CN102188461A - 山芝麻提取物在制备抗乙型肝炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药山芝麻提取物在制备抗乙型肝炎的药物中的应用。本发明首次对山芝麻提取物包括水提物、醇提物和三萜类化合物进行了抗乙型肝炎的研究，体外和体内实验表明，山芝麻提取物可明显抑制乙肝病毒，减轻乙肝炎症，缓解肝脏组织细胞损伤，且作用稳定持久，没有反跳现象，优于目前临床常用的西药拉米夫定，对防治乙肝具有独特优势。山芝麻提取物用于治疗乙肝具有非常好的研发前景。可用于生产片剂、颗粒剂、合剂等剂型的治疗乙肝的中药制剂。

Description

山芝麻提取物在制备抗乙型肝炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药山芝麻提取物的用途，具体地说是以山芝麻水提取物、醇提取物、三萜类化合物为原料在制备抗乙型肝炎药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎是感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)引起的一种常见传染病和多发病，易转化为慢性，甚至发展为肝硬化、肝癌。该病发病的复杂性及转变为慢性的难治性，尤其是发展至肝癌的严重性，使其成为当前医学界，尤其是我国医务人员广泛关注的焦点之一。目前研究表明，乙型肝炎的发病主要与免疫力低下、病毒持续感染以及进行性肝细胞损伤有关，而某些中药提取物可三方面并重，从而提高了疗效。我国中草药资源丰富，在防治乙型肝炎方面积累了大量的经验，加之中草药不良反应小，价格便宜，因而从传统中药和天然药物资源中寻找有效的抗乙型肝炎病毒药物是一个行之有效的途径。

山芝麻系梧桐科植物山芝麻(Helicteres angustifolia L.)的根，能清热解毒，主要用于感冒发热、肺热咳嗽、咽喉肿痛、麻疹等。至今，对山芝麻公开报道的研究主要集中在其化学成分的分离、鉴定方面，其药效学研究很少，抗乙型肝炎的研究则未见报道。我们首次对山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜类化合物)在治疗乙型肝炎方面进行了系列的实验研究，发现其提取物具有良好的抗乙肝病毒的作用，疗效稳定，停药后没有出现反跳现象，且毒副作用小，具有非常好的研发前景。

发明内容

本发明的目的是提供中药山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜类化合物)在制备抗乙型肝炎药物中的应用，其中山芝麻水提取物和醇提取物是分别用水和75％乙醇按常规法提取得到的物质，而山芝麻三萜类化合物则是依次用乙醇提取、AB-8大孔树脂柱分离得到的三萜类化学物质的混合物，即总三萜类。

本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分：

一、山芝麻提取物的制备

1、山芝麻水提取物的制备：

山芝麻药材饮片，加10倍量水提取2次，每次1.5h，合并提取液，60℃减压恒温干燥即得山芝麻水提取物。

2、山芝麻醇提取物的制备：

山芝麻药材饮片，加10倍量75％乙醇浸泡30min，第1次回流提取2h，回收乙醇；接着再用8倍量75％乙醇回流提取1.5h，回收乙醇，合并两次提取液，60℃减压恒温干燥即得山芝麻乙醇提取物。

3、山芝麻三萜类化合物的制备：

山芝麻药材，用乙醇回流提取，上AB-8大孔树脂柱分离，最后60℃减压恒温干燥即得山芝麻三萜类化合物，以齐墩果酸为对照品，以5％香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，采用分光光度法在550nm测定样品的吸光度，测得山芝麻三萜类化合物纯度为79.8％(三萜类化合物含量测定方法参考文献：陆震鸣，陶文沂，许泓瑜，等.樟芝菌粉三萜类化合物含量的测定，中成药[J]，2008，30(3)：402-405)。

