CN104721238B - 乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种建立慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的方法。该方法将pGEM4Z/HBV1.3质粒通过高压尾静脉注射于FVB/N小鼠体内，造成小鼠肝脏HBV慢性复制状态，再以含酒精液体饲料喂养5周以上，观察了小鼠肝脏组织学变化和血清学变化，包括谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)及乙肝e抗原(HBeAg)，从而建立模拟人类慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝病理过程的小鼠模型。该模型的建立为系统研究慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝的遗传调控、分子机理及防治措施提供了有力的工具。

Description

乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及一种建立慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的方法，用于模拟、研究和防治人类慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是一个严重危害人类健康的世界性公共卫生问题，能引起多种肝损害，包括急慢性病毒性肝炎，甚至与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关。全球约有20亿人被证明感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.5亿。我国是乙型肝炎病毒感染的高发地区，全国约1.5亿人是HBV携带者，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人数已近50万。在我国，随着社会经济发展、饮食生活习惯的改变，中国酒精消耗量迅速增长，嗜酒者在不到20年内增长了70倍。酒类产量也不断增大；WHO2006年《西太平洋地区减少酒精危害计划》指出中国已成为世界酒精消费的“重灾区”。近年来由酒精所导致肝损伤的发病率亦逐年攀升,酒精已成为继病毒性肝炎之后导致肝损害的第二大病因，该病是我国常见的肝脏疾病之一。而且，不少HBV感染患者由于长期饮酒而导致酒精性脂肪肝和肝炎病毒感染混合存在，起到叠加的致病的作用，更易并发肝硬化及肝癌；因此临床上慢性HBV感染合并酒精性肝病的患者日益增多，这对临床的治疗及预后又带来了新的挑战。因而，深入开展慢性HBV感染合并酒精性肝病的研究可为预测该疾病的衍变和预后以及为该疾病的临床治疗提供理论依据。

HBV感染具有明显的种属特异性，其易感宿主只局限于人及黑猩猩等灵长类动物，因此建立适合于HBV研究的简单、可靠的小动物模型是研究者们一直需要攻克的难关。1969年科学家们首次证实了HBV可以感染黑猩猩，这对HBV的研究起了重要作用，但是黑猩猩价格昂贵，且来源有限，加之其感染HBV后虽有特异性免疫反应产生但并无明显的临床症状，其感染后的经过与转归与人类乙型肝炎有明显的差别，因此研究者们有必要继续寻找其他更易获得且对HBV更加敏感的动物模型。长臂猿类似黑猩猩对 HBV敏感，感染HBV后可出现与人类类似的血清学和生化学改变，但其同样不产生明显的临床症状。绒毛猴感染HBV后虽可产生迟发型HBsAg血症，但临床症状、血清生化和肝组织学无明显变化。恒河猴对HBV的易感性比黑猩猩和长臂猿低，且其只对HBV-adw亚型敏感，但感染动物都缺乏典型临床症状，血清转氨酶活力无明显升高，肝组织也缺乏相应的肝炎病理改变，这些均限制了恒河猴在乙型病毒肝炎研究中的应用。树鼩是一种低等小型灵长类动物，20世纪80年代起，即被用于HBV实验感染动物模型的研究。用人HBV接种树鼩发现肝脏细胞内有病毒DNA的复制，血清中出现HBsAg等HBV标志物，肝细胞显示轻度肝炎病变，血清转氨酶明显升高。但树鼩目前多以野生繁殖为主，捕获后短期饲养便进行实验，实验结果稳定性差。因此对培育驯化成生理指标和条件一致的动物种系仍有待进一步研究。

随着人们对乙型肝炎病毒认识的不断提高，1985年Chisari等科研工作者通过显微注射技术建立了乙型肝炎病毒转基因小鼠模型，该模型主要用于乙型肝炎病毒治疗性免疫制剂的发展和临床效果观察，为乙型肝炎病毒的深入研究提供了新的途径。但也存在一些问题，如转基因小鼠具有遗传不稳定性，小鼠体内缺乏病原体复制，与HBV自然感染人体的状态有所不同。近年来一种新型的技术，即快速大量的经鼠尾静脉注射质粒DNA可以大大提高转染效率，其与转基因鼠比较有两大优势：首先能够进行急性肝炎情况下的免疫反应研究，因HBV-DNA不整合到宿主基因上，也可用该模型进行抗病毒治疗或介导免疫反应后清除病毒复制和感染的研究；第二，许多变异株病毒，包括从患者体内采集的和实验室构建的，可以注入鼠的体内，并在较短的时问内分析其复制能力。

