CN1864705A

CN1864705A - 一种牛蒡子提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1864705A
Application number: CN 200510025834
Authority: CN
Inventors: 徐朝晖; 贾伟; 邱明丰; 赵爱华
Original assignee: SHANGHAI NUOREN BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI NUOREN BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2005-05-16
Filing date: 2005-05-16
Publication date: 2006-11-22

Abstract

本发明涉及一种牛蒡子提取物及其制备方法和应用，该提取物中包括以牛蒡苷元为主的总木脂素类化合物和牛蒡苷，提取物中总木脂素类化合物和牛蒡苷的重量含量占51％～80％(紫外分光光度法测定)，其它成分的重量含量占20％～49％。经药理和毒理试验结果表明，本发明牛蒡子提取物药理活性强，毒副作用小，可以用于制备降血糖和抗糖尿病肾病药物。

Description

一种牛蒡子提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种提取物及其制备方法和应用，尤其涉及一种牛蒡子提取物及其制备方法和应用。

背景技术

目前，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重威胁人类健康的疾病，被WHO列为世界三大顽症之一。在糖尿病患者中，病程超过15年以上的I型糖尿病患者有30％～40％发生肾病变，II型糖尿病患者的这一比例约为25％，如果发展到“显性肾病”期，则病情不可逆转。

牛蒡子为《中国药典》2000年版一部收载的中药，原属于辛凉解表类中药，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功能，用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛等症，用量6～12g/日。

研究表明，牛蒡子具有显著的降血糖和抗糖尿病肾病作用，但对其具有这两种药理作用的活性部位至今缺乏精确的定位，对其活性部位的成分组成更未见报道。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种牛蒡子提取物及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种牛蒡子提取物，其特征在于：该提取物中包括以牛蒡苷元为主的总木脂素类化合物和牛蒡苷，提取物中总木脂素类化合物和牛蒡苷的重量含量占51％～80％(紫外分光光度法测定)，其它成分的重量含量占20％～49％。

所述的提取物中，牛蒡苷元的重量含量占3％～40％(高效液相色谱法测定)，牛蒡苷的重量含量占8％～60％(高效液相色谱法测定)，牛蒡苷和牛蒡苷元两者的总重量含量占45％～75％，其余木脂素类化合物的重量含量占6％～35％(紫外分光光度法测定)。

所述的其它成分包括有机酸类化合物、不饱和烃类化合物、β-谷甾醇和胡萝卜苷。

一种牛蒡子提取物的制备方法，其特征在于：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加6～10倍重量50％～95％乙醇，回流提取2～3次，每次3～6h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浓缩浸膏无醇味；所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，将其下层干浸膏混悬于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液无色；将萃取液减压浓缩成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于重量5％、收率为重量8％～20％的牛蒡子提取物。

一种牛蒡子提取物的应用，其特征在于：该牛蒡子提取物应用于制备降血糖和抗糖尿病肾病药物。

按上述方法制备的牛蒡子提取物中含有牛蒡苷(arctiin)，牛蒡苷元(arctigenin)，罗汉松脂素(matairesinol)，Lappaol A，Lappaol C，Lappaol F，LappaolH、Arctignan E、-谷甾醇和胡萝卜苷10种化合物。

本发明所述的牛蒡子提取物，经药理试验证明，具有显著的降血糖和抗糖尿病肾病作用。

本发明所述的牛蒡子提取物，经小鼠的急性毒性试验表明，其小鼠的口服LD₅₀为140.7g生药/kg，LD₅₀的95％可信限为154.3～128.4g生药/kg。LD₅₀的平均可信限为140.7±12.94g生药/kg。

药理和毒理试验结果表明，本发明所述的牛蒡子提取物药理活性强，毒副作用小，可以用于制备降血糖和抗糖尿病肾病药物。

综上所述，我们结合药理学、植物化学和分析化学等研究手段，首次确定了牛蒡子降血糖和抗糖尿病肾病的活性部位为其所含的总木脂素类和牛蒡苷(arctiin)，并明确了其成分组成及组成比例。

由该活性部位所构成的牛蒡子提取物，经小鼠的急性毒性试验表明，毒副作用小，在制备降血糖和抗糖尿病肾病药物中将有较为广阔的应用前景。

附图说明

图1为牛蒡苷的化学结构式；

图2为牛蒡苷元的化学结构式；

图3为牛蒡苷元检测波长扫描图；

图4为牛蒡苷元标准曲线图；

图5为牛蒡苷的HPLC图谱；

图6为牛蒡苷元的HPLC图谱；

图7-9为牛蒡子3批提取物的含量测定HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种牛蒡子提取物，其制备方法为：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加5倍量50％乙醇，回流提取2次，每次3h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浓缩浸膏无醇味。所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，将其下层干浸膏混悬于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液无色。将萃取液减压浓缩成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。

