CN1569884A - 黄芪甲苷的制法及在制备防治糖尿病肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄芪甲苷的制备方法及其在制药中的新用途。它的制备方法是将黄芪粉末用乙醇回流，用回流液减压浓缩，在浓缩液中加NaoH，醇液回流，蒸去乙醇得乙醇水解液，用乙酸乙酯萃取，用正丁醇饱和水洗至中性，蒸干得粗皂苷，加入乙酸乙酯后于水浴中搅拌、放冷、过滤、沉淀、得较纯的皂苷，再用甲醇重结晶得到黄芪甲苷。它具有显著降低血糖、糖化血红蛋白和尿蛋白的作用，可降低肾皮质和血清中的AGE_s，显示黄芪甲苷具有抗氧化作用，并对醛糖还原酶有抑制作用，还有抑制系膜细胞增生、减轻肾脏肥大的作用。在黄芪甲苷中加入适当辅料，可制成口服制剂，它用于预防和治疗糖尿病肾病。

Description

黄芪甲苷的制法及在制备防治糖尿病肾病药物中的应用

一、技术领域

本发明涉及黄芪甲苷(ASI)的制备方法和新用途，特别是涉及黄芪甲苷的制备方法及其在制备预防和治疗糖尿病肾病的药物中的应用。

二、背景技术

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是指糖尿病特发性全身微血管病变的肾脏表现，是糖尿病最常见的并发症，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。流行病学调查发现我国糖尿病的标化患病率为3.2％，也就是说目前我国有5000万人以上正面临着糖尿病的威胁，在我国93％的糖尿病患者是2型糖尿病，其中40％将发展为DN^[1]。可以预见，随着我国人民生活水平的迅速提高和人均寿命的延长，21世纪我国糖尿病的患病率将不断上升，由DN发展而来的终末期肾功能衰竭的发生比例也将显著提高。因此，DN正在成为本世纪全世界医药界的重要研究课题之一。

黄芪具补气固表，利尿脱毒，敛疮生肌之功效，为历代常用补益中药，始载于《神农本草经》，并列为上品，在祖国医药中常作为君药。现代基础医学研究发现黄芪药理作用甚广，对黄芪粗制剂的临床研究也日益深入。据不完全统计，自1997年以来临床上以黄芪复方制剂、黄芪注射液等治疗DN和慢性肾炎的报道甚多。黄芪制剂对肾病患者具有减少尿蛋白、降低血糖、改善血液流变学等作用。因此，人们对黄芪与DN有关的疗效及作用机制的表现出极大的关注和兴趣，并对其有效成分进行了有益的探索。

黄芪甲苷是从中药黄芪提取出来的有效单体化合物。南京医科大学黄芪课题组于1982年开始首次并相继报导了黄芪甲苷(ASI)的以下药理作用，①ASI有抗生物氧化如SOD活性增加，MDA含量下降，GSH含量增加等；抗炎如降低组胺，5-HT，所致的毛细血管通透性，角叉菜胶所致的足爪肿胀，稳定红细胞膜等作用；②ASI能促进B细胞增殖分化和浆细胞抗体合成，对人外周血自然殺伤活性有明显的增强作用，提高巨噬细胞吞噬指数，使其诱生干扰素，超微结构也有不同程度的改善。ASI有促进霍乱弧菌LPS诱生干扰素，此外ASI能对抗环磷酰胺，⁶⁰CO-γ射线所致的白细胞减少，对抗氢化考的松所致的淋巴细胞减少；③ASI对抗D-半乳糖胺，醋氨酚，CCL₄引起的肝损伤；④ASI对中枢有镇静，安定作用；⑤ASI有对抗高温，耐低温，耐缺氧和增强游泳能力等，说明ASI能提高机体对有害因子的抵抗力；此外ASI尚有增加蛋白质合成，促进肝细胞再生及增加血浆内cAMP，抗血小板聚集，降压等作用。本课题组的研究成果和其它相关研究提示，ASI是一个很有希望的生物反应调节剂.黄芪甲苷的药理活性越来越受到人们的关注，随后，国内学者报道了黄芪甲苷对心肌的有利影响，ASI促进胰岛素和C肽的分泌、黄芪皂苷对人系膜细胞基质分泌的抑制作用等；已报道黄芪粗制剂具有抑制醛糖还原酶的的作用，至今尚未见报道ASI有防治糖尿病肾病的应用。