二、山芝麻提取物治疗乙型肝炎的实验研究

1、动物体内实验：山芝麻提取物对乙型肝炎病毒的抑制作用

采用健康成年的广西麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔注射DHBV-DNA强阳性病毒血清建立麻鸭乙肝动物模型，分别给予山芝麻水提取物、醇提取物和三萜类进行治疗14天，并于用药前第0天(0d)、用药第7天(7d)、用药第14天(14d)、停药第7天(P7)，分别从胫静脉采血，分离血清，采用FQ-PCR法、ELISA法、生化指标试剂盒法分别检测血清DHBV-DNA、DHBsAg和肝功能生化指标(包括：清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和超氧化物歧化酶(S0D)的含量)。此外，于停药第7天(P7)，分别剖杀各组试验动物，各取小块肝组织固定于10％甲醛溶液，石蜡切片，用HE染色，病理检查。

实验结果发现，山芝麻水提物、醇提物和三萜类能明显降低鸭血清乙型肝炎病毒DHBV-DNA水平、乙肝血清标志物DHBsAg含量和ALT/AST的含量，显著提高血清SOD的活性，3种提取物作用程度均与用药剂量及用药时间呈正相关，并且停药后没有出现反跳现象。病理检查显示一定剂量的山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)可改善病变的肝脏组织。拉米夫定阳性对照药治疗，在治疗过程中可明显抑制乙肝病毒量，但停药后即显著回升，病毒含量变化总体表现为用药时持续下降、停药即出现反跳的规律。山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)与拉米夫定比较，总体上看起效比较慢，但其抑制病毒的作用平稳而持久且没反跳现象，提示山芝麻提取物抑制体内乙肝病毒的机制不同于拉米夫定，在长期服药用于治疗慢性乙型肝炎方面具有明显的优势。

2、体外细胞实验：山芝麻提取物对乙肝病毒的抑制作用

采用HepG2.2.15细胞模型，运用荧光定量PCR法、ELISA法，检测山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)对乙肝病毒DNA、HBsAg/HBeAg的抑制作用。结果表明，山芝麻提取物对HBV DNA、HBsAg/HBeAg具有显著的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。体外实验的结果与动物实验的结果基本相符，都说明了山芝麻提取物具有明显的抑制乙肝病毒的作用。

3、提高机体免疫实验：观察山芝麻提取物对免疫性肝损伤的保护作用

静脉注射刀豆蛋白A(Con A)造成小鼠免疫性肝损伤，采用流式细胞术测定给予山芝麻提取物治疗后全血中CD₃ ⁺、CD₄ ⁺、CD₈ ⁺T细胞亚群比率。结果显示，山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)各剂量组外周血CD₃ ⁺和CD₄ ⁺T细胞百分率及CD₄ ⁺/CD₈ ⁺比值明显高于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，而CD₈ ⁺T细胞百分率明显低于模型组。提示，一定剂量的山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)能提高外周血T淋巴细胞亚群(CD₃ ⁺、CD₄ ⁺和CD₄ ⁺/CD₈ ⁺)的比率，减少其向肝脏的浸润，从而减小其细胞毒性作用对肝细胞的损伤。

总之，本发明首次对山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类化合物)进行了抗乙型肝炎的研究，体外和体内实验表明，山芝麻提取物可明显抑制乙肝病毒，减轻乙肝炎症，缓解肝脏组织细胞损伤，且作用稳定持久，没有反跳现象，优于目前临床常用的西药拉米夫定，对防治乙肝具有独特优势。山芝麻提取物用于治疗乙肝具有非常好的研发前景。可用于生产片剂、颗粒剂、合剂等剂型的治疗乙肝的中药制剂。

具体实施方式

实验例

一、山芝麻提取物的制备

1、山芝麻水提取物的制备：

山芝麻药材饮片1000g，加10升水提取2次，每次1.5h，合并提取液，60℃减压恒温干燥得268.9g山芝麻水提取物。

2、山芝麻醇提取物的制备：

山芝麻药材饮片1000g，加10升75％乙醇浸泡30min，第1次回流提取2h，回收乙醇；接着再用8升75％乙醇回流提取1.5h，回收乙醇，合并两次提取液，60℃减压恒温干燥即得山芝麻乙醇提取物113.5g。