该牛蒡子提取物干粉经紫外分光光度法进行含量测定(具体操作参见本发明实施例5)，其总木脂素类化合物和牛蒡苷的重量含量为51％～60％。

实施例2

一种牛蒡子提取物，其制备方法为：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加8倍量80％乙醇，回流提取3次，每次4h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浓缩浸膏无醇味。所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，将其下层干浸膏混悬于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液无色。将萃取液减压浓缩成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于5％的牛蒡子提取物干粉。

该牛蒡子提取物干粉经紫外分光光度法进行含量测定(具体操作参见本发明实施例5)，其总木脂素类化合物和牛蒡苷的重量含量为55％～70％。

实施例3

一种牛蒡子提取物，其制备方法为：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加10倍量95％乙醇，回流提取2次，每次6h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浓缩浸膏无醇味。所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，将其下层干浸膏混悬于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液无色。将萃取液减压浓缩成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于5％的牛蒡子提取物。

该牛蒡子提取物干粉经紫外分光光度法进行含量测定(具体操作参见本发明实施例5)，其总木脂素类化合物和牛蒡苷的重量含量为65％～80％。

实施例4

一种牛蒡子提取物，进行化学成分研究，得到牛蒡苷，牛蒡苷元，罗汉松脂素，Lappaol A，Lappaol C，Lappaol F，Lappaol H，Arctignan E，β-谷甾醇和胡萝卜苷10种化合物，经定性反应鉴别，证明该提取物中还含有有机酸类化合物和不饱和烃类化合物。

具体分离流程如下：

将所得的牛蒡子提取物进行硅胶柱层析，以乙醚、乙酸乙酯、甲醇依次洗脱，分别得到乙醚、乙酸乙酯和甲醇3个洗脱部位。

将其中的乙醚洗脱部位进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(100∶1→10∶1)梯度洗脱，100ml收集一个流份。其中流份15-16经分离纯化得到-谷甾醇，55-60经分离纯化得到罗汉松脂素和牛蒡苷元。

将其中的乙酸乙酯洗脱部位进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(50∶1→10∶1)梯度洗脱，100ml收集一个流份，流份62-73经分离纯化得到Lappaol A，流份105-106经分离纯化得到Lappaol F，流份117-120经分离纯化得到Lappaol C，流份141-142经分离纯化得到Arctignan E，流份156-160经分离纯化得到胡萝卜苷和牛蒡苷，流份169-171经分离纯化得到Lappaol H。

取所得的牛蒡子提取物30mg，溶于95％乙醇，定容至100ml，得牛蒡子提取物的乙醇溶液。以该溶液进行系统的化学成分检测，结果表明，除了上述分离得到的化合物外，该提取物中还含有有机酸类化合物和不饱和烃类化合物。具体操作如下：

点一滴上述溶液于滤纸片上，喷洒0.1％溴酚蓝溶液(溶于70％乙醇中)，立即在蓝色背景上显示出黄色的斑点。再喷洒氨水，然后暴露在盐酸气体中，背景逐渐由蓝色变为黄色，而有机酸盐的斑点仍为蓝色，证明该牛蒡子提取物中含有有机酸类化合物。

取上述溶液1ml于试管中，加入适量溴水，振荡，溴水褪色，证明该牛蒡子提取物中含有不饱和烃类。

实施例5

将本发明所述的牛蒡子提取物，采用紫外分光光度法，以牛蒡苷元为外标，于280nm波长处测定其总木脂素类及牛蒡苷的含量，相应得出该提取物中其他成分的百分含量。具体操作如下：

1仪器与材料

1.1材料

本项研究所用牛蒡子原药材购自徐州医药股份有限公司药材分公司，产地江苏徐州。经上海交通大学药学院生药学课题组刘忠副教授鉴定，确定为菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果实，研究所用药物为牛蒡子提取物；牛蒡苷元对照品购自Sigma公司。

1.2仪器

FA2004N型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；KQ-250DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UNICO UV-2102PCS型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；

2方法学考察

2.1对照品溶液的配制

精密称取干燥至恒重的牛蒡苷元标准品9.2mg，置于干燥的100ml容量瓶中，用甲醇超声溶解，滤过后定容至刻度，即得对照品溶液。

2.2检测波长的确定

用紫外分光光度法在200nm～600nm范围内对以上配制的牛蒡子苷元标准品进行检测波长扫描，结果见说明书附图3。

由图3确定牛蒡子苷元标准品紫外分光光度法的检测波长为280nm。

2.3标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液，分别稀释定容至以下浓度：4.6、2.3、1.15、0.575(×10^-2mg/ml)，于波长280nm处测定吸收度，随行试剂空白，结果见表1。以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘标准曲线，标准曲线图见说明书附图4。

