CN1569867A - 山茱萸提取物莫诺苷的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

山茱萸提取物莫诺苷的制备方法和用途，其制备方法包括山茱萸药材用乙醇提取，提取液减压浓缩，浓缩液加水沉淀，上清液用大孔吸附树脂或活性炭进行柱层析，除去杂质，乙醇梯度洗脱，洗脱液减压浓缩并干燥，经反相硅胶分离得到山茱萸提取物莫诺苷，其医药新用途为在制备防治糖尿病血管病变药物中的应用。

Description

山茱萸提取物莫诺苷的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种山茱萸提取物——单体化合物莫诺苷的制备方法和用途，属于中药领域。

背景技术

糖尿病是一种慢性全身进行性的内分泌代谢疾病，持续的高血糖会导致一些组织器官代谢异常，继而引起其功能障碍及形态改变。糖尿病病程超过10年，大部分患者合并程度不等的血管并发症，尤其是微血管并发症。糖尿病微血管病变是指微循环障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚，主要包括糖尿病肾病和糖尿病性视网膜病变，严重者可导致尿毒症或失明，给患者造成了巨大的身心痛苦。因此，开发和研制防治糖尿病微血管病变、降低血糖的药物具有重要意义。

山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zu cc.)具有补益肝肾、涩精固脱的作用，是临床常用中药。近年来，国内外学者对山茱萸进行了多方面的研究，由于所分离出的有效成份不同，所以，对山茱萸有效成份的药理作用报导也各不相同。中国专利96109637.7公开了具有免疫抑制作用的山茱萸水煎提取物及其制备工艺。中国专利申请02159502.X公开了具有防治缺血性血管病作用的山茱萸水煎提取物及其制备方法。我国自古就有山茱萸应用于糖尿病(中医称为“消渴症“)治疗的记载。国内外学者对其成分进行了研究，1973年由Tohru Endo等从山茱萸中首次分离得到环烯醚萜苷类单体化合物-莫诺苷(日本《药学杂志》Vol.93，P30～32)，其分子式为C₁₇H₂₆O₁₁，分子量406.38，结构式如下：

文中的方法为甲醇提取后上活性炭柱，经过硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得到莫诺苷。

1992年陈玉武等也从制萸肉中分离得到了莫诺苷(中日友好医院学报，Vol.6，P231～234)。文中的方法为水提取后上大孔吸附树脂柱，经过硅胶柱层析，得到莫诺苷。

但是，迄今为止，尚未见有山茱萸提取物-莫诺苷用于制药用途的制备方法和防治糖尿病血管病变的报导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种山茱萸提取物莫诺苷的制备方法，以及该提取物的医药新用途。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下。

本发明所述的山茱萸提取物莫诺苷是通过下述方法获得的：山茱萸药材用乙醇提取，提取液减压浓缩，浓缩液加水沉淀，上清液用大孔吸附树脂或活性炭进行柱层析，用水和稀醇洗去杂质，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩并干燥后，经反相硅胶分离得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

上述制备方法中所说的反相硅胶分离可以分为两种具体方法，第一种是用反相硅胶柱进行层析，用乙醇溶液梯度洗脱，经薄层检测合并相同流份，减压干燥后得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷；第二种是经制备型高效液相制备，以C₁₈为填料的色谱柱，以甲醇-水或乙腈-水为流动相，在莫诺苷相对应的保留时间处收集流出液，减压浓缩干燥即得粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

上述制备方法的条件范围为：乙醇提取浓度为10～95％，大孔树脂或活性炭柱层析乙醇洗脱液浓度为20～70％，反相硅胶柱层析乙醇梯度洗脱液浓度为20～70％，流动相甲醇-水或乙腈-水的百分比浓度为10％～60％。

上述制备方法的优选条件范围为：乙醇提取浓度为60％～90％，大孔树脂或活性炭柱层析乙醇洗脱液浓度为30～50％，反相硅胶柱层析乙醇梯度洗脱液浓度为30～50％，流动相甲醇-水或乙腈-水的百分比浓度为20％～40％。