3、山芝麻三萜类化合物的制备：

山芝麻1000g，加60％乙醇浸1h，回流提取，第1次8000ml提2h，第2次8000ml提1.5h，合并提取液，减压回收乙醇至无乙醇味，将浓缩物加蒸馏水溶解过滤。将滤液上(40mm×800mm)AB-8大孔树脂柱，用2倍量的蒸馏水洗涤树脂柱，再用2倍量80％乙醇洗脱，流脱流速为50-60滴/min(约2-2.5ml/min)。收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，在60℃的减压恒温干燥箱中浓缩、干燥，得16.326g山芝麻三萜类化合物。树脂柱用3倍量的甲醇再生。

以齐墩果酸为对照品，以5％香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，采用分光光度法在550nm测定样品的吸光度，测得山芝麻三萜类化合物纯度为79.8％(三萜类化合物含量测定方法参考文献：陆震鸣，陶文沂，许泓瑜，等.樟芝菌粉三萜类化合物含量的测定，中成药[J]，2008，30(3)：402-405)。

二、山芝麻提取物治疗乙型肝炎的实验研究

1、动物体内实验：山芝麻提取物对乙型肝炎病毒的抑制作用

实验方案：

(1)广西麻鸭乙肝动物模型的建立：采用健康成年的广西麻鸭产的蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔注射0.2ml DHBV-DNA强阳性病毒血清。接种7d后，分别从胫静脉采血约0.2-0.3ml左右，装入一次性Eppendoff管中，整个过程注意不要交叉污染。4000rpm离心5min，取血清。-20℃保存备用。采用PCR法检测筛选出感染阳性鸭。

(2)实验分组及用药：经PCR法检测筛选出感染阳性鸭，饲养至13日龄作为实验动物进行药物治疗试验。将80只鸭随机分为8组，每组10只。①模型组：等量的生理盐水；②拉米夫定组：灌胃给予拉米夫定50×10^-3g.kg^-1.d^-1；③山芝麻水提取物高剂量组：2.689g.kg^-1.d^-1；④山芝麻水提取物低剂量组：1.345g.kg^-1.d^-1；⑤山芝麻乙醇提取物高剂量组：1.135g.kg^-1.d^-1；⑥山芝麻乙醇提取物低剂量组：0.568g.kg^-1.d^-1；⑦三萜类高剂量组：0.163g.kg^-1.d^-1；⑧三萜类低剂量组：0.081g.kg^-1.d^-1。各组每天早上8-9点钟左右灌胃给药，1天1次，连续14d，实验期间动物自由取食和饮水。并于用药前0d、用药7d、用药14d、停药7d(P7)时，分别从胫静脉采血，每只0.5ml左右，分离血清，于-20℃保存备用。

(3)FQ-PCR检测血清DHBV-DNA：①DHBV-DNA提取：采用直接加热法。每次取血清100μl，沸水浴10min，10000rpm离心5min。②加样：2×SYBR PremixEx Taq^TM12.5μl；10μM上游引物1.0μl；10μM下游引物1.0μl；加无菌双蒸水至23μl；血清提取物2.0μl。③FQ-PCR反应条件：95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共反应45个循环。④FQ-PCR的结果判读：扩增过程及数据的储存和分析均由仪器及自带的软件自动完成。

(4)血清DHBsAg值检测：采用ELISA快速法、酶标仪(美国Bio-Rad公司，Model450)490nm读取0.D值。

(5)肝功能生化指标测定：各组血清，用全自动分析生化仪测各组鸭血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。

(6)各组肝脏病理(HE染色)检测：于停药7d分别剖杀各组试验动物，各取小块肝组织固定于10％甲醛溶液，石蜡切片，用HE染色，病理检查。

实验结果：

(1)对乙肝病毒的的抑制作用

与模型组比较，山芝麻水提物、醇提物和三萜类各剂量组在给药7d、14d和停药7d鸭血清DHBV-DNA拷贝数均有明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，下降程度与用药剂量及用药时间相关，并且停药后没有出现反跳现象，仍能维持在较低水平(P＜0.05)。拉米夫定组用药后，血清DHBV-DNA拷贝数开始明显下降，第14d下降到最低值，停药7d后DHBV-DNA拷贝数即显著回升，病毒含量变化总体表现为用药时持续下降、停药即出现反跳的规律。山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)组与拉米夫定组比较，总体上看起效比较慢，但其抑制病毒复制的作用平稳而持久，提示山芝麻提取物抑制体内乙肝病毒复制的机制不同于拉米夫定，在长期服药用于治疗慢性乙型肝炎方面具有明显的优势。实验结果见表1。

