CN104586925B

CN104586925B - 红背叶根提取物及制备方法和在制备治疗乙肝药物的应用

Info

Publication number: CN104586925B
Application number: CN201510047509.6A
Authority: CN
Inventors: 吕志平; 刘强
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2035-01-29
Also published as: CN104586925A

Abstract

本发明公开了一种红背叶根提取物及制备方法和在制备治疗乙肝药物的应用，其包括醇提、离心浓缩、上大孔吸附树脂柱、乙醇洗脱、减压干燥，得到红背叶根有效部位提取物。本发明的提取工艺简便合理，得到的红背叶根有效部位提取物在抗鸭乙肝病毒实验中，3个剂量在7d,14d(T7,T14)可显著抑制血清DHBV DNA(P<0.01)，停药5d(P5)后DHBV DNA有所回升，但相对给药前仍有显著降低，说明具有较理想的抗乙肝病毒作用，是较有前途的候选药物，可应用于制备抗乙肝药物。

Description

红背叶根提取物及制备方法和在制备治疗乙肝药物的应用

技术领域

本发明属于中药领域，特别涉及一种红背叶根的有效部位提取物，还涉及该提取物的制备方法和用途。

背景技术

乙肝是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种严重危害人类健康的疾病，具有传染性强，流行面广和发病率高的特点。我国约有1.2亿乙肝病人及HBV携带者。研究发现，“无症状乙肝病毒携带者”中60％～70％肝活检病理报告为慢性迁延性肝炎或慢性活动性肝炎，长期的乙肝病毒感染可发展为肝硬化，甚至肝癌。乙肝病毒对我国居民的身体健康和生命安全造成了极大的危害。目前广泛用于临床治疗HBV感染的药物为干扰素(IFN)及核苷类药物。IFN是目前疗效较为肯定的抗HBV药物，但临床有效率仅为20％～30％，且副作用大、费用高，其应用受到一定限制。核苷类似药物拉米呋啶可抑制HBV-DNA多聚酶活性，治疗后患者血清中HBV-DNA滴度明显下降，但易出现耐药变异病毒株，且停药后病毒复制易反弹。化学合成药物的毒副反应及耐药变异病毒株的出现，使人们更加关注传统中医药疗法，因此从中药与天然药物中筛选有确切疗效的抗HBV药物是当前中药研究的一个热点。

红背叶根为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides(Benth.)Muell.–Arg.的根。别名红背娘、红帽顶(《广西中草药》)，红罗裙(广州空军《常用中草药手册》)。分布我国中部和东南、华南，通常以根、叶入药。其根味甘，性平。功效清热解毒，祛风除湿，散瘀止血，平喘，杀虫止痒。传统应用于治肠炎腹泻，痢疾，黄疸型肝炎，尿路感染和结石，肾炎，小便不利，血尿，血崩，白带，湿疹，荨麻疹，痈疮肿毒，疮疡久不收口等症。近代医学研究表明，红背叶根中具有止咳、祛痰作用，抗乙酰胆碱作用和轻度抑制金黄色与白色葡萄球菌作用。

红背叶根水提物及水提醇沉所得浸膏具有抗肝炎病毒和阻止肝纤维化的作用，可在临床上用以治疗慢性肝炎和肝硬化。研究结果表明红背叶根可显著抑制四氯化碳(CCL4)复合因素及酒精性肝纤维化大鼠血清中的致肝纤维化的两个重要因子(TGF-β1、TIMP-1)，且模型动物肝纤维指标(HA、Ⅲ型前胶原)，肝功指标(ALT、AST)都有显著降低，并有保肝、降酶、抗肝纤维化的作用。体外试验研究表明红背叶根可抑制HBV蛋白中HBeAg、HBsAg的表达，有一定的抗乙肝病毒作用。抗鸭乙肝病毒试验表明红背叶根有抑制体内D-HBV复制的作用，作用与剂量和用药时间相关。其作用较拉米夫定弱，但维持时间长，服药安全。临床应用试验表明慢性乙型肝炎患者给药每日红背叶根20克，水煎服。治疗4周后，所有患者症状均有一定的改善，尤其是缓解肝区不适较明显，患者肝功能均有不同程度改善；治疗12周后，治疗组与对照组比较，AST和改善蛋白代谢方面较为明显(P<0.05)。因此，对红背叶根进行有效部位抗乙肝的筛选及用途研究具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种红背叶根提取物及其制备方法，以及该提取物的用途。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种红背叶根提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)红背叶根药材用6-12倍量乙醇提取1-2小时，提取1-3次，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩；