三、发明内容

1.发明目的

本发明的目的在于提供黄芪甲苷的制法及其新用途，即在制药中的新应用。

实际上，本发明涉及黄芪甲苷的制法及其在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。

2.技术方案

(1).黄芪甲苷是从黄芪中提取出来的一种单体化合物，其化学结构式如下：

(2).黄芪甲苷的制备方法

膜荚黄芪(Astragalus membranaceus bunge)经粉碎机成粉末，取粉末1.0-2.0kg，用60-95％工业乙醇2000-5000ml浸泡回流提取三次，提取液合并减压浓缩至药材量的1.5∶1，加固体NaOH 5-10g，回流2小时，蒸尽反应物中的乙醇，得乙醇水解液，用50-300ml乙酸乙酯萃取三次，弃去乙酸乙酯液后，所得的水解液用水饱和的正丁醇50-200ml分次萃取六次，合并萃取液，用正丁醇饱和的水洗至中性，得中性正丁醇水解液，将此液蒸干即为粗皂苷。向粗皂苷内加5-10倍乙酸乙酯，于70℃水浴加热，搅拌，放冷，渗去杂质，重复2-3次，过滤，沉淀，弃去乙酸乙酯，即得较纯的皂苷*.上步所得的较纯的皂苷.用甲醇重结晶二次即得黄芪甲苷。

将根据以上方法提取的黄芪甲苷运用红外.核磁共振-质谱等进行分析，并同黄芪甲苷标准品比较，确认以本法提取的黄芪甲苷与黄芪甲苷标准品结构完全相同。以高效液相色谱法确认以本法所提取的黄芪甲苷的纯度达97％以上。

(3)将以上的黄芪甲苷用于药理试验，以观察其对糖尿病肾病的防治作用。

A.ASI对糖尿病肾病DN大鼠血糖和肾功能的影响，实验表明ASI对血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白、BUN、肾脏指数等直接反映DN病程的指标有显著的降低作用，因此，可以认为ASI对DN大鼠具有一定的降血糖和保护肾脏的作用。

B.ASI对DN大鼠的抗氧化作用，实验表明ASI可降低肾皮质和血清中的AGES，且此降低作用呈剂量依赖性关系，而ASI可显著升高T-AOC，GSH、CAT，显示ASI具有抗氧化作用。

C.ASI对醛糖还原酶(AR)的抑制作用，实验结果表明ASI对AR的抑制作用，这对DN的治疗很有益处。

D.ASI对DN大鼠的细胞外基质的作用，实验结果表明ASI具有一定的抑制系膜细胞增生、减轻肾脏肥大的作用。

E.ASI对DN大鼠血清中TGF-β的作用，实验结果表明ASI可以明显地降低TGF-β1的含量，而且随着剂量的加大、ASI降低TGF-β1的作用越来越强，这对DN的治疗具有重要意义。

综上所述，黄芪甲苷对糖尿病肾病具有较强的防治作用。

在黄芪甲苷中加入适当的辅料，用常规的制备方法，可以制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等口服制剂。所述的辅料是常用的助剂，如淀粉、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇等。

3.有益效果

从以上药理试验结果，可以看出本发明具有以下优点：

(1)本发明对已知黄芪甲苷发现了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，

(2)本发明的黄芪甲苷的药理效果好，作用强，预示着有良发的药用前景，

(3)本发明黄芪甲苷具有显著的降低血糖、糖化血红蛋白，尿蛋白、BUN、肾脏指数，因此ASI具有一定的降血糖和保护肾脏的作用。

(4)本发明黄芪甲苷具有降低肾皮质和血清中的AGES，显示ASI具有抗氧化作用。

(5)本发明ASI对醛糖还原酶AR有抑制作用，这对DN的治疗很有益处。

(6)本发明ASI具有一定的抑制系膜细胞增生、减轻肾脏肥大的作用。

(7)本发明ASI具有明显降低TGF-β1的含量，表明对DN的治疗具有重要意义。

四、具体实施方式

实施例1  黄芪甲苷制备方法

膜荚黄芪(Astragalus membranaceus bunge)经粉碎机成粉末，取粉末1.0kg，用95％工业乙醇2500ml浸泡回流提取三次，提取液合并减压浓缩至药材量的1.5∶1，加固体NaOH 5g，回流2小时，蒸尽反应物中的乙醇，得乙醇水解液，用150ml乙酸乙酯萃取三次，弃去乙酸乙酯液后，所得的水解液用水饱和的正丁醇100m1分次萃取六次，合并萃取液，用正丁醇饱和的水洗至中性，得中性正丁醇水解液，将此液蒸干即为粗皂苷。向粗皂苷内加6倍乙酸乙酯，于70℃水浴加热，搅拌，放冷，渗去杂质，重复2次，过滤，沉淀，弃去乙酸乙酯，即得较纯的皂苷，上步所得的较纯的皂苷.用甲醇重结晶2次即得黄芪甲苷。

