贝壳杉烷型二萜
10.90  403，343 海松烷型二萜
13.84  439，421，407 海松烷型二萜
16.36  397，315，311 贝壳杉烷型二萜
21.28  489，443，399 贝壳杉烷型二萜
根据海松烷型和贝壳杉烷型二萜类成分的裂解规律，分析结果表明，抗血栓有效组分中主要为这2类二萜，其中以奇壬醇为主。(三)抗血栓有效组分化学成分的定性、定量分析1、抗血栓有效组分TLC定性分析：1)仪器与试剂：CAMAG薄层成像仪(瑞士，CAMAG公司)，氯仿(分析纯，上海化学试剂厂)，甲醇(分析纯，上海化学试剂厂)，硅胶板(50×100mm，德国默克公司)2)样品与对照品：
样品溶液制备：称取腺梗豨莶20g，按有效组分的提取方法提取制备。取0.1g样品，加入适量甲醇溶解，作为样品溶液。
对照品溶液制备：取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有机相滤膜过滤，定容到10ml的容量瓶中，作为对照品溶液。3)薄层条件：展开剂，CHCl3∶CH3OH(6∶1)，显色剂：10％硫酸溶液，展距，8cm4)结果：在上述薄层条件下展开，喷10％硫酸溶液，于105℃下加热30分钟，在CAMAG薄层成像仪用白光观察，结果如图11，其中1、——为抗血栓有效组分，S、——为对照品奇壬醇，其中主要有5个紫色斑点，与对照品相应的位置的斑点为奇壬醇，并可察见奇壬醇为主要成分。2、抗血栓有效组分中奇壬醇的含量测定1)仪器和材料Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器(DAD)，四元泵，Agilent-ChemStation化学工作站。Pall纯水器(美国Pall公司)，乙腈(色谱纯，美国默克公司)。2)样品与对照品
样品制备：称取5份腺梗豨莶，各100g，按有效组分的提取方法，平行操作，得到5个有效组分样品。各取0.2g样品，甲醇定容于50ml容量瓶中，作为样品溶液。
对照品溶液制备：精密称取奇壬醇1.68mg，置于10ml容量瓶中，用甲醇豨释至该刻度，摇匀，即得(每1ml中含奇壬醇168μg).
色谱条件
色谱柱：Lichrospher100，RP-18e(5um)，25cm
流动相：乙腈-水(25∶75)
检测器：DAD，215nm
柱温：40℃
流速：1ml/min
3)标准曲线制备
取对照品溶液分别进0.5μl，2.0μl，5.0μl，8.0μl，12.0μl，15.0μl，20.0μl，以奇任醇的量为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，进行回归计算得回归方程：Y＝789.9941X-3.3156，相关系数r＝0.99998，线性范围：奇壬醇在0.084μg-3.36μg之间呈现良好的线性，结果见表9和图12。
表9、线性关系考察进样量(μg)                     峰面积(mau*s)0.080                           69.530.360                           268.680.840                           661.931.344                           1058.892.016                           1591.292.520                           1983.993.360                           2653.064)精密度试验
取浓度为0.168ug/ml的标准品溶液，连续进样5次，每次5ul，测定奇任醇的吸收峰面积，结果见表10，RSD＝0.12％，＜2.0％，说明精密度较好。
                  表10、精密度试验结果
进样次数(n)     峰面积(μV)    平均(X)     RSD(％)
   1             665.19
   2             665.22
   3             667.30        665.86      0.12
   4             665.61
   5             665.965)稳定性试验
取样品溶液，以奇壬醇的吸收峰面积进行考察，进样6次，每隔5小时进样20ul，结果表明样品至少在24小时内稳定，其结果见表10，RSD＝0.75％，说明样品的稳定性好。