酒精性肝病是引起各种急慢性肝病的一个主要因素，其发病机制至今尚未明确，导致临床治疗一直没有取得突破性进展，因此建立一个能够模拟人类酒精性肝病相似的动物模型具有十分重要的意义，为此研究者们也尝试了很多方法。直接饮用酒精，该法是研究者给SD大鼠自由饮用酒精浓度逐渐升高的酒精饮料，采用生理方式喂食酒精建立模型，与临床中酒精性脂肪肝患者发病过程相似，有良好的模仿性，简单易行，但不易控制酒精摄入量，同时因大鼠厌酒且大鼠肝脏对酒精的代谢能力较强，容易对酒精形成耐受，故难以保持血中较高酒精浓度，因此造模时间较长，成功率不高。酒精灌胃是目前应用最多的建模方法，该法比生理喂食酒精繁琐，但可控制酒精摄入量造模成功率较高，但长期灌胃，会对小鼠食管黏膜及胃粘膜造成损害，负担较重，死亡率高。为保持较高的血醇浓度、保证长期摄取足量酒精与营养并有效排除因长期摄取酒精而引起的营 养障碍，Lieber-Decarli等于1965年提出含全营养素和酒精的液体食料，该液体食料包括粉末状酪蛋白、玉米油、橄榄油、右旋糖酐等9中成分，酒精摄入量占总热量的40％左右。该模型简单易行、形成率高、稳定性好。此外有学者认为，酒精性肝病的发生除酒精本身的毒性作用外，营养因素、遗传因素及细胞免疫异常等因素均可能有促进作用，基于此研究人员对以上模型进行改进，加入肝损伤的诱发因素，如酒精加脂类、吡唑、乙醛加合物以及内毒素等。这些方法虽能有效的建立酒精性肝损伤的模型，但其影响因素繁多，不利于研究酒精单因素对酒精性肝病的作用研究。

目前只有针对单纯HBV感染和单纯酒精性脂肪肝的动物模型，而无将HBV感染与酒精性脂肪肝合并的动物模型，本发明旨在填补这一空缺，提供一种慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝的小鼠模型，用该方法建立的小鼠模型成本低廉、易于复现，临床症状明显且与人类情况类似。

发明内容

本发明的目的是针对现有慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝并研究过程中存在的缺陷，提供一种乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法，该方法构建的模型小鼠填补了现有无慢性乙型肝炎病毒感染和酒精性脂肪肝合并的动物模型的空缺，并且模型小鼠的构建成本低廉、易于复现、临床症状明显、具有完整的病毒感染及复制周期，并可以刺激免疫系统产生抗病毒免疫应答，与人类慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝的多种特征相似，可以较好地模拟慢性HBV感染合并酒精性肝病的病理过程。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法，包括对小鼠依次进行乙型肝炎病毒感染、酒精饮食诱导喂养。

其中，所述小鼠选择FVB/N小鼠。

特别是，所述小鼠选择雄性FVB/N小鼠。

其中，所述小鼠选择6-8周龄，雄性FVB/N小鼠。

特别是，所述小鼠的动物级别为SPF级。

其中，所述乙型肝炎病毒感染是通过尾静脉向小鼠体内注射pGEM4Z/HBV1.3质粒。

特别是，所述pGEM4Z/HBV1.3质粒的注射量为1-50μg，优选为10μg。

其中，将所述pGEM4Z/HBV1.3质粒1-50μg溶解于PBS缓冲溶液中后再进行所述的尾静脉注射pGEM4Z/HBV1.3质粒。

特别是，在6-8秒内将所述的pGEM4Z/HBV1.3质粒经尾静脉注射入小鼠体内。

特别是，所述PBS缓冲溶液的重量与小鼠的体重之比为7-10：100，优选为8：100。

尤其是，所述乙型肝炎病毒感染处理是首先将1-50μg的pGEM4Z/HBV1.3质粒溶解于相当于小鼠体重8％的PBS缓冲溶液中，然后在6-8秒内经尾静脉注射入小鼠体内。

特别是，还包括病毒感染监测步骤，对乙型肝炎病毒感染后的小鼠进行眦静脉采血，测定血清中HBeAg水平，然后再进行所述的酒精饮食诱导喂养。

尤其是，于尾静脉注射pGEM4Z/HBV1.3质粒后24h，对小鼠进行眦静脉取血，测定血清中HBeAg水平。

其中，所述的PBS缓冲溶液的浓度为0.01M，pH7.4。

特别是，所述PBS缓冲溶液的组成为NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO_4·12H₂O 3.63g，定容至1000ml，调节pH＝7.4。

其中，所述酒精饮食诱导喂养是采用酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行喂养，诱导形成酒精性脂肪肝小鼠。