实施例2  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠血糖和肾脏功能的影响

1  材料和方法

1.1  实验动物  SD品系大鼠8周龄，雄性，体重160～180g。由南京医科大学实验动物中心提供。

1.2  药品与试剂  黄芪甲苷为本课题组自提取，链脲霉素(STZ)购自Calbiochem公司，血糖检测药盒购自浙江东瓯生物工程有限公司，尿白蛋白放免检测药盒购自北京中国原子能科学研究院，epalrestat由江苏扬子江药业集团提供。

1.3  方法

1.3.1  造模与实验治疗

85只大鼠随机分为正常对照组、糖尿病肾病模型组、黄芪甲苷低剂量治疗组、黄芪甲苷中剂量治疗组、黄芪甲苷高剂量治疗组、epalrestat(EPS)阳性药治疗组，共6组，除正常对照组10只以外，其余各组15只。各组禁食12h后，腹腔一次性注射STZ 60mg·kg^-1(临用前溶于0.1mol·L^-1柠檬酸钠缓冲液，pH4.4)，正常对照组仅给等量的该缓冲液。72h后尾静脉取血，测定血糖≥13.88mmol·L^-1者为造模成功。糖尿病肾病成模当日作为实验第1天，低中高黄芪甲苷治疗组的剂量分别为3、6、12mg·kg^-1，均配成混悬液，灌胃给药。实验中观察各组大鼠的体重、进食水量、尿量、毛发等，每周测体重1次。于第8周末处死大鼠，收集尿液，腹主动脉收集血液标本测定除血糖外各项血指标，取出肾脏称重，切片。

1.3.2  指标测定

空腹血糖测定采用葡萄糖氧化酶法；尿白蛋白采用放免法测定由南京医科大学同位素室测定；HbAlC由南京建成生物工程研究所用亲和层析法测定；BUN由南京建成生物工程研究所分别用化学比色法测定；肾脏湿重用电子天平称量。

1.4  统计学处理  所有测定结果用 x±s表示，采用组间t检验进行统计学分析。

2  结果

2.1  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠整体生理状况及体重的影响

正常对照组大鼠精神振奋、活动频繁、毛发纯白光泽、饮水量正常、尿量正常、垫料干燥。糖尿病肾病模型组大鼠精神萎靡、活动度低、耳廓眼球苍白、尾巴苍白湿冷、毛发枯黄、无色泽、竖毛弓背、饮水量高、尿量多、垫料极潮、下腹部及外阴部毛浸湿状。与糖尿病肾病模型组相比，黄芪甲苷高剂量治疗组大鼠的精神、活动、外表、饮水量和尿量等方面在接近于正常对照组大鼠，垫料干燥。黄芪甲苷中剂量治疗组的精神、活动、外观接近于正常组大鼠，而饮水量和尿量仍然较高，垫料较潮。黄芪甲苷低剂量治疗组的精神不振、活动较少、毛发枯黄、无色泽、饮水量和尿量高，垫料潮。EPS阳性治疗组的整体表现则界于黄芪甲苷低剂量治疗组和中剂量治疗组之间。

2.2  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠的改善作用

糖尿病肾病模型组大鼠的血糖、HbAlC、尿白蛋白、肾重/体重与正常对照组相比明显升高，且皆有非常显著性差异(P＜0.01)，表明造模成功。黄芪甲苷低剂量治疗组的以上指标与糖尿病肾病模型组基本相近，无组间的显著性差异；中高剂量治疗组的血糖和肾重/体重较糖尿病肾病模型组有较大幅度的降低，在两组之间有显著性差异(P＜0.05)，尿白蛋白和BUN的降低幅度很大，在两组之间有非常显著性差异(P＜0.01)；高剂量治疗组的HbAlC较糖尿病肾病模型组有较大幅度的降低，在两组之间有非常显著性差异(P＜0.01)。EPS组的HbAlC和尿白蛋白较糖尿病肾病模型组有明显的降低，两组之间有非常显著性差异(P＜0.01)(见表1)。