                      表11稳定性试验结果样品放置时间(h)    峰面积(μV)     平均(X)     RSD(％)
  0              693.87
  5              687.81
  10             689.89         689.32      0.75
  15             693.13
  20             679.56
  25             691.686).加样回收率的测定
取豨莶草样品溶液，精密吸取1ml，分别置于9个5.0ml的容量瓶中，然后分别加0.168ug的奇壬醇对照品溶液0.2ml，0.2ml，0.2ml，0.25ml，0.25ml，0.25ml，0.3ml，0.3ml，0.3ml，并豨释至该刻度，然后分别进样20ul，结果见表12。按公式：
回收率＝测得奇壬醇量-样品奇壬醇量/添加奇壬醇量对照品量
得回收率平均值为101.89％。RSD＝1.34％
          表12加样回收率的测定结果(单位：ug)序  样品中奇壬    添加奇壬醇的     测得奇壬醇    回收率(％)  平均回收率    RSD(％)号  醇含量        量               总量                       (％)1   0.04341       0.0336           0.0775          101.52   0.04341       0.0336           0.0773          100.73   0.04162       0.0336           0.0762          102.94   0.04162       0.042            0.0851          103.5      101.89       1.345   0.04162       0.042            0.0837          100.2
0.04162       0.042            0.0853          104.167   0.04162       0.0504           0.093           102.8   0.04162       0.0504           0.0923          100.59   0.04162       0.0504           0.0929          101.67)样品测定：
取样品溶液，过0.45μm微孔滤膜，采用上述色谱条件，进样2ul，对5个样品中奇壬醇的含量进行测定，结果表明，有效组分中奇壬醇的含量为10.6％，样品色谱图及测定结果见图13、图14和表13。表13、抗血栓有效组分中奇壬醇含量测定结果序号    奇壬醇含量(％)    平均含量(％)    RSD(％)1       10.712       10.613    10.64       10.626        0.854    10.695    10.483、抗血栓有效组分中总二萜的含量测定仪器：蛋白核酸分析仪DU-640(BECKAEN公司)试剂：甲醇，香草醛，冰醋酸，高氯酸，乙酸乙酯，均为分析纯。线性关系的考察：对照品溶液的制备：精密称取奇壬醇对照品2.01mg，甲醇定容于10ml容量瓶中，即每毫升含奇壬醇0.201mg。精密称取豨莶草抗血栓有效组分205.3mg.，用甲醇定容于50ml容量瓶中，作为供试液，
精确吸取上述奇壬醇对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml分别置试管中挥去溶剂，精密加入5％香草醛冰醋酸0.2ml，高氯酸0.8ml，混均，置70℃恒温水浴上加热15分钟，冷却至室温，精密加入乙酸乙酯4ml，摇匀，在600m波长处，以第一管作空白对照测量吸收度绘制标准曲线(见图15，纵座标为吸光度，横座标为奇壬醇溶液)。样品测定：取供试品溶液0.1ml三份，按上法测定，结果见表14：
序号   吸光度 总二萜含量(％)     RSD(％)
  1   0.6131   26.88 0.95
  2   0.6058   26.56
抗血栓有效组分的药理、毒理研究：1、急性毒性实验实验材料
1.动物：昆明种小鼠，合格证号：医动02-24-3号，由上海中医药大学实验动物中心提供。