特别是，分3个阶段对病毒感染处理后的小鼠进行所述的酒精饮食诱导喂养。

其中，所述的3个阶段的酒精饮食诱导喂养过程中酒精浓度依次递增，即采用酒精浓度依次递增的酒精液体饲料进行所述的3个阶段的酒精饮食诱导喂养。

特别是，所述酒精液体饲料中酒精的浓度为1-5％(v/v)。

其中，首先采用酒精浓度为1％的酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行第一阶段的酒精诱导喂养；接着采用酒精浓度为3％的酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行第二阶段的酒精诱导喂养；然后采用酒精浓度为5％的酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行第三阶段的酒精诱导喂养。

特别是，所述第一阶段的酒精诱导喂养时间为4-7天，优选为5天；所述第二阶段的酒精诱导喂养时间为4-7天，优选为5天；所述第三阶段的酒精诱导喂养时间为5-7周，优选为6周。

特别是，所述第一阶段的酒精诱导喂养过程中，酒精液体饲料的用量为5-6ml/只小鼠/天；所述第二阶段的酒精诱导喂养过程中，酒精液体饲料的用量为5-6ml/只小鼠/天；所述第三阶段的酒精诱导喂养过程中，酒精液体饲料的用量为5-6ml/只小鼠/天。

特别是，还包括灌胃处理步骤，在第三阶段的酒精诱导喂养过程中对小鼠每周进行一次酒精灌胃处理。

其中，酒精灌胃处理过程中酒精用量依次增加。

特别是，灌胃处理过程中使用95％的食用酒精。

尤其是，第三阶段酒精诱导喂养过程的第一周对小鼠采用95％食用酒精灌胃一次，其中95％食用酒精的用量为50ul/只/次；第二周对小鼠采用95％食用酒精灌胃一次，其中95％食用酒精的用量为50ul/只/次；第三周对小鼠采用95％食用酒精灌胃一次，其中95％食用酒精的用量为80ul/只/次；第四周对小鼠采用95％食用酒精灌胃一次，其中95％食用酒精的用量为80ul/只/次；第五周对小鼠采用95％食用酒精灌胃一次，其中95％食用酒精的用量为100ul/只/次；第六周对小鼠采用95％食用酒精灌胃一次，其中95％食用酒精的用量为100ul/只/次。

其中，每1000ml所述酒精浓度为1-5％(v/v)的酒精液体饲料含主料120g，维生素2.5g，矿物质8.7g，食用酒精10-50ml，余量为水。

特别是，所述酒精的浓度为1-5％(v/v)的酒精液体饲料中食用酒精的体积与酒精液体饲料的体积之比为1-5：100，即1000ml的酒精液体饲料中食用酒精的体积为10-50ml。

特别是，所述酒精液体饲料为江苏南通特洛菲公司生产。

尤其是，所述食用酒精的质量百分比浓度为95％。

本发明的造模方法，HBV感染及酒精饮食喂养后小鼠出现兴奋或嗜睡等醉酒形态，小鼠体重逐渐减轻。油红O染色切片可见肝组织大面积红色脂肪滴，肝脏甘油三酯明显升高，ALT和AST也轻度升高，且可检测到HBeAg存在。这些现象与人类慢性HBV感染合并酒精性脂肪肝病理类似，由此表明该模型可较好地模拟慢性HBV感染合并酒精性肝病的病理过程。

本发明相对于现有技术具有以下优点：

1.pGEM4Z/HBV1.3质粒感染小鼠后可持续产生HBeAg，长期酒精饮食结合灌胃，小鼠出现酒精性脂肪肝的病理变化更加明显，外周血持续检测HBeAg，较好地模拟人类患有该疾病的变化。

2.本发明的小鼠模型重复性好，遗传背景清晰，使系统性研究慢性HBV感染合并酒精性肝病的分子生物学、分子免疫学发病机制成为可能。

3.所建模型成本相对低廉，为该疾病的临床研究与治疗提供了可靠的途径。

附图说明

图1是本发明实施例2中小鼠e抗原表达结果监测图；

图2是本发明实施例3中各试验组小鼠酒精诱导喂养第3阶段体重变化曲线图；

图3是本发明实施例3中各试验组小鼠的肝组织病理切片油红O染色图，其中，3A为正常组小鼠肝组织；图3B为单纯HBV感染组小鼠肝组织；图3C为单纯饮酒对照组小鼠肝组织；图3D为模型组小鼠肝组织；