在上述制备方法中，用乙醇提取可以采用回流法、浸渍法和渗漉法提取。

本发明所说的山茱萸是山茱萸属植物山茱萸Cornus officinalisSieb et Zucc.的成熟果肉，包括生药和炮制品。

本发明山茱萸提取物莫诺苷，经与文献对照其结构确认数据吻合。本发明还对提取物莫诺苷进行了薄层鉴别和含量测定。

(1)本发明单体化合物的薄层鉴别条件如下：

薄层板：硅胶G板，展开剂：氯仿-甲醇(7∶3)，显色剂：喷10％硫酸-乙醇后于105℃烘10分钟，于日光下检测莫诺苷显淡红色斑点。

(2)本发明单体化合物应用高效液相仪进行了定量分析，其含量测定条件如下：

色谱柱：Phenomenex^Luna 5μmC₁₈，250×4.60mm，流动相：甲醇-水或乙腈-水，流速：1ml/min，检测波长：240nm，柱温：28℃。

经高效液相色谱仪分析，面积归一化法计算，本发明提取物莫诺苷的纯度为95.81％。

本发明山茱萸提取物莫诺苷的用途为在制备防治糖尿病血管病变药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

1.本发明的制备方法可直接得到单体化合物莫诺苷，无需衍生化处理进行结晶。

2.本发明的制备方法简便可行，得到的莫诺苷纯度较高，可达95％以上。

3.本发明建立了莫诺苷含量的高效液相测定方法，该方法简便可行，重现性好。

4.经实验证明，本发明山茱萸提取物莫诺苷在防治糖尿病血管并发症方面有确切的疗效，特别是用于治疗糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变等糖尿病微血管病变。所说的糖尿病微血管病变是指微循环障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚等，表现为结节性肾小球硬化型病变，弥漫性肾小球硬化型病变，肾小球基底膜增厚，蛋白排泄率增高；视网膜微血管瘤，出血，硬性渗出或棉絮状渗出。

5.本发明提取物能显著降低血清蛋白质糖基化终产物-肽(AGE-P)水平；降低尿微量白蛋白的排除量；降低血清早期蛋白质非酶糖化产物-果糖胺的生成量；改善糖尿病血管并发症引起的血管内皮和肾组织形态学病理改变；抑制肾皮质AGEs的形成，使其受体mRNA表达水平下降，具有减轻糖尿病肾病变的作用；显著降低糖尿病大鼠视网膜毛细血管的内周比，对实验性糖尿病视网膜病变具有一定的防治作用；显著增加血清SOD的含量，对由糖尿病血管并发症引起的氧化应激损伤具有保护作用；显著升高糖尿病血管并发症大鼠血清NO、NOS的含量，并降低血浆ET含量，部分恢复NO和ET的动态平衡，减轻高糖致内皮细胞增殖的延迟反应，并能减轻其损伤，具有保护血管内皮细胞的作用；显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α的含量，有利于控制糖尿病血管并发症的发生和发展。

实验例1.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠血清、血清

        糖基化终产物-肽(AGE-P)水平的影响

实验目的：观察本发明提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠血清糖基化终产物-肽(AGE-P)水平的影响。

实验方法：取雄性SD大鼠，180～220g，在正常进食条件下，大鼠先以30mg.kg^-1 ip.STZ溶液，第二天再按0.11ml/只ip.弗氏完全佐剂(FCA)，每周1次，连续3周。3周后取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg^-1)和莫诺苷组(0.15g.kg^-1)，同期另设一正常组(生理盐水10ml/kg，ig.)，各组连续ig.12周。给药12周后大鼠眼眶取血，分离血清后运用流动注射分析技术检测AGE-P水平。

实验结果：造模12周的糖尿病血管并发症大鼠血清AGE-P水平较正常组显著升高，而本发明提取物组及氨基胍组均能显著降低血清AGE-P水平(P＜0.01)，见表1。

                 表1  本发明提取物对大鼠血糖及血清AGE-P水平的影响( X±S)