2.受试药物：部位I、豨莶草抗血栓有效组分、部位III实验方法与结果
1.部位III小鼠半数致死量LD50的测定
首先取少数健康小鼠禁食过夜后，进行预实验，测出受试药物引起0至100％死亡率的剂量范围。然后取健康小鼠40只，雌雄各半，体重20～22g，随机分为4个剂量组(各剂量组组距为0.85)，禁食不禁水过夜，然后按等比剂量灌胃给药。给药后，严密观察并记录，用Bliss法进行统计，计算LD50。死亡动物立即进行尸检，记录病变情况。见表15
表15、腺梗豨莶部位III小鼠急性毒性实验结果
           动物数      剂量
 组别                           死亡率(P)
             (n)   (g提取物/kg)
 1           10         20         0.8
 2           10         17         0.6
 3           10         14.45      0.4
 4           10         12.28      0.0实验显示：中毒死亡小鼠的表现症状为活动减少，共济失调，呼吸困难。死亡后动物尸解，发现胃底部充血，肿胀；其余重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)肉眼观察，未发现异常情况。经计算LD50＝16.17g提取物/kg，相当于571.4g生药/kg；LD50的95％可信度＝log-1(X50±1.96SX50)＝10.69～24.47g提取物/kgLD50的平均可信限＝16.17±6.89g提取物/kg2.部位I与豨莶草抗血栓有效组分最大给药量的测定
经预试，部位I与豨莶草抗血栓有效组分测不出LD50，故改为测定小鼠最大给药量。分别取健康小鼠20只，雌雄各半，体重20～22g，禁食不禁水过夜，以小鼠能接受的最大浓度(0.5g提取物/ml)，0.4ml/10g体重灌胃给药1次。连续观察7日。7日后，小鼠称重，处死，解剖，肉眼观察重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，并计算动物最大给药量。结果显示，
1.小鼠给部位I后，各方面均正常。
2.小鼠给豨莶草抗血栓有效组分后1-2hr内，少量动物有竖毛现象，活动稍减，2hr后恢复正常。
3.两组小鼠在以后的观察期间内，食量、活动、大小便均正常，饲养7日后小鼠的体重均有增加，平均为26±2g，未见死亡。脱颈椎处死动物，肉眼观察重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，均无异常发现。
4.经计算，部位I的最大给药量为20g提取物/kg，相当于1626g生药/kg，豨莶草抗血栓有效组分的最大给药量为20g提取物/kg，相当于1747g生药/kg。结论：
通过腺梗豨莶三个部位对小鼠的急性毒性实验，表明部位III有一定的毒性，其半数致死量为16.17g提取物/kg(相当于571.4g生药/kg)，部位I、豨莶草抗血栓有效组分无毒性，经测定部位I最大给药量为20g提取物/kg，相当于1626g生药/kg，豨莶草抗血栓有效组分最大给药量为20g提取物/kg，相当于1747g生药/kg。有效组分的药理学实验研究：(一)、抗血栓活性筛选1、三种豨莶草总提物抗血栓作用的比较研究目的：通过三种豨莶草抗血栓作用的比较，筛选出作用最好的种。实验材料
1.动物：昆明种小鼠，合格证号：医动02-24-3号，SD品系大鼠，合格证号：医动02-24-4号。均由上海中医药大学实验动物中心提供。
2.试剂及仪器：
丹参注射液：上海中西药业股份有限公司，批号：010104
复方丹参片：上海雷允上药业有限公司，批号：020802
豨莶草总提物：将三种豨莶草分别用乙醇回流提取，回收乙醇，
分别得到三种豨莶草的总提取物。
盐酸肾上腺素注射液(Adr)，上海禾丰制药有限公司，批号：
0006017
MR-4型多环血栓检测仪，上海斯隆医电设备有限公司产品实验方法与结果
1.对正常小鼠凝血时间的影响
取健康小鼠80只，雌雄各半，体重20±2g，随机分为8组，ig给药或等容积蒸馏水，每日1次，连续4日。未次给药后1hr，摘眼球取血，以毛细玻管法测定凝血时间(CT)。结果显示，三种豨莶草均可显著延长小鼠凝血时间，其中腺梗豨莶作用更好些，与豨莶组比有显著性差异。见表16.