图4是本发明实施例3中各试验组小鼠肝脏甘油三酯含量测定结果图；

图5是本发明实施例3中各试验组小鼠血清学(AST、ALT)测定结果图，其中，5A为小鼠血清AST测定结果图，5B为小鼠血清中ALT测定结果图；

图6是本发明实施例3中各试验组小鼠造模终点是e抗原表达结果测定图；

图7是本发明实施例4中各试验组小鼠肝组织病理切片变化比较图，其中，7A是采用常规的酒精饲料诱导喂养的单纯饮酒对照组小鼠肝组织病理切片图；7B是采用常规的酒精饲料诱导喂养的慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型组小鼠肝组织病理切片图；7C是采用本发明方法诱导喂养的单纯饮酒对照组小鼠肝组织病理切片图；7D是采用本发明方法有点喂养的模型组小鼠肝组织病理切片图；

图8是本发明实施例4中各试验组小鼠外周血请中甘油三酯、总胆固醇含量比较图，其中，8A为小鼠血清中甘油三酯含量比较图，8B为小鼠血清中总胆固醇含量比较图；

图9是本发明实施例4中各试验组小鼠血清ALT含量比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1实验动物与材料

1、动物

FVB/N小鼠(6-8周，SPF级，雄性)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2、质粒

pGEM4Z/HBV1.3质粒由台湾阳明大学微生物与免疫研究所提供。

对照质粒pGEM4Z购自武汉普洛麦格生物技术公司。

3、饲料

AIN93酒精液体饲料、AIN93对照液体饲料均购自江苏南通特洛菲公司。

AIN93酒精液体饲料：主料120g，维生素2.5g，矿物质8.7g，1-5％(v/v)的食用酒精(95％)，蒸馏水适量。

使用时，根据液体饲料不同酒精浓度的需要，分别向饲料主料、维生素、矿物质中加入食用酒精(食用酒精的浓度为95％)，然后再加入蒸馏水定容至，配制成酒精浓度为1-5％的AIN93酒精液体饲料，其中加入的食用酒精的体积与AIN93酒精液体饲料的总体积为1-5：100。

本发明实施例中配制的不同酒精浓度的AIN93酒精液体饲料选择酒精浓度为1％、3％、5％，即加入的食用酒精的体积与AIN93酒精液体饲料的总体积之比分别为1：100、3：100、5：100。

单纯饮酒对照组和慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型组选用AIN93酒精液体饲料

AIN93对照液体饲料：主料275.2g，维生素2.5g，矿物质8.7g，蒸馏水定容至1000ml。

正常组、单纯HBV感染对照组选用AIN93对照液体饲料。

试验例2病毒感染及带原监测

1、小鼠分组

FVB/N小鼠随机分为2组(即正常组、单纯HBV感染组)，正常组小鼠10只，单纯HBV感染组小鼠20只；

2、病毒感染

2-1、将对照质粒pGEM4Z(10μg)溶于0.01mol/L磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.4)中，制成对照质粒pGEM4Z溶液，其中，所述PBS缓冲溶液的重量与小鼠体重之比为8：100；然后将对照质粒pGEM4Z溶液经尾静脉高压注射至正常组小鼠体内，PBS缓冲溶液的组成为NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO_4·12H₂O 3.63g，定容至1000ml，调节pH＝7.4；

2-2、将pGEM4Z/HBV1.3质粒(10μg)溶解于PBS中，制成pGEM4Z/HBV1.3质粒溶液，其中，所述PBS缓冲溶液的重量与小鼠体重之比为8：100；然后在6-8秒钟内将pGEM4Z/HBV1.3质粒溶液经尾静脉快速注射入到单纯HBV感染组小鼠体内；

2-3、尾静脉注射质粒溶液24小时后，将小鼠用乙醚麻醉后，经內眦静脉取血，以3000r/min离心15min后取血清，并用无菌生理盐水稀释5倍，用全自动免疫分析仪(Architect i4000)来测定血清中HBeAg水平，监测各组小鼠HBeAg带原情况，测定结果如图1所示；尾静脉高压注射对照质粒组小鼠的血清中S/CO值均小于1，说明尾静脉高压注射对照质粒的小鼠外周血清HBeAg为阴性，而尾静脉高压注射1.3HBV质粒组小鼠的S/CO值均大于1，说明该组小鼠外周血清HBeAg均为阳性。

2-4、对尾静脉注射质粒溶液的小鼠进行常规喂养，2周后，采用摘取眼球放血的方法，监测各组小鼠HBeAg带原情况，测定结果如图1所示，尾静脉高压注射对照质粒组小鼠的血清中S/CO值均小于1，说明尾静脉高压注射对照质粒的小鼠外周血清HBeAg为阴性，而尾静脉高压注射1.3HBV质粒组小鼠的S/CO值均大于1，说明该组小鼠外周血清HBeAg均为阳性。