表1吸光度—浓度值数据

对照液编号

浓度(10^-2mg/ml)

吸光度

12345

0.5751.152.34.69.2

0.0720.1650.350.7171.429

得标准曲线的回归方程为A＝0.157×C-0.014，r＝0.9999(n＝5)，线性范围在(0.575～9.2)×10-2mg/ml之间。

2.4精密度试验

精密吸取牛蒡苷元标准液，按标准曲线的绘制项下方法操作，测试仪器精密度，结果见表2。连续重复测定5次，RSD为0.962％。

表2精密度试验数据

对照液编号	吸光度	吸光度均值	RSD(％)
对照液编号	吸光度	吸光度均值	RSD(％)	12345	0.2680.2670.2650.2630.262	0.265	0.96

2.5重现性考察

分别精密称取相同质量的牛蒡子提取物5份，用甲醇定容于100ml容量瓶中。取适量样品液，于波长280nm处测定吸收度，见表3。该批样品的RSD为0.98％.

表3重现性考察数据

样品液编号	吸光度	平均含量(％)	RSD(％)
样品液编号	吸光度	平均含量(％)	RSD(％)	12345	0.3520.3500.3530.3480.350	0.351	0.98

2.6加样回收率实验

分别取3份已知含量的样品液1.5ml，分别加入0.5ml、1ml、1.5ml对照品溶液，加甲醇定容至10ml，按标准曲线的绘制项下操作，结果见表4.得平均回收率100.02％，RSD 4.12％.

表4加样回收率试验数据

编号	对照品加入量(ug)	样品加入量(ug)	吸光度	回收率(％)	平均回收率(％)	RSD(％)
编号	对照品加入量(ug)	样品加入量(ug)	吸光度	回收率(％)	平均回收率(％)	RSD(％)	123	4692138	56.756.756.7	0.5510.6420.753	97.27104.80103.45	100.02	4.12

2.7稳定性试验

精密吸取牛蒡苷元标准液，按标准曲线的绘制项下方法操作，在0，0.5，1，2，4，8小时分别测一次吸光度，见表5。在8小时内，吸光度值变化不明显，说明样品溶液较稳定。

表5稳定性试验数据

时间(小时)	吸光度
时间(小时)	吸光度	00.51248	0.2650.2650.2650.2650.2660.266

3.含量测定

精密称取牛蒡子提取物5.0mg，加甲醇溶解，定容于50ml，于280nm处测定吸收度，根据标准曲线，计算出样品中总木脂素类化合物及牛蒡苷类的含量。

经过对多批样品的含量测定，测得本提取物中总木脂素类化合物及牛蒡苷的含量为51％～80％，则其它成分的含量为20％～49％。

实施例6

将本发明所述的牛蒡子提取物，采用高效液相色谱法，以牛蒡苷、牛蒡苷元为外标，通过积分面积比，测定其牛蒡苷元和牛蒡苷的含量。将实施例2中所测得的总木脂素类及牛蒡苷的含量减去本实施例中测得的牛蒡苷元和牛蒡苷的总含量，即得本提取物中其余总木脂素类的含量。具体操作如下：

1材料与仪器

1.1实验材料

本项研究所用牛蒡子原药材购自徐州医药股份有限公司药材分公司，产地江苏徐州。经上海交通大学药学院生药学课题组刘忠副教授鉴定，确定为菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果实，研究所用药物为牛蒡子提取物。

1.2仪器

岛津高效液相色谱仪(LC-10ATvp型，SPD-10AVP紫外检测器，CLASS-VPVer.6.12色谱工作站，SIL-10AF自动进样器)，FA2004N型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，UNICO UV-2102PCS型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)。

1.3试剂

牛蒡苷元对照品(Sigma公司)，牛蒡苷对照品(自制，经UV、IR、MS、NMR完成结构鉴定，HPLC含量测定，纯度为98.5％)。试剂均为色谱纯(美国TEDIA公司)。

2方法

2.1色谱条件

色谱柱：SymmetryshieldTM RP18(4.6×150mm，5μm，美国Waters公司)；流动相：甲醇—乙腈—水(20∶20∶60)；流速：1ml/min，检测波长280nm，柱温：30℃，量程：1.0AU/FS。