表16 三种豨莶草总提物对正常小鼠凝血时间的影响
组别       剂量(g生药/kg)   动物数(n)      CT( X±SD，S)
    正常组丹参注射液组 2.3     1010     125.7±29.6194.8±53.1**
  毛梗豨莶组豨莶组腺梗豨莶组     3.01.03.01.03.01.0     101010101010     205.6±36.6**196.4±32.4**215.9±25.0**179.3±38.1**210.3±16.1**219.8±21.6**Δ
与正常组比**P＜0.01豨莶小剂量与腺梗豨莶小剂量比较ΔP＜0.052.对冰水-肾上腺素型大鼠血栓形成的影响[1]
取健康SD大鼠90只，雌雄各半，体重200±20g，随机分为9组。ig给药或等容积蒸馏水。每日1次，连续8日。于第7日除正常组外，其余各组大鼠皮下注射Adr，每次0.5mg/kg体重，共2次，间隔4hr。正常组皮下注射等容积生理盐水。处置后禁食不禁水过夜。第8日末次给药后1hr，除正常组外，其余各组大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min后浸入冰水中5min。正常组动物仅皮下注射等容积生理盐水。然后，所有动物用25％乌拉坦0.5ml/100g体重麻醉后，腹主静脉取血1ml，按照Chandler体外法立刻将血注入旋转环内，迅速密封。置血栓形成仪上，旋转15min，倾出血栓，用滤纸吸干表面鲜血，称量血栓湿重。结果表明，毛梗豨莶小剂量组、腺梗豨莶大、小剂量组对冰水-肾上腺素造成的“血瘀”大鼠血栓形成有抑制作用，以腺梗豨莶的抑制作用为最强。见表17。表17三种豨莶草总提物对冰水-肾上腺素型大鼠血栓形成的影响
组别     剂量(g生药/kg)     动物数(n)     血栓湿重( X±SD，mg)
  正常组模型组复方丹参组毛梗豨莶组豨莶组腺梗豨莶组 1.54.82.44.82.44.82.4     101010101010101010     35.1±5.6**57.6±7.839.1±8.2**51.3±16.944.6±15.5*48.4±7.155.4±11.142.6±9.7**43.3±10.2**Δ
与模型组相比*P＜0.05  **P＜0.01豨莶小剂量与腺梗豨莶小剂量比较ΔP＜0.053.对静脉血栓型大鼠体内血栓形成的影响
取健康SD大鼠80只，雌雄各半，体重200±20g，随机分为8组，ig给药或等容积蒸馏水。每日1次，连续8日。末次给药前禁食不禁水过夜，未次给药后1hr，乌拉坦麻醉(麻醉剂量同前)，剖开大鼠腹部，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉。2hr后自结扎处下方2cm处纵行剖开管腔，取出血栓，吸干表面鲜血，称重，结果表明，毛梗豨莶小剂量组、豨莶大、小剂量组、腺梗豨莶大、小剂量组均可抑制大鼠静脉体内血栓的形成，各组间作用无显著性差异。见表18。表18三种豨莶草总提物对静脉血栓型大鼠体内血栓形成的影响
组别     剂量(g生药/kg)    动物数(n)     血栓湿重( X±SD，mg)
  正常组复方丹参组毛梗豨莶组豨莶组腺梗豨莶组 1.54.82.44.82.44.82.4     1010101010101010     12.9±9.02.9±1.9**9.1±4.57.2±7.9*6.4±4.8**3.5±4.2**5.4±3.4**5.5±4.4**
与正常组比**P＜0.01  *P＜0.05结论：
上述实验采用两种血瘀动物模型血栓形成及一种正常动物凝血时间的测定方法，对三种药典中收载的豨莶草进行了抗血栓作用的比较，结果显示三种豨莶草总提取物均有延长小鼠凝血时间及不同的抗血栓的作用，其中以腺梗豨莶抗血栓作用为好。(二)、腺梗豨莶草三个不同部位提取物抗血栓作用的比较研究目的：寻找腺梗豨莶草的有效部位。实验材料
1.动物：昆明种小鼠，合格证号：医动02-24-3号，SD品系大鼠，合格证号：医动02-244号。均由上海中医药大学实验动物中心提供。