表1  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠血糖、HbAlC、尿白蛋白、肾重/体重、BUN的作用( x±s)

组别          n        血糖                 HbAlC                尿白蛋白                肾重/体重           BUN

                       (mmol·L^-1)         (％)                 (μg·mol^-1Cr^-1)      (×1000)            (mmol·L^-1)

NS组          10       4.58±0.75           12.31±1.83          3.39±1.93              6.61±0.52          7.73±0.96

DN组          10       18.26±6.98^##       21.20±3.41^##       29.07±9.98^##          11.54±3.85^##      11.16±0.56^##

ASIL组        10       14.83±4.10          20.56±3.49          27.26±2.38             10.33±1.69         11.63±0.65

ASIM组        11       12.62±3.30^*        19.28±5.18          14.87±9.63^**          8.62±1.85^*        7.23±0.89^**

ASIH组        10       10.08±2.69^*        15.32±4.21^*        7.92±5.31^**           8.40±1.61^*        7.65±0.81^**

EPS组         10       17.10±5.62          13.14±3.08^**        6.19±2.40^**           9.72±4.37          10.78±1.81

与正常对照组相比，##P＜0.01；与DN模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例3  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠的抗氧化作用

1  材料和方法

实验动物、药品与试剂、造模与实验治疗皆同实施例1。

1.1  指标测定

1.1.1  肾皮质AGEs含量测定  大鼠处死后，迅速取肾皮质浸泡于生理盐水中，去除结缔组织和脂肪，滤纸吸干后称重，加入6mL PBS(pH7.4)缓冲液，超声匀浆，匀浆液于4℃下4000rpm离心5min后取沉淀，以双蒸水洗涤3次。于沉淀中加入氯仿/甲醇(1∶1)5mL，振荡过夜。再加入甲醇/水(4∶1)2mL 4℃下4000rpm离心5min。沉淀以甲醇5mL洗涤2次，双蒸水洗涤2次，再用pH7.5，0.02mol/L Hepes缓冲液(含0.1mol/LCaCl₂)洗2次。沉淀于5mL Hepes缓冲液中4℃下过夜。离心去除缓冲液，将颗粒悬浮于10mL含290U I型胶原酶的Hepes缓冲液中，加入甲苯和氯仿各2μl。以只含Hepes缓冲液和胶原酶的空白管为标准，374℃振荡24h，将消化液离心，留取上清液。用荧光分光光度法检测AGEs的相对含量，激发波长为370nm，吸收波长为440nm，仪器为岛津RF-5000型荧光分光光度计(SHIMADZU spectrofluorophoto meter RF-5000)。结果以任意荧光单位AUF/mg皮质蛋白表示。

1.1.2  血清AGEs含量测定 大鼠血样离心取血清，以0.02mol/L Hepes缓冲液稀释10倍后，用荧光分光光度法检测AGEs的相对含量，激发波长为370nm，吸收波长为440nm，仪器为岛津RF-5000型荧光分光光度计(SHIMADZU spectrofluorophoto meter RF-5000)。结果以任意荧光单位AUF/mg血清蛋白表示。

1.1.3  血清中总抗氧能力(total antioxidative capability，T-AOC)、CAT活力(activity ofcatalase)、GSH含量分别用由南京建成生物工程研究所分别用化学比色法测定。

1.2  统计学处理  所有测定结果用 x±s表示，采用组间t检验进行统计学分析。

2  结果

2.1  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠皮质AGEs和血清AGEs的影响

糖尿病肾病模型组大鼠的肾皮质中的AGEs相对含量(AUF/mg皮质)和血清中的AGEs相对含量(AUF/mg蛋白)与正常对照组相比明显升高，在两组之间皆有非常显著性差异(P＜0.01)；黄芪甲苷低剂量治疗组的血清AGEs即有明显下降，有非常显著性差异(P＜0.01)，中剂量和高剂量组的肾皮质AGEs和血清AGEs进一步下降，与糖尿病肾病模型组相比皆有非常显著性差异(P＜0.01)。而且黄芪甲苷对肾皮质中AGEs的降低作用皆呈剂量依赖性关系；EPS治疗组大鼠的皮质AGEs和血清AGEs也都有显著性或非常显著性降低(P＜0.05或P＜0.01)(见表2)。