                  剂量           动物数         血糖(mmol/L)                  AGE-P

组  别

                  (g.kg-1)       (只)      药前             药后              (mg.L-1)

正常组            -              8         4.9±0.5         4.9±0.5          2.8±0.4^##

模型组            -              8         20.7±2.6^##     19.8±2.3^##     14.3±3.9^##

氨基胍组          0.1            8         20.6±2.3^##     17.7±1.5^##      9.1±0.9^##**

本发明提取物组    0.15           8         20.1±1.8^##     18.7±2.8^##      8.9±1.2^##**

        ^**p＜0.01与模型组比较；##p＜0.01与正常组比较

本实验结果表明莫诺苷组能显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠血清AGE-P含量的作用(p＜0.01与模型组比较)，提示本发明提取物莫诺苷具有较好的治疗糖尿病血管并发症的作用。

实验例2.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠血清果糖胺

          及尿微量白蛋白等的影响

实验目的：观察本发明提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠的作用

实验方法：取雄性SD大鼠，体重为180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg^-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg^-1，ig.)、本发明提取物组(0.15g kg^-1，ig.)。同期另设一组正常对照组(生理盐水10ml/kg，ig.)。各组连续灌胃12周。于给药后第6、12周，分别测定大鼠血清果糖胺、尿微量白蛋白等，动态观察糖尿病血管并发症大鼠的演变及本发明提取物的防治作用。

实验结果：本发明提取物组能显著减少果糖胺及尿微量白蛋白(与模型组比较，P＜0.05，0.01)，结果见表2。

     表2  本发明提取物对糖尿病血管并发症大鼠血清果糖胺及尿微量白蛋白等的影响( X±S)

组  别            剂量            动物数            血清果糖胺(mM)                     尿微量白蛋白(mg.24h^-1)

                  (g.kg^-1)       (只)            6w             12w                 6w                    12w

正常组            -               8               1.77±0.21     1.76±0.22          0.1±0.1              0.1±0.1

模型组            -               8               2.30±0.23^##  2.45±0.24^##       8.4±4.2^##           6.9±3.7^##

氨基胍组          0.1             8               1.69±0.37^**  1.95±1.45^**       3.4±3.2^*            2.5±1.2^**

本发明提取

                  0.15            8               1.81±0.36^**  1.89±0.45^**       2.7±1.1^**           2.7±1.5^**

物组

      ##P＜0.01与正常组比较；^*P＜0.05  ^**P＜0.01与模型组比较

本实验表明本发明提取物组能显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠果糖胺及尿微量白蛋白的形成(与模型组比较，P＜0.05，0.01)，提示本发明提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症具有一定的保护作用。

实验例3.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠肾皮质

        AGEs及其受体(RAGE)mRNA表达的影响

实验目的：探讨本发明提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠肾皮质AGEs的抑制作用，及在分子水平上探讨其对肾皮质内AGEs受体(RAGE)mRNA转录水平的影响。

实验方法：取雄性SD大鼠，体重为180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg^-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg^-1，ig.)、莫诺苷组(0.15g kg^-1，ig.)。同期另设一组正常对照组(生理盐水10ml/kg，ig.)。各组连续灌胃12周。实验结束后取右肾皮质，根据AGEs具有产生荧光的特点，通过测定其荧光强度，间接表示肾皮质内AGEs的含量；用RT-PCR半定量的方法，体外扩增目的基因RAGE，并以β-action(house-keeping gene)作为内参，根据两者结合的EB光密度积分的比值进行组间比较肾皮质内RAGE mRNA的表达情况。

实验结果：模型组AGEs沉积显著增加，RAGE表达明显上调。而莫诺苷在减少AGEs在肾皮质过度沉积的同时，亦能显著抑制RAGE的过高表达。表明其具有减轻糖尿病肾病变的作用。结果见表3。

          表3    本发明提取物对模型大鼠肾皮质AGEs及RAGE的影响( X±S)