2.试剂及仪器：
丹参注射液：上海中西药业股份有限公司，批号：010104
复方丹参片：上海雷允上药业有限公司，批号：020802
腺梗豨莶三个部位：将腺梗豨莶草的总提取物分别用不同极性的溶剂提取，按极性大小分为部位I、部位II和部位III盐酸肾上腺素注射液(Adr)，上海禾丰制药有限公司，批号：0006017
MR-4型多环血栓检测仪，上海斯隆医电设备有限公司实验方法与结果
1.对正常小鼠凝血时间的影响
取健康小鼠80只，雌雄各半，体重20±2g，随机分为8组，ig给药或等容积蒸馏水，每日1次，连续4日。末次给药后1hr，摘眼球取血，以毛细玻管法测定凝血时间(CT)，结果表明，部位II小剂量能够显著延长小鼠的凝血时间，与部位I、III相比较有显著性差异。见表19。
表19腺梗豨莶三个部位提取物对正常小鼠凝血时间的影响
组别     剂量(g生药/kg)   动物数(n)        CT( X±SD，S)
  正常组丹参注射液组部位I部位II部位III 2.34.02.04.02.04.02.0     1010101010101010     172.1±35.3229.5±43.5**160.5±42.0160.4±33.9ΔΔ170.5±29.1210.4±16.8*166.2±49.2178.4±26.0Δ
与正常组比*P＜0.05，**P＜0.01与部位II小剂量比较ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.012.对正常小鼠出血时间的影响[1]
取健康小鼠70只，雌雄各半，体重20±2g，随机分为7组，ig给药或等容积蒸馏水。末次给药后1hr，以利剪将小鼠尾尖5mm处横断，并迅速将鼠尾浸入装有37℃水的试管中，由血液自行溢出开始计时，至血液自然停止(无血丝落下)为止。计算出血时间(BT)，结果表明，三个部位均有延长小鼠出血时间的作用，各组间作用无显著性差异。见表20。
表20 腺梗豨莶三个部位提取物对正常小鼠出血时间的影响
    组别     剂量(g生药/kg)   动物数(n)    BT
    ( X±SD，S)
    正常组部位I部位II部位III 4.02.04.02.04.02.0     10101010101010     177.9±68.5328.3±116.8**308.4±78.5**342.4±114.2**314.5±126.2**373.5±71.5**338.7±116.4**
与正常组比，*P＜0.05，**P＜0.013.对静脉血栓型大鼠体内血栓形成的影响
取健康大鼠70只，雄性。体重200±20g，随机分为7组，ig给药或等容积蒸馏水。每日1次，连续8日，处置前禁食不禁水过夜。末次给药后1hr，用乌拉坦麻醉(剂量同前)，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉，2hr后自结扎处下方2cm处纵行剖开管腔，取出血栓，吸干表面鲜血，称重，结果显示，三个部位均有抗血栓作用，各组间作用无显著性差异。见表21。表21、腺梗豨莶三个部位提取物对静脉血栓型大鼠体内血栓形成的影响
组别     剂量(g生药/kg)   动物数(n)     血栓湿重( X±SD，mg)
    正常组部位I部位II部位III 2.41.22.41.22.41.2     10101010101010     10.5±4.15.4±4.0**5.2±2.7**5.8±4.2**6.1±2.1**4.0±2.0**7.3±3.5*
与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01
4.腺梗豨莶部位I、II对冰水-肾上腺素型大鼠血栓形成的影响
根据急性毒性实验结果，认为部位III相对毒性较大，故下列实验仅选用部位I与部位II进行抗血栓作用的比较研究。