(2)将步骤(1)所得浓缩液离心，上清液减压浓缩备用；

(3)将步骤(2)得到的浓缩液，以1.3-1.7柱体积/小时的流速，上大孔吸附树脂柱；

(4)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇洗脱，洗脱流速为2.3-2.7柱体积/小时；

(5)收集乙醇洗脱液减压干燥，粉碎后得到红背叶根有效部位提取物。

所述步骤(1)中乙醇浓度为60％-90％。

所述步骤(1)中乙醇浓度为70％-80％。

所述步骤(4)中乙醇浓度为20％-60％。

所述步骤(4)中乙醇浓度为30％-50％。

所述步骤(5)得到的红背叶根有效部位提取物是以生物碱类及黄酮类为主要活性成分的提取物。

由上述制备方法制得的红背叶根提取物。

上述红背叶根提取物在制备抗乙肝药物中的应用。

本发明的有益效果如下:

1.本发明的提取工艺简便合理，可以得到红背叶根有效部位提取物。

2.本发明的红背叶根提取物，在抗鸭乙肝病毒实验中，3个剂量在7d,14d(T7,T14)可显著抑制血清DHBV DNA(P<0.01)，停药5d(P5)后DHBV DNA有所回升，但相对给药前仍有显著降低。说明本发明提取物具有较理想的抗乙肝病毒作用，是较有前途的候选药物。

具体实施方式

本发明是一种红背叶根提取物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)红背叶根药材用6-12倍量乙醇提取1-2小时，提取1-3次，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩。优选的，步骤(1)中乙醇浓度为60％-90％，更优选的，乙醇浓度为70％-80％。红背叶根是双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides(Benth.)Muell.–Arg.的根。

(2)将步骤(1)所得浓缩液离心，上清液减压浓缩备用。

(3)将步骤(2)得到的浓缩液，以1.3-1.7柱体积/小时的流速，上中等极性或非极性的大孔吸附树脂柱。

(4)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇洗脱，洗脱流速为2.3-2.7柱体积/小时。优选的，步骤(4)中乙醇浓度为20％-60％，更优选的，乙醇浓度为30％-50％。

(5)收集乙醇洗脱液减压干燥，粉碎后即得到红背叶根有效部位提取物，该红背叶根有效部位提取物是以生物碱类及黄酮类为主要活性成分的提取物。

上述红背叶根有效部位提取物在制备抗乙肝药物中的应用。

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实施例。最优选实施例1。

实施例1

将红背叶根药材，用乙醇回流提取2次，乙醇浓度75％，加醇量为药材重量的10倍，提取时间90min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。

取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30-50％乙醇进行洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.38％。

实施例2

将红背叶根药材，用乙醇回流提取3次，乙醇浓度90％，加醇量为药材重量的12倍，提取时间120min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。

取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用30-60％乙醇进行洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.29％。

实施例3

将红背叶根药材，用乙醇回流提取1次，乙醇浓度60％，加醇量为药材重量的6倍，提取时间60min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。

取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用20-40％乙醇进行洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.31％。

实施例4

将红背叶根药材，用乙醇回流提取3次，乙醇浓度70％，加醇量为药材重量的7倍，提取时间80min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。

取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用40-50％乙醇进行洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.35％。

实施例5

将红背叶根药材，用乙醇回流提取1次，乙醇浓度120％，加醇量为药材重量的10倍，提取时间60min。合并提取液，滤过并减压浓缩，将浓缩液离心，取上清液减压浓缩备用。

取中等极性大孔吸附树脂，按与生药重量比1:2的比例装柱，然后将上述备用的浓缩液以1.5柱体积/小时的流速通过此大孔树脂柱，完全通过后，先用去离子水洗脱，再用40-60％乙醇进行洗脱，洗脱流速为2.5柱体积/小时。收集乙醇洗脱液，减压干燥、粉碎，得到红背叶根提取物。得率为0.27％。

实施例6药理实验例

为评价红背叶根提取物的抗HBV效果进行体内抗鸭乙肝病毒(DHBV)的实验研究。

1实验材料

1.1实验动物同日孵化三日龄广州麻鸭，雄性，质量(40-50)克。

1.2药物红背叶根提取物为实验例1制备的提取物(HE)；阳性对照药阿德福韦酯(ADV)，新银河化工有限公司；按常规方法制备红背叶根3种不同提取物：石油醚提取物(PE)，乙酸乙酯提取物(EE)，正丁醇提取物(BE)。

1.2试剂标准D-HBV阳性血清；DNA聚合酶(Takara公司)；引物设计(赛百盛生物工程有限公司合成)；上游引物(5’-GAT CCACTCCTGGGAAACAA-3’)；下游引物(5’-CAGACAGCGTGGCTAATTGA-3’)；NC膜(Amersham公司)；DHBV质粒；缺口翻译药盒；promega公司。