在以上色谱条件下，样品液相色谱图中，牛蒡苷及牛蒡苷元与其它组分的色谱峰分离度良好。

2.2检测波长的选择

将配制的牛蒡苷元对照品溶液在UNICO UV-2102PCS型紫外可见分光光度计上进行扫描，测定其吸收波长，在230nm和280nm处均有较强吸收。选择不同的波长进行测定，发现在230nm处测定，色谱基线易波动，故选择确定280nm为检测波长。

3.建立标准曲线

3.1线性范围

精密称定牛蒡苷对照品4.09mg置50ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，使对照品浓度为0.0818mg/ml。精密吸取对照品溶液5、10、15、20、25ul分别注入高效液相色谱仪，测定牛蒡苷的色谱峰面积，以进样量为横座标，峰面积为纵座标，得回归方程为：

Y＝299990.7X-30402.19 r＝0.9998

牛蒡苷在0.4-2.0μg范围内线性关系良好。

同法制成牛蒡苷元对照品液，按同样色谱条件测定，得回归方程为：

Y＝18318.65X-4518.3 r＝0.9995

牛蒡苷元在0.09μg-0.45μg范围内线性关系良好。

表6牛蒡甙线性范围考察

进样量(μg)	0.409	0.818	1.227	1.636	2.045
进样量(μg)	0.409	0.818	1.227	1.636	2.045	峰面积	92294	214990	337686	460382	583078

表7牛蒡甙元线性范围考察

进样量(μl)	2	4	6	8	10
进样量(μl)	2	4	6	8	10	甙元色谱峰面积	34295	67227	103875	140952	180619

3.2稳定性考察

取同一供试品，按一定时间间隔进行测定，结果见表8：

表8牛蒡苷及牛蒡苷元稳定性考察结果

时间(小时)	0	2	4	6	8	10	x	RSD(％)
时间(小时)	0	2	4	6	8	10	x	RSD(％)	牛蒡苷色谱峰面积牛蒡苷元色谱峰面积	33684880925	33852678267	34000680960	34092777895	34343677856	34360978213	34055879019	0.81.89

根据考察结果，牛蒡苷及牛蒡苷元化学性质稳定，样品液在10小时内测定，结果可靠。

3.3精密度测量

取同一供试品溶液，按以上色谱条件连续进样6次，结果见表9：

表9牛蒡苷元精密度考察结果

序号	1	2	3	4	5	6	x	RSD(％)
序号	1	2	3	4	5	6	x	RSD(％)	牛蒡苷元色谱峰面积	36267	36114	36463	35828	35867	37107	36274	1.30

考察结果可见，精密度良好，说明HPLC法系统误差小。

3.4重现性试验

取六份(沈阳)的样品，分别按含量测定项下方法操作，测定结果见表10：

表10重现性试验测定结果

序号	1	2	3	4	5	6	X	RSD(％)
序号	1	2	3	4	5	6	X	RSD(％)	牛蒡苷含量	4.72	4.84	4.88	4.79	4.81	4.80	4.80	1.1

结果表明该方法重现性好。

3.5加样回收率试验

取样品(牛蒡苷含量5.62％)0.25g，精密称定，置50ml具塞三角瓶中，加入牛蒡苷对照品液10.0ml(1.005mg/ml)。按样品制备方法进行操作，结果见表11：

表11牛蒡苷加样回收率测定结果

	样品称重(g)	样品中牛蒡苷含量(mg)	加入对照品量(mg)	测定总量(mg)	回收率(％)	均值(％)	RSD(％)
	样品称重(g)	样品中牛蒡苷含量(mg)	加入对照品量(mg)	测定总量(mg)	回收率(％)	均值(％)	RSD(％)	12345	0.25250.26090.25760.25910.2486	14.0914.5614.3714.4513.87	10.0510.0510.0510.0510.05	24.0024.5124.2224.2123.52	98.699.098.097.196.0	97.7	1.2

取样品(苷元含量为1.00％)0.5g，精密称定，置50ml具塞三角瓶中，加入牛蒡苷元对照品溶液5.0ml(0.9906mg/ml)，按样品制备方法进行操作，结果见表12：

表12牛蒡苷元加样回收率测定结果

样品(g)	称重	样品中牛蒡苷元含量(mg)	加入对照品量(mg)	测定总量(mg)	回收率(％)	均值(％)	RSD(％)
样品(g)	称重	样品中牛蒡苷元含量(mg)	加入对照品量(mg)	测定总量(mg)	回收率(％)	均值(％)	RSD(％)	12345	0.51160.46790.51790.54750.5495	5.124.685.185.485.50	4.954.954.954.954.95	9.989.5710.1310.5310.54	98.298.8100.0102.0101.8	100.16	1.71