2.2  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠血清中T-AOC、CAT活力、GSH含量的影响

糖尿病肾病模型组大鼠的血清中总抗氧化能力T-AOC(U/mL)、过氧化物酶CAT活力(U/mL)和谷胱苷肽含量GSH(mg/L)与正常对照组相比明显降低，在两组之间皆有非常显著性差异(P＜0.01)。黄芪甲苷中高剂量治疗组的T-AOC与糖尿病肾病模型组相比有非常显著性升高(P＜0.01)，且此升高作用有剂量依赖性，EPS治疗组对T-AOC也有升高作用，与糖尿病肾病模型组相比有非常显著性差异(P＜0.01)。黄芪甲苷中高剂量治疗组的CAT活力与糖尿病肾病模型组相比有一定程度的升高，有统计学意义(P＜0.05)，而EPS治疗组的CAT活力与糖尿病肾病模型组相比则无统计学差异。黄芪甲苷低中高剂量组的GSH含量与糖尿病肾病模型组相比皆有较大幅度的升高，皆具有非常显著性差异(P＜0.01)，且该升高作用的剂量依赖性明显，EPS治疗组的GSH含量与糖尿病肾病模型组基本相同(见表3)。

表2  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠皮质AGEs和血清AGEs的影响

组别        样本数          皮质AGEs(AUF/mg皮质)            血清AGEs(AUF/mg蛋白)

NS          10              0.54±0.18                      4.70±0.94

DN          10              2.30±0.71^##                   17.25±2.50^##

ASIL        10              1.75±0.37                      7.64±0.61^**

ASIM        10              1.26±0.28^**                   6.68±1.58^**

ASIH        10              1.14±0.49^**                   7.57±2.79^**

EPS         10              1.60±0.36^*                    8.46±2.07^**

与正常对照组相比，##P＜0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表3  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠血清中T-AOC、CAT活力、GSH含量的影响

组别        样本数        T-AOC(U/ml)         CAT活力(U/ml)          GSH(mg/L)

NS          10            15.85±0.99         5.37±1.13             258.3±17.6

DN          10            6.94±1.81^##       3.74±0.91^##          165.4±7.9^##

ASIL        10            7.33±0.75          4.61±0.47             179.3±6.4^**

ASIM        10            12.86±1.31^**      5.46±0.81^*           197.4±9.7^**

ASIH        10            13.76±4.22^**      5.89±1.22^*           244.4±17.5^**

EPS         10            9.00±0.70^**       4.33±0.40             165.2±9.0

与正常对照组相比，##P＜0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例4  黄芪甲苷对醛糖还原酶的抑制作用

1  材料和方法

实验动物、药品与试剂、造模与实验治疗皆同实施例1。

1.1  黄芪甲苷在糖尿病肾病整体大鼠上对醛糖还原酶的抑制作用

造模与实验治疗与实施例1相同外，于第8周末处死大鼠，腹主动脉收集全血标本1.0mL于冰水浴中预冷的肝素抗凝管，3000 rpm离心10min，分离红细胞层，以5mL冷等渗生理盐水分别冲洗3次后，加入1.5倍体积的水制成溶血液，4℃ 10000rpm离心30min，取上清液测定红细胞醛糖还原酶活性。

反应温度为25℃，酶促反应体系体积为1.0ml，其组成为67mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.47)、400mmol/L硫酸锂、0.10mmol/L NADPH、大鼠血清、10mmol/L DL-甘油醛，以磷酸盐缓冲液补足体积。其中DL-甘油醛最后加入并开始记时，反应30min后加入11.8mol/L NaOH终止反应，在岛津RF-5000型荧光分光光度计(SHIMADZUspectrofluorophoto meter RF-5000)上记录其荧光强度的变化，激发波长为360nm，检测波长为450nm。规定37℃下反应体系吸光度每分钟下降0.001为一个酶活力单位U。以不含底物的样品为空白对照，扣除空白对照体系中NADPH自然氧化所造成的吸光度变化。例如比色杯中每分钟吸光度下降0.050，即具有50个酶活力单位U。