                  剂量            动物数            AGEs

组别                                                                   RAGE

                  (g.kg^-1)       (只)              (AU/mg羟脯氨酸)

正常组            -               10                13.8±4.6          0.56±0.19

模型组            -               8                 44.3±14.5^##      2.75±1.28^##

氨基胍组          0.1             9                 22.8±4.2^**       1.23±0.39^**

本发明提取物组    0.15            8                 21.4±6.2^**       1.11±0.37^**

^##p＜0.01与正常组比较；^**p＜0.01与模型组比较。

本实验表明本发明提取物莫诺苷在减少AGEs在肾皮质过度沉积的同时，亦能显著抑制RAGE的过高表达，表明其具有减轻糖尿病肾病变的作用。

实验例4.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病大鼠视网膜病变的影响

实验目的：观察本发明提取物莫诺苷对由STZ诱导的糖尿病视网膜病变的防治作用。

实验方法：取雄性SD大鼠，体重为180-220g，禁食12h后一次性腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mgkg^-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mmol/L者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组(生理盐水10ml/kg，ig.)、氨基胍组(0.1g.kg^-1，ig.)、莫诺苷组(0.15g kg^-1，ig.)。同期另设一组正常组(生理盐水10ml/kg，ig.)。各组连续灌胃12周。12周后，处死大鼠后立即取出眼球固定于4％甲醛溶液中24～48小时。沿赤道部切开眼球，去除前节及玻璃体，余下眼球分为6等分，小心剥离视网膜，流水冲洗24小时后，用3％胰酶(用PH7.4的Tris缓冲液配制)消化3～4小时，取出置蒸馏水中轻冲摇，分离出血管网，铺于载波片上自然吹干。PAS加苏木精染色，光镜观察。每张铺片随机取7个视野，于400倍下计数内皮细胞(EC)与周细胞(PC)数目及其灰度面积，并计算两者的比值(E/P值)，同时观察新生血管形成情况。

实验结果：模型组视网膜毛细血管内皮细胞数及其灰度面积均明显高于正常大鼠，而周细胞数目则明显减少，本发明提取物及阳性对照物氨基胍均能显著降低糖尿病大鼠视网膜毛细血管的内周比(P＜0.01)，表明莫诺苷对实验性糖尿病视网膜病变具有一定的防治作用。结果见表4。

                    表4  本发明提取物对糖尿病大鼠视网膜病变的影响( X±S)

组别        剂量        动物数

                                        EC          PC                      Ec area        Pc area

            (g.kg^-1     (只)                                    E/P                                      E/P area

                                        (n/view)    (n/view)                (um2)          (um2)

            )

            -           8               21          27          0.80        79.9           82.8          1.08

正常组

                                        ±5         ±6         ±0.22      ±24.2         ±29.4        ±0.44

            -           9               32          12          2.94        135.0          85.1          1.77

模型组

                                        ±6##       ±5##       ±1.07##    ±47.6##       ±39.4        ±0.71#

本发明提                10              23          11          1.68        88.8           55.8          1.68

            0.15

取物组                                  ±7^**      ±4         ±0.53^**   ±24.2^**      ±14.7^*      ±0.54

            0.1         10              27          15          1.92        100.2          65.9          1.59

氨基胍组

                                        ±6         ±5         ±0.29^**   ±20.1^*       ±23.3        ±0.27

^##P＜0.01  与正常组比较；^*P＜0.05  ^**P＜0.01与模型组比较

本实验表明本发明提取物莫诺苷能显著降低糖尿病大鼠视网膜毛细血管的内周比，表明其对实验性糖尿病视网膜病变具有一定的防治作用。

实验例5.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠胸主动脉

        血管内皮及肾组织形态学的影响

实验目的：从形态学的角度探讨本发明提取物莫诺苷是否具有防治糖尿病血管并发症的作用。

实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg^-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg^-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg^-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周。实验结束后用扫描电镜的方法观察胸主动脉血管内皮通透性。内皮细胞的形态改变以及白细胞等在动脉壁内皮粘附等病理改变：本文选用光镜并经相应染色(如HE及PAS)。观察肾小球的形态变化如基底膜增厚、糖原沉积、毛细血管扩张等：用透射电镜观察肾小球基底膜等结构的改变。