取健康SD大鼠42只，雄性，随机分为6组。ig给药或等容积蒸馏水。每日1次，连续8日。于第7日除正常组外，其余各组大鼠皮下注射Adk，每次0.5mg/kg体重，共2次，间隔4hr。正常组皮下注射等容积生理盐水。处置后禁食不禁水过夜。第8日末次给药后1hr，除正常组外，其余各组大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min后浸入冰水中5min。正常组动物仅皮下注射等容积生理盐水。然后，所有动物用乌拉坦麻醉(剂量同前)后，腹主动脉取血2ml，按照Chandler体外法立刻将血注入旋转环内，迅速密封。置血栓形成仪上，旋转15min，倾出血栓，用滤纸吸干表面鲜血，将血栓条置80℃烘箱1hr，恒重后称重，即为血栓干重，结果显示，部位II可显著减轻血栓干重，其作用显著强于部位I，见表22。表22腺梗豨莶I、II部位对冰水-肾上腺素型大鼠体内血栓形成的影响
组别     剂量(g生药/kg) 动物数(n)     血栓干重( X±SD，mg)
    正常组模型组部位I部位I部位II部位II 2.41.22.41.2     777867    39.6±8.0**83.6±6.2113.4±15.5**95.8±40.056.5±7.0**ΔΔ102.1±47.8
与模型组比**P＜0.01
部位I大剂量与部位II大剂量比较ΔΔP＜0.01结论：1.腺梗豨莶部位II延长正常小鼠凝血时间的作用显著强于部位I和III。2.腺梗豨莶三个部位均能延长小鼠的出血时间，并对静脉血栓型大鼠体内血栓的形成有显著的抑制作用。3.部位II能显著抑制冰水-肾上腺素型大鼠血栓的形成。
综合上述结果，结合药效与毒理研究，初步认为部位II抗血栓作用较强且毒性较小，部位II值得进一步研究。(三)梗豨莶部位II与IIA抗血栓作用研究目的：
1.寻找部位II的有效剂量及作用机理初探
2.进一步寻找抗血栓的有效组分实验材料1.动物：昆明种小鼠，合格证号：医动02-24-3号，SD品系大鼠，合格证号：医动02-24-4号。均由上海中医药大学实验动物中心提供。2.试剂及仪器：复方丹参片：上海雷允上药业有限公司，批号：020802腺梗豨莶部位II：提取方法同前。抗血栓有效组分，将部位II进一步分离纯化的有效组分(简称IIA)。盐酸肾上腺素注射液(Adr)，上海禾丰制药有限公司，批号：0006017MR-4型多环血栓检测仪，上海斯隆医电设备有限公司SN-682放射免疫γ计数器，中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂实验方法与结果1.部位II对冰水-肾上腺素型大鼠血栓形成的影响
取健康大鼠58只，雄性，随机分为6组，ig给药或等容积蒸馏水。每日1次，连续8日。于第7日除正常组外，其余各组大鼠皮下注射Adr，每次0.5mg/kg体重，共2次，间隔4hr。正常组皮下注射等容积生理盐水。处置后禁食不禁水过夜。第8日末次给药后1hr，除正常组外，其余各组大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min后浸入冰水中5min。正常组动物仅皮下注射等容积生理盐水。然后，所有动物用乌拉坦麻醉(剂量同前)后，腹主动脉取血2ml，按照Chandler体外法立刻将血注入旋转环内，迅速密封。置血栓形成仪上，旋转15min，倾出血栓，用滤纸吸干表面鲜血，称量血栓湿重。将血栓条置80℃烘箱1hr，恒重后称量，即为血栓干重。结果表明，腺梗豨莶部位II可显著减轻血栓湿重和干重，在剂量为55mg提取物/kg时有显著意义。见表23。
表23、腺梗豨莶部位II对冰水-肾上腺素型大鼠血栓形成的影响
组别     剂量(mg提取物/kg)   动物数(n)     血栓湿重( X±SD，mg)     血栓干重( X±SD，mg)
  正常组模型组复方丹参组 1.5g/kg      9910   169.9±22.0**428.1±114.9122.6±24.8**     40.7±9.4**101.7±10.448.8±13.6**
    部位II     1105527.5     101010     274.5±77.2**312.9±73.7**392.5±62.6     64.1±16.3**68.0±23.7**106.2±30.1