表1治疗前后鸭血清DHBV-DNA水平比较(

n＝10Copy/ml)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；与用药前比较：^△p＜0.05，^△△p＜0.01

(3)对血清DHBsAg的抑制作用

模型组在整个实验过程中血清DHBsAg OD值基本稳定，拉米夫定组用药7-14d血清DHBsAg OD值持续降低(P＜0.01)，至停药7d后出现回升现象。山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)组从用药7d开始血清DHBsAg OD值显有著降低(P＜0.05或P＜0.01)；停药后，山芝麻提取物组DHBsAg OD值与给药前比较，仍有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。实验结果提示，山芝麻提取物能明显降低乙型肝炎的血清标志物HBsAg，进一步证实了山芝麻提取物具有明显的抑制乙型肝炎病毒的作用。结果见表2。

表2治疗前后鸭血清DHBsAg OD值的变化情况(

n＝10)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；与用药前比较：^△P＜0.05，^△△p＜0.01

(4)对肝脏炎症的抑制作用

与模型组比较，山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)组、拉米夫定组用药后7d-14d，血清ALT、AST的含量均明显降低、而SOD活性明显升高(P＜0.05或P＜0.01)；停药后7d，山芝麻提取物高剂量组ALT、AST仍能维持在较低水平(P＜0.05)，而拉米夫定组ALT、AST则出现明显反跳现象。实验结果提示，山芝麻提取物能抑制乙型肝炎引起的炎症，对损伤的肝细胞具有明显的保护作用。结果见表3-表5。

表3治疗前后鸭血清ALT水平变化情况(

n＝10)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；与用药前比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01

表4治疗前后鸭血清AST水平变化情况(

n＝10)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；与用药前比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01

表5治疗前后鸭血清SOD活性变化情况(

n＝10)

注：与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01；与用药前比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01

(5)对乙型肝炎肝脏组织病理的改善作用

肉眼观察各组鸭肝脏，色泽鲜嫩暗红，表面光滑，质地柔软，未扪及结节。HE染色镜下观察(×400)，模型组肝细胞出现炎性细胞浸润，周边部分肝脏细胞肿胀，弥漫性重度脂变；治疗后拉米夫定组和山芝麻各提取物高剂量组炎症有不同程度减轻，部分组织汇管区小叶间隔可见炎症细胞浸润，结构基本完整，变性肝细胞减少；低剂量组炎症改善不明显，可见炎症细胞浸润及桥接坏死。病理检查结果显示，一定剂量的山芝麻提取物对乙型肝炎所致的病变肝脏组织有明显的改善作用。

2、体外细胞实验：山芝麻提取物对乙肝病毒的抑制作用

2.1山芝麻提取物对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

实验方案：

(1)山芝麻提取物含药血清的制备

3月龄Wistar大鼠80只，随机分为8组，每组10只。①空白对照组：等量的生理盐水；②阳性对照组：ACV 0.1mg.(kg.d)^-1；③山芝麻水提取物高剂量组：2.689g.kg^-1.d^-1；④山芝麻水提取物低剂量组：1.345g.kg^-1.d^-1；⑤山芝麻乙醇提取物高剂量组：1.135g.kg^-1.d^-1；⑥山芝麻乙醇提取物低剂量组：0.568g.kg^-1.d^-1；⑦三萜类高剂量组：0.163g.kg^-1.d^-1；⑧三萜类低剂量组：0.081g.kg^-1.d^-1。各组动物在同样条件下饲养，均以每日2次，早晚各1次空腹灌胃，连续给药7天。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12h)后2h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃30min灭活处理，经0.45μm的微孔滤膜，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。