4.含量测定

精密称取牛蒡子提取物5.0mg，加甲醇溶解，滤过，定容于50ml，以自动进样器精密吸取上述已配制好的样品溶液2μl，进样，记录色谱图，根据积分面积百分比计算样品中牛蒡苷和牛蒡苷元的百分含量，表13、表14为3批提取物的含量测定结果(含量测定HPLC图谱参见说明书附图5-9)。

表13牛蒡苷含量测定结果

编号	色谱峰面积	色谱峰面积百分比	百分含量
编号	色谱峰面积	色谱峰面积百分比	百分含量	yp-05.4-Rep2.182批-05.4-Rep2.181批-05.4-Rep2.18	811643149881274527	9.34937.40159.116	9.3537.459.12

表14牛蒡苷元含量测定结果

编号	色谱峰面积	色谱峰面积百分比	百分含量
编号	色谱峰面积	色谱峰面积百分比	百分含量	yp-05.4-Rep2.182批-05.4-Rep2.181批-05.4-Rep2.18	32890966023514299	37.88615.0313.079	37.8915.033.08

经过对多批样品的含量测定，测得本提取物中牛蒡苷元的含量在3％～40％，牛蒡苷的含量在8％～60％，牛蒡苷和牛蒡苷元两者的总含量在45％～75％。

根据实施例2中所测得的总木脂素类及牛蒡苷的含量为51％～80％，减去本实施例中测得的牛蒡苷元和牛蒡苷的总含量45％～75％，即得本提取物中其余总木脂素类的含量为6％～35％。

实施例7

将本发明所述的牛蒡子提取物用于进行降血糖实验。实验证明，该牛蒡子乙醇提取物具有显著的降血糖作用。

1实验材料

1.1实验动物：SPF级，昆明种小白鼠58只，6周龄，体重25±2g，雌雄各半，随机分组。由中科院动物实验中心提供。

1.2实验药物：本项研究所用牛蒡子原药材购自徐州医药股份有限公司药材分公司，产地江苏徐州。经本院生药学课题组刘忠副教授鉴定，确定为菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果实，研究所用药物为牛蒡子提取物；阳性对照药为优降糖(上海信谊药业有限公司)，葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)。

2实验方法

2.1动物分组

空白对照组：雌雄各4只。不造模，不给药，给等量生理盐水。

阴性对照组：雄性7只，雌性3只。造模，不给药，给等量生理盐水。

阳性对照组：雌雄各5只。造模，给阳性药。

实验药物组：雌雄各5只。造模，给牛蒡子提取物。

2.2糖尿病实验动物模型的建立

小鼠禁食12小时后，腹腔注射四氧嘧啶(ALX)100mg/kg。即配制ALX溶液10mg/ml，以小鼠体重×0.01计注射量(如25g小鼠注射0.25ml ALX)。但最大计量不宜超过0.3ml。

造模当晚及第二日注意观察小鼠状态，急救因血糖过低明显发生痉挛的小鼠，即以饱和葡萄糖溶液灌胃0.2ml/只。

2.3给药

造模2天后开始给药，连续给药8天，给药途径为灌胃。

据药典，给药量人以10g/60kg计算，换算为小鼠140g/60kg，即2.3g/kg。

称取牛蒡子提取物4.8g溶于15ml水中，即得0.32g/ml。给药前每只小鼠先称重，如体重30g的灌胃0.2ml、20g的灌胃0.13ml，依此类推。给药量为2.1g药/kg小鼠。

优降糖取4片(2.25mg/片)，即4×2.25＝9mg溶于15ml双蒸水中，得到0.6mg/ml，以“小鼠体重/2×0.01”计量给药，如体重26g的给药0.13ml。给药量为3mg药/kg小鼠。

2.4血糖测定

第8天给药1小时后，小鼠眼内眦取血1ml左右于appendoff管中，而后处死小鼠。取血后静置1小时，然后4℃、2000rpm离心5min，分离上层血清。

用葡萄糖氧化酶法，根据葡萄糖试剂盒说明书操作：取10ul血清+1ml工作液(R1∶R2＝1∶1)，混匀后37℃水浴20min，用半自动生化分析仪测定葡萄糖含量；其中，取10ul双蒸水+1ml工作液作为空白管，取10ul标准液+1ml工作液作为标准品管。

3实验结果

表15牛蒡子提取物对小鼠血糖浓度的影响

(x±s，mM)

动物分组	血糖浓度
动物分组	血糖浓度	空白对照组阴性对照组阳性药物组实验药物组	8.54±0.86(8)10.6±0.64(9)^6.11±0.51(7)^8.25±1.98(7)^**