由图1的检测结果可知：

1)本发明方法注射pGEM4Z/HBV1.3质粒24小时、2周的小鼠血清中HBeAg表达均阳性，且无显著性差异，说明高压尾静脉注射24小时后小鼠血清HBeAg的表达即趋于稳定；而注射对照质粒的小鼠血清HBeAg的表达仍为阴性，因此我们采用24小时作为监测时间点。

目前病毒感染后小鼠HBeAg的检测采用摘取眼球放血，处死小鼠后取肝脏进行检测，每两周进行一次，一直到造模终点。每两周对小鼠进行一次采血，对小鼠会造成一定伤害，会出现意外死亡，改变其生理状态，影响后续小鼠的酒精摄食情况；而本发明采用的内眦静脉取血进行检测，无需处死小鼠，保证了小鼠正常的生理状态，且可进行动态监测。

本发明观察到24小时的HBeAg带原情况与每2周的监测情况无明显差异。因此本发明造模方法无需进行每两周一次的病毒感染监测，简化了实验过程，有效地保护了小鼠的生理状态，且对后续小鼠的酒精摄食无影响。

2)本发明方法注射pGEM4Z/HBV1.3质粒24小时、2周的小鼠血清中HBeAg表达无显著性差异，说明本发明方法注射pGEM4Z/HBV1.3质粒后，小鼠感染病毒迅速，而且带原稳定，采用本发明方法可以获得稳定带原的模型小鼠。

3)采用本发明尾静脉注射pGEM4Z/HBV1.3质粒，感染小鼠的效率高，感染后的小鼠的HBeAg带原情况稳定；并且采用眦静脉取血监测小鼠HBeAg带原情况简便，快捷，测定结果准确，而且对实验小鼠创伤小，恢复快，可重复操作，避免实验小鼠意外死亡。

试验例3构建模型小鼠

1、小鼠分组

FVB/N小鼠随机分为四组，即正常组、单纯HBV感染对照组、单纯饮酒对照组和慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型组，每组10只，分别测得各组小鼠体重，测得结果如图2所示；

2、病毒感染

2-1、将对照质粒pGEM4Z(10μg)溶于0.01mol/L磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.4)中，制成对照质粒pGEM4Z溶液，其中，所述PBS缓冲溶液的重量与小鼠体重之比为8：100；然后将对照质粒pGEM4Z溶液经尾静脉高压注射至正常组和单纯饮酒对照组小鼠体内，PBS缓冲溶液的组成为NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO_4·12H₂O3.63g，定容至1000ml，调节pH＝7.4；

2-2、将pGEM4Z/HBV1.3质粒(10μg)溶解于PBS中，制成pGEM4Z/HBV1.3质粒溶液，其中，所述PBS缓冲溶液的重量与小鼠体重之比为8：100；然后在6-8秒钟内将pGEM4Z/HBV1.3质粒溶液经尾静脉快速注射入到单纯HBV感染对照组、慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型组小鼠体内；

尾静脉注射质粒溶液后1周测定各组小鼠体重，测定结果如图2所示。

3、酒精诱导喂养

3-1、在尾静脉注射相应的质粒溶液24小时后，采用AIN93酒精液体饲料喂养单纯饮酒对照组和慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型组小鼠；

首先：用酒精浓度为1％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第一阶段的诱导喂养4-7天(优选为5天)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为1％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；接着，用酒精浓度为3％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第二阶段的诱导喂养4-7天(优选为5天)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为3％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；然后，再用酒精浓度为5％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第三阶段的诱导喂养5-7周(优选为6周)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为5％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；在第三阶段的诱导喂养过程中每周对单纯饮酒对照组、模型组小鼠用95％食用酒精进行一次灌胃，1-2周灌胃量为50ul，3-4周灌胃量为80ul，5-6周灌胃量为100ul；

3-2、在尾静脉注射相应的质粒溶液24小时后，采用AIN93对照液体饲料喂养正常组和单纯HBV感染对照组小鼠，每只小鼠每天喂食5-6ml，喂养时间与模型组同步；在采用AIN93对照液体饲料喂养正常组和单纯HBV感染对照组小鼠8-14天(优选为10天)之后继续用AIN93对照液体饲料喂养正常组和单纯HBV感染对照组小鼠6周，在继续喂养6周的过程中每周对正常组、单纯HBV感染对照组小鼠用生理盐水进行一次灌胃，1-2周灌胃量为50ul，3-4周灌胃量为80ul，5-6周灌胃量为100ul；