1.3仪器PCR仪(BIOMETRA)；紫外分光光度计(BIOMETRA)；ZF-25全自动凝胶成像分析系统。

2方法

2.1采血刚孵化的1日龄雏鸭，适应性养3天后，经胫静脉用1次性采血针采血约0.5mL，装入1次性Eppendorf管中，整个过程注意不要交叉污染。在离心机中以7000rpm离心4:15min后，取血清。鸭及血清均相应编号。

2.2常规PCR法筛选先天性感染的DHBV雏鸭PCR反应条件为：94℃5min；预变性之后94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；4℃保存。取PCR反应产物6μ1，加入上样缓冲液2μl，充分混匀后加入到在1.5％琼脂糖凝胶(含终浓度0.5μg/ml溴乙锭)电泳槽齿孔中，80V恒压电泳30分钟，凝胶图像分析系统下观察并照相，参照阳性血清和100bp DNALadder Marker印迹检测PCR结果，阳性血清在217bp附近可见明显条带。PCR筛选450只鸭子筛选出101只D-HBV阳性鸭子，斑点杂交发现有12只为假阳性，阳性率约为19.8％。

2.3分组及给药方法

将筛选出的先天感染鸭随机分为14组，每组平均约7只。红背叶根4种不同提取物：本发明提取物(HE)，石油醚提取物(PE)，乙酸乙酯提取物(EE)，正丁醇提取物(BE)均分高(high)、中(middle)、低剂量(low)组(简写h,m,l)，共12组，阳性对照药阿德福韦酯(ADV)组，模型对照组，一共14组。红背叶根4种提取物高、中、低剂量组则分别按12g·kg^-1、6g·kg^-1、3g·kg^-1生药量，ADV按15mg·kg^-1与蒸馏水混合制成水溶液，每天一次性灌胃。模型对照组以等体积生理盐水灌胃。每周复测体重一次，调整药量灌胃，共灌胃l4d。

2.4鸭血清DHBV检测

每组动物分别于给药前ld、给药后7d、给药后l4d、停药后5d自胫静脉采血，离心。收集血清。按缺口翻译试剂盒操作说明书，用印标记作探针，将40μL血清点于硝酸纤维膜上，进行斑点杂交，放射白显影图片斑点，在酶标仪上检测OD值(滤光片为490nm)，以OD值间接代表病毒载量。

2.5统计方法

数据用均数±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS13.0统计软件进行处理分析。重复测量数据采用一般线性模型(general linear model,GLM)的repeated measures和multivariate过程进行重复测量方差分析和多元方差分析,并进行不同时间点和不同组间的两两比较。P<0.05定为差异有统计学意义。

3结果

3.1治疗前后药物对鸭血清DHBV DNA的影响

结果见表1。表1显示不同时间点DHBV DNA变化无显著性差异；各组间DHBVDNA却存在显著差异；时间与分组间存在交互效应(F＝6.393，P＝0.000)。病毒对照组血清DHBV DNA水平稳定。阳性对照药阿德福韦酯(ADV)给药7d,14d(T7,T14)可显著抑制血清DHBV DNA(P<0.01)，停药5d(P5)后DHBV DNA显著回升。给药的提取物中，石油醚提取物高剂量组(PE-h)在治疗14d后血清DHBV DNA有下降趋势(P<0.01)，停药5天后仍保持下降趋势(P<0.05)。效果最好的是本发明提取物，3个剂量在7d,14d(T7,T14)可显著抑制血清DHBVDNA(P<0.01)，停药5d(P5)后DHBV DNA有所回升，但相对给药前仍有显著降低。说明本发明提取物具有较理想的抗乙肝病毒作用，是较有前途的候选药物。

表1 各组鸭血清DHBV DNA的变化比较

*P<0.05，**P<0.01，同一时间点与病毒对照组比较；ΔP<0.05，ΔΔP<0.01，同一组间给药后不同时间点(T7，T14，P5)与给药前T0比较。

Claims

1.一种红背叶根提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)红背叶根药材用6-12倍量乙醇提取1-2小时，提取1-3次，合并乙醇提取液，过滤后减压浓缩，其中乙醇浓度为60％-90％；

(2)将步骤(1)所得浓缩液离心，上清液减压浓缩备用；

(4)用去离子水洗脱除去杂质后，再用乙醇洗脱，洗脱流速为2.3-2.7柱体积/小时，其中乙醇浓度为20％-60％；

2.根据权利要求1所述的红背叶根提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中乙醇浓度为70％-80％。

3.根据权利要求1所述的红背叶根提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中乙醇浓度为30％-50％。

4.根据权利要求1所述的红背叶根提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)得到的红背叶根有效部位提取物是以生物碱类及黄酮类为主要活性成分的提取物。

5.由权利要求1-4任一项权利要求所述制备方法制得的红背叶根提取物。

6.权利要求5所述红背叶根提取物在制备抗乙肝药物中的应用。