注：“()”内为动物数。

表15中，分别为空白对照组，阴性对照组，阳性药物组，实验药物组。造模后给药前进行模型是否成功的筛选，小鼠尾静脉取血测空腹血糖，血糖值大于空白组且统计学上有显著性差异的动物认为造模成功(数据未显示)。

如表15所示，阴性组小鼠血糖浓度明显高于其他实验组(t检验，^**p＜0.01vs空白组)，表明此次用四氧嘧啶进行小鼠糖尿病造模成功。阳性组小鼠血糖浓度达到最低(t检验，^**p＜0.01vs阴性组)，结果进一步提示实验动物模型可靠。而牛蒡子提取物组小鼠血糖浓度基本恢复到对照组水平(t检验，^**p＜0.01vs阴性组)。表明牛蒡子提取物对糖尿病模型小鼠具有显著的降血糖作用。

实施例8

将本发明所述的牛蒡子提取物用于进行抗糖尿大鼠肾脏病变实验。实验证明，该牛蒡子提取物具有显著的改善糖尿大鼠肾脏病变作用。

1实验材料

1.1实验动物：采用清洁级三月龄雄性Wistar大鼠，体重180-200g，雌雄各半，随机分组。由中科院动物实验中心提供。

1.2实验药物：本项研究所用牛蒡子原药材购自徐州医药股份有限公司药材分公司，产地江苏徐州。经本院生药学课题组刘忠副教授鉴定，确定为菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果实，研究所用药物为牛蒡子提取物。

2实验方法

2.1动物分组

空白对照组：雌雄各5只。不造模，不给药，给等量生理盐水。

阴性对照组：雌雄各5只。造模，不给药，给等量生理盐水。

阳性对照组：雌雄各5只。造模，给阳性药。

实验药物组：雌雄各5只。造模，给牛蒡子提取物。

2.2糖尿病实验动物模型的建立

造模前大鼠禁食12h，链脲佐茵素(STZ)临用前用0.1mol/L，PH4.0的枸橼酸酸缓冲液配成1％的浓度，以55mg/kg体重的剂量，腹腔内一次性注射。72h后检测空腹血糖和尿糖水平，以血糖＞16.7mmol/L且尿糖检测在+++～++++以上作为模型入选。空白对照组仅予以等量的枸橼酸缓冲波腹腔注射。

2.3动物的给药

确定造模大鼠达到模型标准后，稳定3天后开始灌胃用药。实验药物组每只鼠每日予0.5ml药液(相当于2.5g生药的提取物)灌胃，空白对照组、阴性对照组每只予0.5ml自来水灌胃。每天统计各笼大鼠的饮水量，每周统计各笼大鼠的进食量，每周称量各大鼠的体重变化。

2.4标本收集与处理

用药后第6周时用代谢笼收集大鼠24h尿液，离心，计总量，保存于-30冰箱中。第6周末称量大鼠的体重，在无菌条件下，以戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血约6ml，分别用于血肌酐及血脂等生化指标(2ml)、血常规及糖化血红蛋白(2ml)检测，所用的试管分别为普通管、肝素抗凝管。取双肾称重，用于计算肾重/体重比(即肾脏肥大指数)。双肾沿正中剖开，左肾置于10％中性福尔马林液中固定，用于病理检测。

2.5常规指标检测

血肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶及甘油三酯、胆固醇等生化指标采用日立7170型自动生化分析仪检测。外周血糖化血红蛋白(HbA1C)采用罗氏(Roche)诊断试剂有限公司的糖化血红蛋白试剂盒检测。尿肌酐采用碱性苦味酸法，尿蛋白用考马斯亮兰法。

2.6肾组织病理学检查

2.6.1常规HE染色及PAS染色取左肾组织，经10％的中性福尔马林缓冲液固定后，浸蜡、包埋、连续切片，厚约4m，常规HE及PAS染色，光镜下观察肾组织病理变化。在高倍镜下观察每张切片肾皮质部分5个以上大小相似的肾小球，用IMS彩色图像分析系统(上海申腾信息技术有限公司)分析每个肾小球阴染色阳性的基质面积、肾小球总面积，以求得基质阳性面积比值(阳性面积/肾小球总面积)。

2.6.2免疫组化法检测 u-PA、PAI-1，c-fos、c-jun。每个实验组镜下5例切片，每张切片观察10个大小相近的肾小球，根据软件分析每个肾小球免疫组化染色阳性面积占整个肾小球面积的比值，统计每组免疫组化阳性面积百分比。