与模型组比较*P＜0.05  **P＜0.01
2.腺梗豨莶部位II和IIA对冰水-肾上腺素型大鼠凝血系统的影响
取健康大鼠74只，雄性，随机分为7组。ig给药或等容积蒸馏水。每日1次，连续8日。于第7日除正常组外，其余各组大鼠皮下注射Adr，每次0.5mg/kg体重，共2次，间隔4hr。正常组皮下注射等容积生理盐水。处置后禁食不禁水过夜。第8日末次给药后1hr，除正常组外，其余各组大鼠均皮下注射Adr0.5mg/kg，20min后浸入冰水中5min。正常组动物仅皮下注射等容积生理盐水。然后，所有动物用乌拉坦麻醉(剂量同前)后，腹主动脉取血5ml，其中2ml血注入放有3.8％枸橼酸钠的试管中(抗凝剂和全血的比例为1∶9)，3ml血注入含有消炎痛-EDTA-Na2液0.2ml试管内，4℃，3500rpm，离心15min，分离血浆。按试剂药盒说明书测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)和TXB2。结果显示，部位II与IIA能显著抑制冰水-肾上腺素型大鼠血栓形成，显著延长大鼠凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)，明显降低血中TXB2的含量。见表24表24腺梗豨莶部位II及IIA对冰水-肾上腺素型大鼠凝血功能的影响
组别 剂量(mg提取物/kg) 动物数(n)     PT( X±SD，s)          TT( X±SD，S)     KPTT( X±SD，S)     TXB2( X±SD，pg/ml)
正常组模型组复方丹参组部位IIIIA 1.5g/kg1655516555     11101110959   16.3±1.4**12.8±0.816.4±1.0**16.9±1.2**Δ16.0±0.9**15.6±0.8**14.4±0.8**   2.9±5.3**31.4±2.340.1±3.4**37.2±2.0**ΔΔ34.9±1.1**32.4±0.834.7±1.4**   18.0±1.5**13.3±0.717.5±0.9**16.8±1.1**16.8±1.1**1 6.2±0.8**15.9±1.0**   76.8±12.0**264.1±230.185.5±29.0**146.8±79.5*113.8±34.3**99.2±16.8**125.1±42.2**
与模型组比**P＜0.01 *P＜0.05
PT：II大与IIA大比较ΔP＜0.05
TT：II大与IIA大比较ΔΔP＜0.01结论：1.通过腺梗豨莶部位II对冰水-肾上腺素型大鼠血栓形成影响的实验研究，寻找出部位II在剂量为55mg提取物/kg即有效。2.IIA为部位II进一步分离纯化的组分，经测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)和TXB2，表明IIA有抑制大鼠内源性及外源性凝血系统和抗血小板聚集的作用，显示IIA应为豨莶草抗血栓作用的有效组分。
本发明的另一目的是提供了腺梗豨莶草抗血栓活性组分的制备方法，该方法为将腺梗豨莶用70％乙醇分别于1小时、小时、0.5小时回流提取3次，合并提取液加收乙醇，得提取物，然后按极性大小，将总提取物分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇萃取，得到小极性部位I、中极性部位II和大极性部位III，将中极性部位经活性炭脱色得豨莶草抗血栓活性组分。
社会效益与经济效益预测：通过系统的活性筛选和化学成分研究，阐明了豨莶草抗血栓活性组分中的药效物质基础和初步的作用机理，为二类中药新药的研制奠定了良好的基础，同时，传统中药向现代意义的中药过渡，也必将产生一定的社会效益与巨大的经济效益。