实验结果：模型组各样本在形态学上呈观明显的病理改变，如血管内皮细胞肿胀，细胞排列紊乱并向血管腔突起，内皮表面凹凸不平，相邻细胞间有明显的缝隙存在以致内皮通透性增高：细胞表面粗糙，有很多红细胞、细胞粘咐其表面：肾小球体积明显缩小并伴有弥漫性系膜增生，肾小球基底膜由正常圈襻状挤压成髓纹状并增厚，球体毛细血管闭塞，而球囊相对扩大。肾小管有明显空泡透明变性(AE变性)。肾间质中小动脉、入球细动脉玻变、增厚，血管内皮细胞肿胀并呈立方状凸入管腔。而本发明提取物组上述病变明显减轻，表现出较好的血管内皮保护作用及抗肾小球内基质增生、基底膜增厚等作用。表明本发明提取物莫诺苷具有对糖尿病大鼠形态学病理改变的改善作用，我们推断本发明提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症所引起的结构和功能改变都具有一定的防治作用。

实验例6.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症模型大鼠血清

        SOD的影响

实验目的：通过对血清SOD值的变化分析，初步探讨出SFZ诱导的糖尿病血管并发症大鼠模型的氧化应激观象，以及本发明提取物莫诺苷的保护作用。

实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg^-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg^-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg^-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周。试验结束后用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD的含量。

  表5    本发明提取物对模型大鼠血清SOD的含量的影响( X±S)

                剂量                动物数

组别                                            SOD(活性/U.mL^-1)

                (g.kg^-1)           (只)

正常组          -                   10          50.5±5.0

模型组          -                   8           38.9±4.5^##

氨基胍组        0.1                 9           48.8±5.2^**

本发明提取物    0.15                8           43.7±3.9^*

^##p＜0.01与正常组比较；^*p＜0.05  ^**p＜0.01与模型组比较。

实验结果：造模12周后，糖尿病血管并发症模型大鼠血清SOD值较正常组显著降低；而本发明提取物莫诺苷及氨基胍均能显著增加SOD的含量。本实验表明本发明提取物莫诺苷对由糖尿病血管并发症引起的氧化应激损伤具有保护作用。

实验例7.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠NO、NOS

        和ET的影响

实验目的：探讨环山茱萸提取物莫诺苷对NO、NOS、ET的影响，以了解其对糖尿病血管并发症大鼠的作用及作用机理。

实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg^-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg^-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg^-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周。实验结束后取血，测定大鼠血清NO、NOS和血浆ET。

    表6    本发明提取物对模型大鼠血清NO、NOS和血浆ET的影响( X±S)

                剂量

                                动物数

组别            (g.kg^-1                           NO/μmol.L^-1       NOS/U.mL^-1       ET/pg.mL^-1

                                (只)

                )

正常组          -               10                68.55±7.44         0.66±0.08        64.55±17.12

模型组          -               8                 42.13±7.46^##      0.39±0.06^##     132.15±33.77^##

氨基胍组        0.1             9                 63.55±8.12^**      0.54±0.12^*      78.45±18.34^**

本发明提取物    0.15            8                 57.88±9.78^**      0.54±0.11^*      77.11±20.56^**

^##p＜0.01与正常组比较；^*p＜0.05，^**p＜0.01与模型组比较。

实验结果：模型组与正常组比较，NO、NOS含量显著降低(P＜0.01，p＜0.05)，ET含量显著升高(P＜0.01)：而本发明提取物组与氨基胍组均能显著升高糖尿病血管并发症大鼠血清NO、NOS的含量，并降低血浆ET含量。本实验表明本发明提取物可部分恢复NO和ET的动态平衡，保护血管内皮细胞，对糖尿病血管并发症具有改善作用。