1.2  统计学处理  所有测定结果用 x±s表示，采用组间t检验进行统计学分析。

2  结果

2.1  黄芪甲苷在糖尿病肾病整体大鼠上对醛糖还原酶的抑制作用

糖尿病肾病模型组大鼠血清中醛糖还原酶的活性是正常对照组的3倍，在两组之间皆有非常显著性差异(P＜0.01)。黄芪甲苷低中高剂量治疗组的醛糖还原酶活性与糖尿病肾病模型组相比皆有非常显著性降低(P＜0.01)，且此降低作用有剂量依赖性，EPS治疗组对醛糖还原酶的降低作用较强，与糖尿病肾病模型组相比有非常显著性差异(P＜0.01)(见表4)。

表4  黄芪甲苷在糖尿病肾病整体大鼠上对醛糖还原酶的抑制作用

组别          样本数          AR活性(U)

NS              10            6.94±9.00

DN              10            27.29±13.35^##

ASIL            10            24.91±5.73

ASIM            10            17.18±3.84^**

ASIH            10            9.88±3.89^**

EPS             10            11.07±4.91^**

与正常对照组相比，##P＜0.01；与糖尿病肾病模型组相比^**P＜0.01

实施例5  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠的细胞外基质的作用

1  材料和方法

实验动物、药品与试剂、造模与实验治疗皆同实施例1。

1.1  IV型胶原和层粘蛋白的提取与测定

将低温保存的肾皮质标本吸干水分后制备均浆(匀浆液为0.15mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，pH7.4)，加提取液1mL(提取液为HAc 0.5mol/L，胃蛋白酶1g/L)，4℃抽提18h，取上清液测定IV型胶原和层粘蛋白含量。

1.2  统计学处理  所有测定结果用x±s表示，采用组间t检验进行统计学分析。

2  结果

糖尿病肾病模型组大鼠肾组织中IV型胶原(μg/g)和层粘蛋白(μg/g)含量与正常对照组相比明显升高，在两组之间皆有非常显著性差异(P＜0.01)。黄芪甲苷低中高剂量治疗组大鼠肾皮质中IV型胶原的含量与糖尿病肾病模型组相比略有降低，而且此降低作用随着剂量的增大而依次增大，但都无统计学意义(P＞0.05)，EPS治疗组的IV型胶原含量与糖尿病肾病模型组基本一样(P＞0.05)。黄芪甲苷低中剂量治疗组和EPS治疗组的层粘蛋白含量与糖尿病肾病模型组相比有明显下降，分别有非常显著性和显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)(见表5)。

表5  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾皮质中IV型胶原和层粘蛋白的影响

组别        n          IV型胶原(μg/g)        层粘蛋白(μg/g)

NS          10         0.490±0.124           1.004±0.689

DN          10         0.753±0.259^##        2.913±1.864^##

ASIL        10         0.713±0.293           0.660±0.622^*

ASIM        10         0.652±0.125           0.723±0.487^**

ASIH        10         0.598±0.171           0.890±1.267^*

EPS         10         0.715±0.185           1.282±0.973^*

与正常对照组相比，##P＜0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例6  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠血清中TGF_β的作用

1  材料和方法

实验动物、药品与试剂、造模与实验治疗皆同实施例1。

1.1  肾皮质TGF_β1的PCR测定

以酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法用Trizol试剂提取大鼠肾组织总RNA。以Oligo(dT)₁₅为引物，在逆转录酶(MMLV)催化下合成第一链cDNA。具体反应体系为：总RNA 1μg与Oligo(dT)₁₅ 0.5μL，65℃10min，然后加入MgCl₂(25mmol/L)4μL，10×RT Buffer 2μL，MMLV 0.8μL，DEPC处理水4.7μL，42℃水浴1h，沸水浴5min，-20℃保存。以适量cDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增。所用引物均由GENETOOL软件设计，上海生工生物公司合成。TGFβ1上游引物为5’-CCCGCATCCCAGGACCTCTCT-3’，下游引物为5’-CGGGGGACTGGCGAGCCTTAG-3’，扩增长度519bp。β-actin上游引物为5’-GCTGCGTGTGG CCCCTGAG-3’，下游引物为5’-ACGCAGGATGGCATGAGGGA-3’，扩增长度252bp。取2μL逆转录产物为模板，在25μL体系中先将模板于94℃预变性5min，进入循环，94℃ 1min，54℃ 5min，72℃ 1min，30个循环后72℃ 7min。将TGFβ1的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳(80V，60min)分离，EB染色后置于凝胶图象分析系统进行吸光度扫描，以管家基因β-actin作为内参照校正，用TGFβ1的吸光度与β-actin吸光度的比值表示目的基因TGFβ1的相对表达含量。