3-3、单纯饮酒对照组、模型组小鼠在第三阶段诱导喂养6周后处死，在处死小鼠前9h再用95％食用酒精(150ul)对各组小鼠进行灌胃，灌胃9h后处死小鼠；正常组、单纯HBV对照组小鼠在继续喂养6周后处死；取小鼠肝脏和外周血，各组小鼠肝脏用4％甲醛固定，进行油红O染色以观察小鼠肝组织病理改变，小鼠肝组织病理切片油红O染色图如图3所示；肝脏组织匀浆观察肝脏甘油三酯含量变化，测定结果如图4所示；血清学观察指标为谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)及乙肝e抗原(HBeAg)，检测血清中的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)及乙肝e抗原(HBeAg)，血清中AST、ALT测定结果如图5所示，e抗原测定结果如图6所示；

小鼠进行酒精饮食诱导喂养的第3阶段过程中每周测定各组小鼠体重一次，测定结果如图2所示。

4、实验结果

4-1、小鼠体重变化

如图2所示，正常组及单纯HBV感染对照组小鼠体重呈略微上升趋势，而单纯饮 酒对照组及模型组小鼠体重逐渐减轻，至造模终点(即酒精饮食诱导喂养第6周)时正常组小鼠体重为29.9±1.1g，单纯HBV感染对照组体重为33.4±1.0g，单纯饮酒对照组体重为23.0±0.4g，模型组小鼠为21.3±0.6g，单纯饮酒对照组及模型组小鼠体重明显减轻(P<0.01)。

本实验动物模型造模终点时间为5％酒精饲料诱导第6周，下图体重变化曲线0W为小鼠基础体重，即酒精过渡饮食前的体重，1W为5％酒精饲料诱导满1周的体重，1％、3％酒精饲料过渡期间的小鼠体重未显示在图中。

4-2、小鼠肝组织病理变化

小鼠肝组织病理切片油红O染色结果如图3所示，正常组小鼠肝脏组织结构完整，肝索以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，肝小叶轮廓清晰，肝细胞细胞质丰富；单纯HBV感染对照组肝索略紊乱，肝细胞细胞质清晰透明；单纯饮酒对照组及模型组肝窦扩张，肝细胞肿胀，细胞质疏松，其内可见红染的脂肪空泡。其中，图3A为正常组小鼠肝组织；图3B为单纯HBV感染组小鼠肝组织；图3C为单纯饮酒对照组小鼠肝组织；图3D为模型组小鼠肝组织。

4-3、小鼠肝脏甘油三酯含量测定结果

如图4所示：正常组小鼠肝脏甘油三酯含量为0.53±0.08mg/g，单纯HBV感染对照组为0.65±0.03mg/g，单纯饮酒对照组为0.95±0.11mg/g，模型组为0.85±0.08mg/g，单纯HBV感染对照组、单纯饮酒对照组和模型组小鼠的肝脏甘油三酯含量较正常组明显升高(P<0.05)。

4-4、小鼠学清学测定结果

血清HBeAg测定结果显示：单纯HBV感染对照组及模型组均为阳性，而正常组及单纯饮酒对照组均为阴性：

如图5A所示：正常组小鼠血清AST为115±11U/L，单纯HBV感染对照组为107±11U/L，单纯饮酒对照组为210±35U/L，模型组为232±24U/L；如图5B所示：正常组小鼠血清ALT为55±2U/L，单纯HBV对照组为58±9U/L，单纯饮酒对照组为83±8U/L，模型组为97±8U/L。

与正常组比较，采用本发明方法构建的模型组小鼠血清AST、ALT均明显升高(P<0.01)，说明肝脏有轻微炎症反应。

4-5、小鼠e抗原表达结果

如图6所示：本发明单纯HBV感染对照组小鼠、模型组小鼠在造模终点时血清中HBeAg表达均阳性，S/CO>1，数值越高表明HBeAg滴度越强；而正常组、单纯酒精对照组小鼠血清中HBeAg的表达仍为阴性，S/CO<1。

上述结果表明：通过尾静脉高压注射的pGEM4Z/HBV1.3质粒能在小鼠肝脏内复制并能诱导产生HBeAg，而酒精饮食诱导喂养可使小鼠出现酒精性脂肪肝的病理变化，与人类在临床上的症状类似，说明本发明建立的模型可较好地模拟慢性HBV感染合并酒精性肝病的病理过程。

实施例4常规的酒精诱导喂养与本发明方法比较试验

1、小鼠分组

FVB/N小鼠随机分为四组，即单纯饮酒对照A组、B组；慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型C组、D组，每组10只；

2、病毒感染

2-1、将对照质粒pGEM4Z(10μg)溶于0.01mol/L磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.4)中，制成对照质粒pGEM4Z溶液，其中，所述PBS缓冲溶液的重量与小鼠体重之比为8：100；然后将对照质粒pGEM4Z溶液经尾静脉高压注射至单纯饮酒对照A、B组小鼠体内，PBS缓冲溶液的组成为NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO_4·12H₂O3.63g，定容至1000ml，调节pH＝7.4；