实验例8.山茱萸提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠sICAM-

1、TNF-α的影响

实验目的：探讨本发明提取物莫诺苷对糖尿病血管并发症大鼠血清可溶性细胞间粘附分子(slCAM-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响，分析本发明提取物防治糖尿病血管；并发症的作用及其作用机理。

实验方法：腹腔注射STZ(链脲佐菌素)60mg.kg^-1。1周后禁食6h，取尾静脉血用血糖仪测血糖值，若血糖值≥16.7mM者则纳入为糖尿病大鼠。按血糖值范围随机分为模型组、氨基胍组(0.1g.kg^-1，ig.)、本发明提取物(0.15g kg^-1，ig.)。同期另设一组正常对照组。各组连续灌胃12周后，取血清用相应的EIA Kit分别测定slCAM-1、TNF-α的含量。

    表7  本发明提取物对模型大鼠血清slCAM-1、TNF-α的影响( X±S)

                剂量

                                动物数

组别            (g.kg^-1                        slAM-1(pg.ml^-1)           TNF-α(pg.ml^-1)

                                (只)

                )

正常组          -               10            0.35±0.07                 5.5±1.2

模型组          -               8             0.82±0.07^##              9.7±2.5^##

氨基胍组        0.1             9             0.45±0.12^**              5.8±2.7^**

本发明提取物    0.15            8             0.49±0.09^**              6.2±2.6^**

^##p＜0.01与正常组比较；^**p＜0.01与模型组比较。

实验结果：糖尿病血管并发症模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α较正常组上调，而本发明提取物莫诺苷及氨基胍均能显著降低糖尿病血管并发症模型大鼠血清sICAM-1、TNF-α的含量。这一作用可能有利于控制糖尿病血管并发症的发生和发展。

实验例9.山茱萸提取物莫诺苷对高糖致人脐静脉内皮细胞

        (HUVEC)损伤的保护作用

实验目的：观察山茱萸提取物莫诺苷对高糖致内皮细胞增殖抑制的保护作用。

实验方法：体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，用含或不含葡萄糖的20％FCS RPMI-1640培养液配制10^-4～10^-7M不同浓度的药液。同时设对照(1)20％FCS RPMI-1640培养液；(2)含30mM葡萄糖的20％FCS RPMI-1640培养液；(3)含30mM甘露醇的20％FCS RPMI-1640培养液；37℃、5％CO₂饱和湿度培养48h后，采用MTT法来考察HUVEC的增殖情况。

实验结果：30mM葡萄糖中HUVEC的吸收度值减少，与正常RPMI-1640比较，具有显著性差异(P＜0.01)，表明30mM葡萄糖能减少HUVEC线粒体MTT代谢产物formazan的形成量，抑制HUVEC的增殖反应。而30mM甘露醇则对HUVEC的增殖基本无明显影响。在RPMI-1640培养液中加入莫诺苷，对HUVEC未见有明显影响，表明莫诺苷在10^-4M浓度以下，对细胞基本无毒性。而30mM葡萄糖环境中加入莫诺苷，其表现为能对抗高浓度葡萄糖对HUVEC的抑制反应，且呈浓度依赖型。本实验表明本发明提取物莫诺苷能保护高浓度葡萄糖对HUVEC增殖的抑制反应。结果见表8。