1.2  统计学处理  所有测定结果用 x±s表示，采用组间t检验进行统计学分析。

2.黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾皮质中TGFβ1含量的影响

糖尿病肾病模型组大鼠肾皮质中TGFβ1的相对含量与正常对照组相比明显升高，在两组之间皆有非常显著性差异(P＜0.01)。黄芪甲苷低剂量治疗组的TGFβ1含量与糖尿病肾病模型组相比较为接近(P＞0.05)，中剂量和高剂量治疗组与糖尿病肾病模型组相比有非常显著性降低(P＜0.01)，而且此降低作用随着剂量的增大而依次增大，有剂量依赖性倾向，EPS治疗组的TGFβ1含量也有非常显著性降低(P＜0.01)(见表6)。

表6  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾皮质中TGFβ1相对含量的影响

组别            n             TGFβ含量(TGFβ1/β-actin)

NS              10                0.55±0.09

DN              10                1.21±0.25^##

ASIL            10                1.07±0.24

ASIM            10                0.80±0.12^**

ASIH            10                0.67±0.12^**

EPS             10                0.82±0.19^**

与正常对照组相比，##P＜0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例7  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠的肾脏组织形态学的影响

1  材料和方法

实验动物、药品与试剂、造模与实验治疗皆同实施例1。

1.1  形态学光镜观察

将肾组织块脱水、石蜡包埋、切片(3μm)，苏木精-伊红(HE)和PAS双重染色，观察光镜下肾脏形态学改变。将肾小球系膜增生分成0～III级，分别记为0、2、4、6分。0级：正常肾小球；I级：系膜增生宽度小于毛细血管直径，呈节段性分布；II级：系膜增生宽度大于毛细血管直径，呈弥漫性分布；III级：系膜增生宽度呈团块状聚集，弥漫指状分布，挤压血管腔。每例随机取1个肾小球按上述标准记分取均数。

1.2  形态学电镜观察

从每组大鼠中随机抽取3例标本进行电镜观察。取肾皮质常规固定、脱水、包埋(Epon 812)，RKB-V型切片机切片，HE染色，光镜肾小球定位后超薄切片，醋酸铀染色30min，枸橼酸铅染色5min，JEM-1200EX ELECTRON MICROSCOPE透射电镜(日本电子，JEOL)观察肾小球系膜区基质和基底膜，并照相，每例标本5张照片。将照片扫描转换为JPG文件，然后以LEICA QWIN STANDARD V2.6(Leica MicrosystemsLtd)图象分析系统测量计算基底膜厚度。每张照片上随机测量7处基底膜的厚度，并计算其平均值。

1.3  统计学处理  所有测定结果用 x±s表示，采用组间t检验进行统计学分析。

2  结果

2.1  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾组织光镜形态的影响

光镜显示，与正常大鼠相比，糖尿病肾病模型组大鼠肾组织形态表现出一定程度的异常，如肾小球肥大、系膜细胞增生等。与糖尿病肾病模型大鼠相比，黄芪甲苷高剂量组的系膜细胞增生减轻，并有显著性差异(P＜0.05)，其他方面的组织形态学也有一定的改善；而低剂量组则基本上没有变化。

在光镜下观察糖尿病肾病模型组大鼠的肾小球系膜增生和中性白细胞两个指标与正常对照组相比明显增大，有非常显著性差异(P＜0.01)。黄芪甲苷低剂量治疗组的肾小球系膜增生与糖尿病肾病模型组大鼠相比无显著性差异(P＞0.05)，而中高剂量治疗组则较糖尿病肾病模型组则有显著性差异降低(P＜0.05，P＜0.01)；黄芪甲苷低中剂量治疗组的中性白细胞与糖尿病肾病模型组大鼠相比无显著性差异(P＞0.05)，高剂量治疗组的与糖尿病肾病模型组大鼠相比有显著性降低(P＜0.05)；EPS治疗组的以上这两个指标皆有一定程度的降低，但无统计学意义。3个剂量组的肾小球系膜增生和中性白细胞下降幅度与其给药剂量呈一定的剂量依赖性(见表7)。