2.7统计分析

本文中数据统计均用SPSS Version10.0(SPSS Inc.，2000)完成，其中各组均数以均数±标准差(±s)表示，资料统计采用One-Way ANOVA法分析，方差不齐时采用Dunnett T3法分析。统计显著性水平为P＜0.05。

3.实验结果

3.1一般情况空白对照组大鼠体重增长明显，精神状况良好，动作自如，反应灵敏，毛皮有光泽。阴性对照组大鼠明显消瘦，多饮多尿、精神萎靡，反应迟钝，毛竖无光泽，动作迟缓。实验药物组精神状况均良好，动作自如，反应灵敏度较空白对照组稍差。阴性对照组及实验药物组大鼠进食量、饮水量均较空白对照组显著升高；实验药物组进食量、饮水量均较阴性对照组低。

3.2生化指标的改变

3.2.1第6周末肌酐清除率和24小时尿蛋白定量的变化见表16。

表16第6周末肌酐清除率、24小时尿蛋白的变化

组别	N	CCr(ml/min)	24h尿蛋白(mg/24h)
组别	N	CCr(ml/min)	24h尿蛋白(mg/24h)	空白对照组	10	2.073±0.672	8.87±2.09
阴性对照组	10	21.074±11.25	41.30±7.94	空白对照组	10	2.073±0.672	8.87±2.09
阴性对照组	10	21.074±11.25	41.30±7.94	实验药物组	10	2.802±0.497	13.14±4.56

与阴性对照组比较★P＜0.05。

3.2.2第4周末及6周末尿白蛋白的变化见表17。

表17第4周末及6周末尿白蛋白的变化

组别	N	Alb(mg/24h)
		Alb(mg/24h)		(4周末)	(6周末)
		空白对照组	10	(4周末)	(6周末)	1.23±0.48	2.95±0.60
阴性对照组	10	空白对照组	10	3.47±0.65^#	13.28±4.30^#	1.23±0.48	2.95±0.60
阴性对照组	10	实验药物组	10	3.47±0.65^#	13.28±4.30^#	1.63±0.51	7.14±1.73^#

与空白对照组比较#P＜0.05；与阴性对照组比较★P＜0.05。

3.3组织病理学检查结果

3.3.1HE及PAS染色光镜下显示正常大鼠肾小球血管开放，结构清晰，HE染色后肾小球胶原组织呈细线型分布。6周糖尿病阴性对照组大鼠肾小球系膜细胞轻中度增生，伴基质轻度增多，部分呈局灶节段样基质增多，PAS染色物质增多，肾小球毛细血管扩张；肾小管上皮细胞出现张力空泡、脂肪变和水样变性；间质炎症细胞浸润，伴肾小管细胞再生。肾细动脉管壁增厚。实验药物组上述病理改变较轻，仅见基质轻度增多，系膜细胞多为正常，肾小动脉无明显病变，多数可见肾小球形态基本正常者，少数肾小球毛细血管壁有增厚现象，但未见肾小球基底膜断裂，亦未见全部硬化的废弃肾小球，肾小球毛细血管内红细胞未出现凝集现象，间质炎症不明显。

3.3.2u-PA、PAI-1、c-fos、c-jun的变化见表18。

表18大鼠肾组织u-PA、PAI-1和c-fos、c-jun免疫组化染色半定量结果

组别	u-PA	PAI-1	c-fos	c-jun
	u-PA	PAI-1	c-fos	c-jun	(％)	(％)	(％)	(％)
	空白对照组	6.6±1.67	7.2±1.3	14.4±3.51	(％)	(％)	(％)	(％)	6.0±3.08
阴性对照组	空白对照组	6.6±1.67	7.2±1.3	14.4±3.51	14.9±3.6^#	32.8±5.94^#	45.1±6.69^#	44.1±5.19^#	6.0±3.08
阴性对照组	实验药物组	24.2±3.16_# ^★	15.6±3.09_# ^★	15.6±3.41	14.9±3.6^#	32.8±5.94^#	45.1±6.69^#	44.1±5.19^#	14.4±2.07_#

与空白对照组比较#P＜0.05；与阴性对照组比较★P＜0.05。

本实验c-fos、c-jun免疫组化染色半定量结果大体为：阴性对照组＞实验药物组＞空白对照组，阴性对照组阳性染色主要分布在肾小球系膜细胞脑浆及部分毛纫血管壁，实验药物组上述病变程度与阴性对照组相比有明显差异(P＜0.05)。