(2)荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测HBV DNA

取HepG 2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×10⁴cell·mL^-1，加入24孔细胞培养板，每孔900μL，置CO₂孵箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，分别加入各组含药血清100μL，每个浓度3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养72h后，分别吸出上清液于1.5mL灭菌Eppendor管中，-20℃保存，统一待检。再次加入上述含药血清的培养液继续培养72h后，分别吸出上清液于1.5mL灭菌Eppendorf管中，-20℃保存，统一待检。

按试剂盒方法提取样品HBV DNA。HBV DNA定量标准品由深圳匹某公司直接提供。各反应管放入FQ-PCR仪，按以下条件进行扩增：94℃预变性1min，95℃变性5s，60℃退火、延伸20s。共反应42个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。

实验结果：

与空白对照组比较，给含药血清培养72h时，山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)各剂量组HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA的拷贝数显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；培养144h时，山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)高剂量组HBV DNA水平明显降低(P＜0.05)，而低剂量组HBV DNA水平变化不明显。比较72h和144h的抑制率，山芝麻提取物各剂量组对细胞的抑制作用均有随着时间的延续抑制率越高的趋势。总体上看，山芝麻提取物对HBV DNA具有显著的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。见表6。

表6山芝麻提取物含药血清对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制作用(

n＝3)

与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

2.2山芝麻提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制作用

实验方案：

(1)山芝麻提取物含药培养液的配制

山芝麻水提取物26.89g、醇提取物11.35g、三萜类1.633g，分别加水至100ml溶解，分别经0.45μm的微孔滤膜，再经0.22μm微滤膜过滤除菌后，即得山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜类)母液，置4℃冰箱保存备用。实验时用完全培养液将母液稀释成所需终浓度的应液。

(2)山芝麻提取物的细胞毒性实验(MTT法)

取HepG 2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×10⁴cell·mL^-1，加入96孔培养板中(每孔100μL)，置CO₂孵箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液，加入用完全培养液倍比稀释过的山芝麻提取物100mL(倍比稀释方法：山芝麻水提取物、醇提取物、三萜类母液，分别用培养液梯度稀释成1、1/2、1/4、1/8、1/16倍浓度)。每个质量浓度设6个复孔。连续培养72h，培养结束前4h，每孔加入MTT 10μL，于CO₂孵箱中继续培养。4h后小心吸弃上清液后，每孔加DMSO 100μL，微量振荡器振荡5min，使结晶紫完全溶解。自动酶标仪(检测波长570nm，参考波长630nm)读取各孔OD值，记录结果。按Reed-Muench法计算半数细胞毒浓度(TC₅₀)和最大无毒浓度(TC₀)。

(3)ELISA法定量检测HBsAg和HBeAg

将2×10⁴cell·mL^-1的细胞悬液加24孔细胞培养板，每孔1mL，置CO₂孵箱(37℃5％CO₂)中培养24h后，细胞贴壁且生长良好，除去全部培养液，根据细胞毒性试验结果，分别加入无毒浓度以下系列2倍稀释成5个终质量浓度为：山芝麻水提取物100，50，25，12.5，6.25mg·L^-1；醇提取物180，90，45，22.5，11.25mg·L^-1；三萜类200，100，50，25，12.5mg·L^-1的应用液，每个浓度设3个复孔。以等量的完全培养液为空白照，以拉米夫定为阳性对照药。连续培养72h后，分别吸出上清液置于1.5mL灭菌Eppendorf管中，-20℃保存，统一待检。

采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，结果以抑制率表示，药物对抗原的抑制百分率＝{1-[(实验孔抗原OD值-空白OD值)/(对照孔抗原OD值-空白OD值)]}×100％，并按Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)]。

实验结果：

(1)药物毒性实验

不同稀释倍数的药物加于单层HepG 2.2.15细胞上，连续培养72h后，观察细胞生长形态，检测有无病变，并以MTT法测定细胞的活力，按照Reed-Muench法计算得出：山芝麻水提取物TC₀＝105.7mg·L^-1，TC₅₀＝482.1mg·L^-1；醇提取物TC₀＝198.4mg·L^-1，TC₅₀＝576.9mg·L^-1；三萜类TC₀＝211.6mg·L^-1，TC₅₀＝614.8mg·L^-1。