2.2  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾组织电镜形态的影响

在电镜下观察，正常对照组大鼠的肾小球毛细血管均开放良好；毛细血管基底膜厚度均一平滑；足突无微绒毛化和扁平化；系膜细胞及基质无增生。糖尿病肾病模型组大鼠的肾小球毛细血管部分开放，较为拥挤，有轻度淤血；毛细血管基底膜基本平滑，但其厚度在少数部位不均一；足突微绒毛化约占30％，扁平化占50％；系膜细胞及基质轻度结节性增生。黄芪甲苷低剂量治疗组大鼠的肾小球毛细血管部分开放，有拥挤现象；毛细血管基底膜基本平滑，厚度基本均一；足突微绒毛化约占20％，扁平化占30％；系膜细胞及基质轻度增生。黄芪甲苷中剂量治疗组大鼠的肾小球毛细血管基本全部开放，略有拥挤现象；毛细血管基底膜基本平滑，厚度基本均一；足突微绒毛化约占10-20％，扁平化占10-20％；系膜细胞及基质轻微增生。黄芪甲苷高剂量治疗组大鼠的肾小球毛细血管全部开放，无拥挤现象；毛细血管基底膜平滑，厚度均一；足突基本无微绒毛化和扁平化；系膜细胞及基质无增生。EPS阳性药治疗组大鼠的肾小球毛细血管部分开放，有拥挤现象；毛细血管基底膜基本平滑，厚度基本均一；足突微绒毛化约占10％，扁平化占20％；系膜细胞及基质轻微增生。

糖尿病肾病模型组大鼠的基底膜厚度与正常对照组相比明显增大，有非常显著性差异(P＜0.01)。黄芪甲苷低中剂量治疗组的基底膜厚度虽有一定幅度的降低，但无显著性差异(P＞0.05)；而黄芪甲苷高剂量治疗组和EPS治疗组则较糖尿病肾病模型组有进一步的降低，并具显著性差异(P＜0.05)(见表8)。

表7  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾组织光镜下肾小球系膜增生和中性白细胞的影响

组别        n        肾小球系膜增生记分    中性白细胞记分

NS          10            0.6±1.0             0.3±0.7

DN          10            4.4±1.8^##          3.4±1.3^##

ASIL        10            3.6±0.9             3.2±1.1

ASIM        10            2.8±1.0^*           2.4±0.8

ASIH        10            2.4±0.8^**          2.2±0.6^*

EPS         10            3.6±0.8             2.4±0.8

与正常对照组相比，##P＜0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表8  黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾组织电镜基底膜厚度的影响

组别        n            基底膜厚度(nm)

NS          3            141.6±9.7

DN          3            219.4±8.5^##

ASIL        3            189.3±46.4

ASIM        3            178.9±18.5^*

ASIH        3            152.9±6.0^**

EPS         3            160.2±15.9^*

与正常对照组相比，##P＜0.01；与糖尿病肾病模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0

Claims (7)

1.黄芪甲苷的制备方法，其制备步骤如下：

(1)将黄芪粉末用乙醇浸泡回流提取三次，合并提取液减压浓缩，得浓缩液；

(2)加固体NaoH，回流2小时，将回流液中的乙醇蒸去，得乙醇水解液；

(3)用乙酸乙酯萃取三次，弃去乙酸乙酯后，所得的水解液用水饱和的正丁醇分次萃取六次，合并萃取液，用正丁醇饱和的水洗至中性，得中性正丁醇水溶液，并蒸干得粗皂苷；

(4)向粗皂苷内加入乙酸乙酯，于水浴中加热、搅拌、放冷、渗去杂质，重复2-3次，过滤、沉淀、弃去乙酸乙酯，即得较纯的皂苷；

(5)将较纯的皂苷，用甲醇重结晶二次即得黄芪甲苷。

2.根据权利要求1所述的黄芪甲苷，其特征是在步骤(1)中取黄芪粉末1.0-2.0kg，用60-95％的乙醇回流提取，减压浓缩至药材量的1.5∶1。

3.根据权利要求1所述的黄芪甲苷，其特征是在步骤(2)中，加固体NaoH5-10g。

4.根据权利要求1所述的黄芪甲苷，其特征是在步骤(3)中，用50-300ml的乙酸乙酯萃取。

5.根据权利要求1所述的黄芪甲苷，其特征是在步骤(4)中，向粗皂苷中加入5-10倍的乙酸乙酯，于70℃水浴中搅拌。

6.根据权利要求1所述的黄芪甲苷，其特征是在黄芪甲苷中加入适当的辅料，用常规的制备方法，可以制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等口服制剂。

7.黄芪甲苷在制备预防和治疗糖尿病肾病的药物中的应用。