    表8  莫诺苷在高浓度葡萄糖环境下对HUVEC增殖的抑制反应

组别                            浓度(M)            A吸收度

RPMI-1640                       -                  0.216±0.019

RPMI-1640+莫诺苷                1×10^-4           0.215±0.013

                                1×10^-5           0.208±0.016

RPMI-1640+30mM葡萄糖            -                  0.149±0.003^##

RPMI-1640+30mM甘露醇            -                  0.192±0.007

RPMI-1640+30mM葡萄糖+莫诺苷     1×10^-4           0.187±0.008^**

                                1×10^-5           0.173±0.010^*

                                1×10^-6           0.158±0.012

                                1×10^-7           0.145±0.009

RPMI-1640+30mM葡萄糖+氨基胍     1×10^-4           0.183±0.010^**

                                1×10^-5            0.178±0.011^*

                                1×10^-6            0.154±0.006

                                1×10^-7            0.144±0.013

^*p＜0.05  ^**p＜0.01与RPMI-1640+30mM葡萄糖组比较；##p＜0.01，与RPMI-1640组比较。

实验例10.山茱萸提取物莫诺苷对高糖环境下人脐静脉内皮细胞

         (HUVEC)的形态学的影响

实验目的：观察山茱萸提取物莫诺苷对高糖环境下HUVEC形态学的影响。

实验方法：用含高浓度葡萄糖的20％FCS RPMI-1640培养液配制莫诺苷和氨基胍，使葡萄糖终浓度30mM，药物浓度1×10^-4M。同时设对照(1)20％FCS RPMI-1640培养液；(2)含30mM葡萄糖的20％FCS RPMI-1640培养液。HUVEC培养48h后，加混和荧光染液(AO∶EB＝1∶1)进行染色，进行显微形态学观察。

实验结果：形态学显示：正常细胞为鹅卵石状，细胞核染为绿色，细胞质为黄绿色，细胞膜表面光滑；30mM葡萄糖作用下细胞形态大多呈星状结构，细胞核固缩，细胞质染色偏红，细胞膜界线模糊不清，并在镜下也观察到细胞数量明显减少；在系统中加入莫诺苷后，细胞形态接近于正常细胞，且细胞数量明显增多。

结论：本发明提取物莫诺苷可对抗高浓度葡萄糖延迟HUVEC的增殖和损伤反应。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实施例。

实施例1

山茱萸药材1000g用60％乙醇回流提取，提取3次，加醇量为药材重量的15倍，提取时间120分钟。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加4倍量水沉淀后离心，上清液用活性炭进行柱层析，用水和5％的乙醇洗去杂质，再用50～70％乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥后进行反相硅胶柱层析，用30％～60％乙醇溶液梯度洗脱，经薄层检测合并相同流份，将40％～60％乙醇溶液的洗脱液减压干燥，得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

实施例2

山茱萸药材1000g用80％乙醇回流提取，提取3次，加醇量为药材重量的12倍，提取时间150分钟。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加5倍量水沉淀后离心，上清液用大孔吸附树脂进行柱层析，用水和10％的乙醇洗去杂质，再用30～50％乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥后进行反相硅胶柱层析，用20％～50％乙醇溶液梯度洗脱，经薄层检测合并相同流份，将30％～50％乙醇溶液的洗脱液减压干燥，得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

实施例3

山茱萸药材1000g粉碎后过40目筛，用40％乙醇浸渍36小时后渗漉提取，流速4～5毫升/分钟，渗漉量为药材重量的10倍。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加4倍量水沉淀后离心，上清液用大孔吸附树脂进行柱层析，用水和5％的乙醇洗去杂质，再用30～50％乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥后进行反相硅胶柱层析，用20～50％的乙醇溶液梯度洗脱，经薄层检测合并相同流份，将30％～50％乙醇溶液的洗脱液减压干燥，得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

实施例4

山茱萸药材1000g粉碎后过40目筛，用20％乙醇浸渍36小时后渗漉提取，流速4～5毫升/分钟，渗漉量为药材重量的12倍。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液加6倍量水沉淀后离心，上清液用活性炭进行柱层析，用水和10％的乙醇洗去杂质，再用50～70％乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥后进行反相硅胶柱层析，用30％～60％乙醇水溶液梯度洗脱，经薄层检测合并相同流份，将40％～60％乙醇溶液的洗脱液减压干燥，得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

实施例5

山茱萸药材1000g用70％的乙醇回流提取，提取3次，加醇量为药材重量的15倍，提取时间120分钟。减压回收乙醇，浓缩液加水沉淀，离心，取上清液用大孔吸附树脂进行柱层析，用去离子水和5％的乙醇洗去杂质，再用30～50％的乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液减压干燥后经高效液相制备，以C₁₈为填料的色谱柱，以30％甲醇水溶液为流动相，在莫诺苷相对应的保留时间处收集流出液，减压浓缩干燥即得粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