附图说明：图1、化合物6的主要HMBC相关示意图图2、奇壬醇的色谱峰图3、豨莶草抗血栓有效组分指纹图谱图4、奇壬醇液相色谱图图5、奇壬醇正离子总流程图图6、奇壬醇正离子质谱图图7、奇壬醇负离子质谱图图8、抗血栓有效组分液相色谱图图9、抗血栓有效组分正离子总流程图图10、抗血栓有效组分负离子总流程图图11、抗血栓有效组分薄层层析图图12、奇壬醇的标准曲线图13、奇壬醇对照品的色谱图图14、抗血栓有效组分的色谱图图15、奇壬醇含量测定图
具体实施方式：
取腺梗豨莶草10kg，用70％乙醇回流提取3次(100升提取1小时，60升提取0.5小时)。合并提取液，减压回收乙醇，至干，得总提取物约800g。用2倍量硅藻土拌匀样品，干燥，分别用10倍量石油醚、乙酸乙酯、甲醇洗脱，收集洗脱液，得到小极性部位(石油醚部位)180g，中极性部位(乙醇乙酯部位)120g和大极性部位(甲醇部位)，中极性部位经活性炭脱色得到豨莶草抗血栓活性组分65g。

Claims (5)

1、一种豨莶草抗血栓有效组分，其特征在于该组分包括奇壬醇(kirenol 1)、豨莶精醇(darutigenol 2)、对映-17、18-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸(ent-17，18-dihydroxy kauran-19-oic acid 3)、对映-16、17-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸(ent-16，17，-dihydroxy kauran-19-oic acid 4)、对映-17-羟基贝壳杉烷-19-羧酸(ent-16αH，17-hydroxy kauran-19-oic acid 5)、3’、5’、β-三羟基，3、4、4’、α、-四甲氧基查儿酮(3’、5’、β-trihydroxy，3、4、4’、α、-tetramethoxy-chalcone 6)、以及豆甾醇(Stigmasterol 7)。
2、根据权利要求1所述的一种豨莶草抗血栓有效组分，其特征在于其中所述3’、5’、β-三羟基，3、4、4’、α-四甲氧基查儿酮具有下列结构。
Figure A0311709700021
                      化合物6的结构式
3、一种如权利要求1所述的豨莶草抗血栓有效组分的分离方法，其特征在于该方法为将腺梗豨莶用70％乙醇分别于1小时、小时、0.5小时回流提取3次，合并提取液加收乙醇，得提取物，然后按极性大小，将总提取物分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇萃取，得到小极性部位I、中极性部位II和大极性部位III，将中极性部位经活性炭脱色得豨莶草抗血栓活性组分。
4、一种如权利要求1所述的豨莶草抗血栓有效组分的指纹图谱分析方法，其特征在于该分析方法为：(1)仪器和材料
高效液相色谱仪，配有自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器DAD，四元泵，Agilent-ChemStation化学工作站，Pall纯水器，乙腈；
样品制备：称取5份腺梗豨莶，各20g，按有效组分的提取方法，平行操作，得到5个有效组分样品，各取0.1g样品，加入适量甲醇∶水1∶4的溶液，过C18预柱，再用甲醇洗脱，收集甲醇液，再用0.45μm的有机相滤膜过滤，作为样品溶液；
对照品溶液制备：取奇壬醇1mg，甲醇溶解，用0.45μm的有机相滤膜过滤，定容到10ml的容量瓶中，作为对照品溶液；(2)色谱条件
色谱柱：Polaris C8-A5u，150×4.6mm
检测器：DAD，215nm
流动相：乙腈-水(梯度，乙腈：0min，20％；15min，35％；40min，
80％)
柱温：40℃
流速：1ml/min
试验结果表明，豨莶草抗血栓有效组分指纹图谱有14个共有峰，经与对照品对照，保留时间在9.826分钟的色谱峰为奇壬醇，该有效组分的中主要有效成分为二萜类成分奇壬醇。
5、一种如权利要求1所述的豨莶草抗血栓有效组分在制备心血管系统药中的应用。
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