2-2、将pGEM4Z/HBV1.3质粒(10μg)溶解于PBS中，制成pGEM4Z/HBV1.3质粒溶液，其中，所述PBS缓冲溶液的重量与小鼠体重之比为8：100；然后在6-8秒钟内将pGEM4Z/HBV1.3质粒溶液经尾静脉快速注射入到慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型C、D组小鼠体内；

3、酒精诱导喂养

3-1、在尾静脉注射相应的质粒溶液24小时后，采用AIN93酒精液体饲料喂养单纯饮酒对照A组和慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型C组小鼠；

首先：用酒精浓度为1％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第一阶段的诱导喂养4-7天(优选为5天)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为1％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；接着，用酒精浓度为3％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第二阶段的诱导喂养4-7天(优选为5天)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为3％(v/v)的AIN93酒 精液体饲料量为5-6ml；然后，再用酒精浓度为5％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第三阶段的诱导喂养5-7周(优选为6周)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为5％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；

3-2、在尾静脉注射相应的质粒溶液24小时后，采用AIN93酒精液体饲料喂养单纯饮酒对照B组和慢性乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝模型D组小鼠；

首先：用酒精浓度为1％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第一阶段的诱导喂养4-7天(优选为5天)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为1％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；接着，用酒精浓度为3％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第二阶段的诱导喂养4-7天(优选为5天)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为3％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；然后，再用酒精浓度为5％(v/v)的AIN93酒精液体饲料进行第三阶段的诱导喂养5-7周(优选为6周)，每只小鼠每天喂食酒精浓度为5％(v/v)的AIN93酒精液体饲料量为5-6ml；在第三阶段的诱导喂养过程中每周对单纯饮酒对照组、模型组小鼠用95％食用酒精进行一次灌胃，1-2周灌胃量为50ul，3-4周灌胃量为80ul，5-6周灌胃量为100ul；

3-3、单纯饮酒对照B组、模型D组小鼠在第三阶段诱导喂养6周后处死，在处死小鼠前9h再用95％食用酒精(150ul)对各组小鼠进行灌胃，灌胃9h后处死小鼠；单纯饮酒对照A组、模型C组小鼠在第三阶段诱导喂养6周后直接处死；取小鼠肝脏和外周血，各组小鼠肝脏用4％甲醛固定，进行油红O染色以观察小鼠肝组织病理改变，小鼠肝组织病理切片油红O染色图如图7所示；肝脏组织匀浆观察肝脏甘油三酯及总胆固醇含量变化，测定结果如图8所示；血清学观察指标谷丙转氨酶(ALT)测定结果如图9所示。

4、实验结果

4-1、小鼠肝组织病理变化比较

如图7小鼠肝组织病理切片图所示，采用常规的酒精饲料诱导喂养和采用本发明方法(即酒精饲料诱导与酒精灌胃相结合的方法)诱导喂养的小鼠肝组织固定后，进行油红O染色，显微镜观察、比较，可见本发明方法处理小鼠红染的脂肪空泡面积大于单纯常规酒精饲料诱导喂养方法的小鼠的红染脂肪空泡面积，说明肝脏的酒精性脂肪变更加明显，造模效果更优，其中，图7A是采用常规的酒精饲料诱导喂养的单纯饮酒对照组小鼠肝组织病理切片图；图7B是采用常规的酒精饲料诱导喂养的慢性乙型肝炎病毒 感染合并酒精性脂肪肝模型组小鼠肝组织病理切片图；图7C是采用本发明方法诱导喂养的单纯饮酒对照组小鼠肝组织病理切片图；图7D是采用本发明方法诱导喂养的模型组小鼠肝组织病理切片图。

4-2、小鼠外周血清甘油三酯、总胆固醇含量比较

图8为常规的酒精饲料诱导喂养的小鼠与本发明方法(即酒精饲料诱导与酒精灌胃相结合的方法)喂养的小鼠血清中甘油三酯及总胆固醇的比较图，如图8A所示，采用常规的酒精饲料喂养的模型小鼠外周血清中甘油三酯含量为1.0±0.2mmol/L，而采用本发明方法喂养的模型小鼠外周血清甘油三酯为2.8±0.7mmol/L，显著高于常规方法喂养的模型(P<0.05)；如图8B所示，采用常规的酒精饲料喂养的模型小鼠外周血清中总胆固醇含量为3.8±0.2mmol/L，而采用本发明方法喂养的模型小鼠外周血清中总胆固醇含量为4.6±0.3mmol/L，显著高于常规方法喂养的模型小鼠的含量(P<0.05)。