(2)病毒抗原抑制试验

HepG 2.2.15在24孔培养板上生长至单层，加入不同稀释倍数的山芝麻提取物，同时设细胞对照组和药物对照组，培养72h，分别取上清液测定HBsAg和HBeAg，并与细胞对照组比较，计算抑制率、IC₅₀以及TI。对HBsAg的抑制作用实验结果显示，山芝麻水提取物的IC₅₀＝7.3mg·L^-1，治疗指数TI＝66；醇提取物IC₅₀＝6.8mg·L^-1，治疗指数TI＝84；三萜类IC₅₀＝12.9mg·L^-1，治疗指数TI＝47。对HBeAg，山芝麻水提取物IC₅₀＝14.6mg·L^-1，TI＝33；醇提取物IC₅₀＝18.6mg·L^-1，治疗指数TI＝31；三萜类IC₅₀＝20.3mg·L^-1，治疗指数TI＝30。实验结果表明，山芝麻提取物(水提取物、醇提取物、三萜类)对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg有明显抑制作用，其作用与浓度呈明显的正相关。

3、提高机体免疫实验：观察山芝麻提取物对免疫性肝损伤的保护作用

实验方案：

(1)分组及造模

将90只昆明种小鼠随机分为：①正常对照组，②模型组，③阳性对照组(日达仙，4.2μg.kg^-1)，④山芝麻水提取物高剂量组：5.378g.kg^-1.d^-1；⑤山芝麻水提取物低剂量组：2.689g.kg^-1.d^-1；⑥山芝麻乙醇提取物高剂量组：2.270g.kg^-1.d^-1；⑦山芝麻乙醇提取物低剂量组：1.135g.kg^-1.d^-1；⑧三萜类高剂量组：0.326g.kg^-1.d^-1；⑨三萜类低剂量组：0.163g.kg^-1.d^-1，每组10只。各给药组灌胃(0.2mL/10g)给予相应药物，正常对照组和模型组灌胃给予等量生理盐水，每日1次，15天后，除正常对照组外，其余各组均尾静脉注射20mg.kg^-1ConA，禁食12h后，全部动物摘眼球取全血，其中一部分血置经16％肝素钠润过的EP管中制成抗凝血，另一部分离心(3000r/min，离心10min)取血清-20℃冻存备用。

(2)T细胞亚群检测

①取CD3-FITC和CD4-PE各加入50μl全血；另一试管中取CD3-FITC和CD8-TC各加入50μl全血，暗处孵育15分钟。

②每管加入450μl红细胞溶解液。

③暗处孵育15分钟。

④1000r/min离心5分钟，弃上清。

⑤沉淀加0.5ml PBS，重新悬浮。

⑥过300目尼龙网。

⑦上机检测。

⑧用Cellquest软件分析散点图。

实验结果：

模型组小鼠全血中CD₃ ⁺、CD₄ ⁺比率较正常对照组明显下降，而CD₈ ⁺显著上升，与正常组比较差异均有显著性(P＜0.01)；与模型组比较，山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)各剂量组和日达仙组外周血CD₃ ⁺和CD₄ ⁺T细胞百分率及CD₄ ⁺/CD₈ ⁺比值明显高于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，而CD₈ ⁺T细胞百分率明显低于模型组。提示，一定剂量的山芝麻提取物(水提物、醇提物和三萜类)能提高外周血T淋巴细胞亚群(CD₃ ⁺、CD₄ ⁺和CD₄ ⁺/CD₈ ⁺)的比率，减少其向肝脏的浸润，从而减小其细胞毒性作用对肝细胞的损伤。结果见表7。

表7山芝麻提取物对免疫性肝损伤小鼠T淋巴细胞亚群的影响(

n＝10)

注：与模型组比较，^*P＜0.05；^**P＜0.01

Claims (3)

1.山芝麻水提取物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

2.山芝麻醇提取物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

3.山芝麻三萜类化合物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。