本实验结果表明牛蒡子提取物可促进糖尿病大鼠肾组织u-PA的表达，减轻肾组织PAI-1的表达，对减轻细胞外基质有一定的作用。

综合本实验研究结果，牛蒡子提取物可有效降低糖尿病大鼠的肾重/体重比，减少其尿微量白蛋白及24小时尿蛋白、内生肌酐清除率，减少尿蛋白的排泄率，说明它可能通过减轻DN大鼠肾脏的高滤过、高灌注，从而保护肾功能。

实施例9

将本发明所述的牛蒡子提取物用于进行小鼠的急性毒性试验，得小鼠的口服半数致死率LD₅₀为140.7g生药/kg。远远高于前述试验有效剂量，表明该牛蒡子提取物毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。

方法：昆明种小鼠，SPF级，6-8周龄，18-22g。适应性饲养观察2天后，禁食不禁水过夜，次日称重、编号，给药组分为5个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。以“不等浓度等容积”的原则给药，各组小鼠按等比级数1∶0.85分别灌胃给予受试药物32ml/kg。以后常规饲养，连续观察7天动物的毛色、自发活动、饮食、体重等，记录死亡症状和时间，7天后处死动物，解剖观察小鼠各组织、脏器有无异常变化。

表19小鼠死亡率

剂量(g浸膏/kg)	雄性	雌性	总死亡率
剂量(g浸膏/kg)	雄性	雌性	总死亡率	9.768.307.055.995.09	5/53/52/52/50/5	5/53/52/51/50/5	100％60％40％30％0％

注：表内为“死亡数/动物数”。

表20药物对雄性小鼠体重的影响(X±s，g)

剂量(g浸膏/kg)	第1天	第7天
剂量(g浸膏/kg)	第1天	第7天	9.76	19.2±0.74(5)

8.307.055.995.09

20.5±1.01(5)19.2±0.81(5)19.8±1.27(5)20.7±1.55(5)

33.4±1.27(2)31.7±1.08(3)33.9±0.85(3)31.9±1.27(5)

注：“()”内为动物数，下同。

表21药物对雌性小鼠体重的影响(X±s，g)

剂量(g浸膏/kg)	第1天	第7天
剂量(g浸膏/kg)	第1天	第7天	9.768.307.055.995.09	19.1±0.73(5)18.8±0.29(5)20.3±1.26(5)19.9±0.84(5)19.7±1.04(5)	29.1±0.99(2)28.6±1.65(3)31.1±1.81(4)28.5±0.97(5)

表22药物对小鼠耗食量的影响(g/只)

剂量(g浸膏/kg)	第1天	第7天
剂量(g浸膏/kg)	第1天	第7天	8.307.055.995.09	7.50(4)7.50(6)7.14(7)8.50(10)	8.75(4)9.17(6)8.57(7)9.50(10)

结论：牛蒡子提取物的小鼠口服LD₅₀为140.7g生药/kg。LD₅₀的95％可信限为154.3～128.4g生药/kg。LD₅₀的平均可信限为140.7±12.94g生药/kg。

参考实施例4和实施例5，牛蒡子提取物的小鼠LD₅₀远远高于其有效剂量，表明其毒副作用小，在开发制备临床用药方面前景广阔。

Claims

1、一种牛蒡子提取物，其特征在于：该提取物中包括以牛蒡苷元为主的总木脂素类化合物和牛蒡苷，提取物中总木脂素类化合物和牛蒡苷的重量含量占51％～80％(紫外分光光度法测定)，其它成分的重量含量占20％～49％。

2、根据权利要求1所述的一种牛蒡子提取物，其特征在于：所述的提取物中，牛蒡苷元的重量含量占3％～40％(高效液相色谱法测定)，牛蒡苷的重量含量占8％～60％(高效液相色谱法测定)，牛蒡苷和牛蒡苷元两者的总重量含量占45％～75％，其余木脂素类化合物的重量含量占6％～35％(紫外分光光度法测定)。

3、根据权利要求1所述的一种牛蒡子提取物，其特征在于：所述的其它成分包括有机酸类化合物、不饱和烃类化合物、β-谷甾醇和胡萝卜苷。

4、一种牛蒡子提取物的制备方法，其特征在于：取牛蒡子药材，粉碎成粗粉，加6～10倍重量50％～95％乙醇，回流提取2～3次，每次3～6h，过滤，合并滤液，减压浓缩至浓缩浸膏无醇味；所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，将其下层干浸膏混悬于水中，以乙酸乙酯萃取至萃取液无色；将萃取液减压浓缩成干浸膏，60℃下真空干燥，得含水量小于重量5％、收率为重量8％～20％的牛蒡子提取物。

5、一种牛蒡子提取物的应用，其特征在于：该牛蒡子提取物应用于制备降血糖和抗糖尿病肾病药物。