小鼠外周血甘油三酯、总胆固醇的结果也可反应酒精性脂肪肝的形成状况，其含量越高说明小鼠酒精性脂肪肝病理损伤越明显。本发明结合灌胃的新造模方法不论是肝脏还是血清的甘油三酯和总胆固醇均高于常规的酒精喂养说明本发明造模方法在此两种指标上表现更优。

4-3、小鼠血清ALT比较

图9为常规的酒精饲料诱导喂养的小鼠与本发明方法(即酒精饲料诱导与酒精灌胃相结合的方法)喂养的小鼠血清中ALT含量的比较图，如图9所示，采用常规的酒精饲料喂养的模型小鼠血清中ALT含量为70±7U/L，而采用本发明方法喂养的模型小鼠血清中ALT含量为98±10U/L，两组差异显著，具有有统计学意义(P<0.05)。

ALT及AST反应的是肝脏酶学指标，含量越高说明肝脏的炎症损伤程度越高，本发明中不论是1.3HBV质粒感染还是诱导酒精性脂肪肝均会造成肝脏炎症形成，本发明结合灌胃的新造模方法与常规酒精喂养方法相比ALT具有显著性，说明用本发明方法造模形成的酒精性脂肪肝炎症反应更明显，效果更优。

综上所述，通过制定出恰当的给药剂量，给药时间、给药方式，复制出更接近于人类慢性乙型肝炎病毒合并酒精性脂肪性肝小鼠模型，将会使我们深入观察受试药物对模型动物肝脏、血液中丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胆固醇水平的影响，对肝脏的作用环节过程的影响成为可能，从而为慢性乙型肝炎病毒合并酒精性脂肪性肝 病药物的筛选和作用机理的研究提供必要和可靠的动物模型。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种乙型肝炎病毒感染合并酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法，其特征是包括对小鼠依次进行乙型肝炎病毒感染、酒精饮食诱导喂养，其中：所述小鼠选择FVB/N小鼠；所述乙型肝炎病毒感染是通过尾静脉向小鼠体内注射含有HBV全基因组1.3拷贝的pGEM4Z质粒；所述酒精饮食诱导喂养是采用酒精浓度依次递增的3个阶段对病毒感染处理后的小鼠进行酒精饮食诱导喂养和酒精灌胃处理，其中：

3个阶段的酒精饮食诱导喂养为：首先采用酒精浓度为1%的酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行4-7天的第一阶段的酒精诱导喂养，其中酒精液体饲料的用量为5-6ml/只小鼠/天；接着采用酒精浓度为3%的酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行4-7天的第二阶段的酒精诱导喂养，其中酒精液体饲料的用量为5-6ml/只小鼠/天；然后采用酒精浓度为5%的酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行5-7周的第三阶段的酒精诱导喂养，其中酒精液体饲料的用量为5-6ml/只小鼠/天；

酒精灌胃处理为在第三阶段的酒精诱导喂养过程中对小鼠每周进行一次酒精灌胃处理，其中第一周对小鼠采用95%食用酒精灌胃一次，其中95%食用酒精的用量为50ul/只/次；第二周对小鼠采用95%食用酒精灌胃一次，其中95%食用酒精的用量为50ul/只/次；第三周对小鼠采用95%食用酒精灌胃一次，其中95%食用酒精的用量为80ul/只/次；第四周对小鼠采用95%食用酒精灌胃一次，其中95%食用酒精的用量为80ul/只/次；第五周对小鼠采用95%食用酒精灌胃一次，其中95%食用酒精的用量为100ul/只/次；第六周对小鼠采用95%食用酒精灌胃一次，其中95%食用酒精的用量为100ul/只/次。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述质粒的注射量为1-50μg。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征是将1-50μg的所述质粒溶解于PBS缓冲溶液中后再进行所述尾静脉注射。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征是所述PBS缓冲溶液与小鼠的重量比为7-10：100。

5.如权利要求3所述的构建方法，其特征是所述尾静脉注射是在6-8秒内将所述的质粒经尾静脉注射入小鼠体内。

6.如权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征是还包括病毒感染监测步骤，对乙型肝炎病毒感染后的小鼠进行眦静脉采血，测定血清中HBeAg水平，然后再进行所述的酒精饮食诱导喂养。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征是于尾静脉注射所述质粒后24h，对小鼠进行眦静脉取血，测定血清中HBeAg水平。

8.如权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征是所述酒精饮食诱导喂养是采用酒精液体饲料对病毒感染处理后的小鼠进行喂养，诱导形成酒精性脂肪肝小鼠。