实施例6

山茱萸药材1000g粉碎后过40目筛，用50％乙醇浸渍36小时后渗漉提取，流速4～5毫升/分钟，渗漉量为药材重量的12倍。合并提取液，减压回收乙醇，浓缩液加水沉淀，离心，取上清液用活性炭进行柱层析，用去离子水和10％的乙醇洗去杂质，再用50～70％的乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液减压干燥后经高效液相制备，以C₁₈为填料的色谱柱，以20％乙腈水溶液为流动相，在莫诺苷相对应的保留时间处收集流出液，减压浓缩干燥即得粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

实施例7

山茱萸药材1000g粉碎后过40目筛，用70％乙醇浸渍36小时后渗漉提取，流速4～5毫升/分钟，渗漉量为药材重量的12倍。合并提取液，减压回收乙醇，浓缩液加水沉淀，离心，取上清液用大孔树脂进行柱层析，用去离子水和5％的乙醇洗去杂质，再用30～50％的乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液减压干燥后经高效液相制备，以C₁₈为填料的色谱柱，以40％甲醇水溶液为流动相，在莫诺苷相对应的保留时间处收集流出液，减压浓缩干燥即得粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

实施例8

山茱萸药材1000g用60％的乙醇回流提取，提取3次，加醇量为药材重量的15倍，提取时间120分钟。减压回收乙醇，浓缩液加水沉淀，离心，取上清液用活性炭进行柱层析，用去离子水和5％的乙醇洗去杂质，再用50～70％的乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液减压干燥后经高效液相制备，以C₁₈为填料的色谱柱，以60％乙腈水溶液为流动相，在莫诺苷相对应的保留时间处收集流出液，减压浓缩干燥即得粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

Claims (12)

1.山茱萸提取物莫诺苷的制备方法，其特征是包括下列步骤：山茱萸药材用乙醇提取，减压浓缩，浓缩液加水沉淀，上清液用大孔吸附树脂或活性炭进行柱层析，用水和稀醇洗去杂质，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩并干燥后，经反相硅胶分离得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所说的反相硅胶分离是用反相硅胶柱进行层析，用乙醇梯度洗脱，经薄层检测合并相同流份，减压干燥后得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所说的反相硅胶分离是经制备型高效液相制备，以C₁₈为填料的色谱柱，以甲醇—水或乙腈—水为流动相，在莫诺苷相对应的保留时间处收集流出液，减压浓缩干燥即得粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

4.根据权利要求1或2或3所述的制备方法，其特征是所说的乙醇提取浓度为10～95％，大孔树脂或活性炭柱层析乙醇洗脱液浓度为20～70％，反相硅胶柱层析乙醇梯度洗脱液浓度为20～70％，流动相甲醇—水或乙腈—水的百分比浓度为10％～60％。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所说的醇提取浓度为60％～90％，大孔树脂或活性炭柱层析乙醇洗脱液浓度为30～50％，反相硅胶柱层析乙醇梯度洗脱液浓度为30～50％，流动相甲醇—水或乙腈—水的百分比浓度为20％～40％。。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是用乙醇提取采用回流法提取。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是用乙醇提取采用浸渍法提取。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是用乙醇提取采用渗漉法提取。

9.山茱萸提取物莫诺苷在制备防治糖尿病血管病变药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的山茱萸提取物莫诺苷在制备药物中的应用，其特征是所说的糖尿病血管病变包括糖尿病微血管病变。

11.根据权利要求10所述的山茱萸提取物莫诺苷在制备药物中的应用，其特征是所说的糖尿病微血管病变包括糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变。

12.根据权利要求9所述的山茱萸提取物莫诺苷在制备药物中的应用，其特征是所说的糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变是指微循环障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚，表现为结节性肾小球硬化型病变，弥漫性肾小球硬化型病变，肾小球基底膜增厚，蛋白排泄率增高；视网膜微血管瘤，出血，硬性渗出或棉絮状渗出。