CN103919799B

CN103919799B - 马齿苋多糖在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用

Info

Publication number: CN103919799B
Application number: CN201410160265.8A
Authority: CN
Inventors: 林恒; 孙凤军; 王显凤
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2014-04-21
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2034-04-21
Also published as: CN103919799A

Abstract

本发明公开了马齿苋多糖在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用，动物实验结果表明马齿苋多糖能够显著降低大鼠血清中ALT、GPP、LDH等生化指标的活性，并能够减轻肝细胞变性坏死，保护了肝细胞的稳定性，进而促进肝细胞的增殖，具有良好的抗肝纤维化作用，同时本发明还发现马齿苋多糖具有毒性低、副作用小等优点，使用安全，能够用于预防或治疗肝纤维化相关疾病。

Description

马齿苋多糖在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及马齿苋多糖在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。

背景技术

肝纤维化是各种慢性肝病发展成肝硬化的必经阶段，可由多种致病因素（常见的病因为病毒性肝炎，慢性酒精中毒，遗传和代谢性疾病，化学毒物或药物，肝淤血，寄生虫，脂肪肝等）引起。各种肝病所致的肝纤维化严重危害人类健康，给家庭、社会带来沉重的负担。因此，研究开发治疗肝纤维化且价廉的药物具有重要的社会意义和经济意义。

目前，各种消除肝纤维化的措施在效果上各有不尽如人意的地方，在寻找安全有效的抗肝纤维化方法中，传统中药由于副作用小，开发成本低成为近年来抗肝纤维化研究的热点。中药马齿苋为民间常用中草药，来源于马齿苋科马齿苋属植物马齿苋PortulacaoleraceaL.的干燥全草，性寒味酸，具有清热解毒，利水去湿，散血消肿等功效，主治痢疾、肠炎、肾炎、产后子宫出血、便血、乳腺炎等多种疾病。现代药理学研究表明，马齿苋提取物具有抗炎、抗氧化、降血脂等药理作用。经过对马齿苋进行系统研究，并结合文献，发明人发现，马齿苋多糖是马齿苋生物活性的主要物质基础之一，但马齿苋多糖是否具有抗纤维化作用，至今未见文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供马齿苋多糖在制备抗肝纤维化的药物中的应用，其治疗效果好、安全性高。

为实现上述发明目的，提供如下技术方案：

马齿苋多糖在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。

进一步，马齿苋多糖在制备预防或治疗肝细胞脂肪变性、肝细胞坏死或/和肝纤维组织增生的药物中的应用。此外，马齿苋多糖还可以降低血清中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、谷氨酰转移酶（GGP）、血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白/球比（A/G）、碱性磷酸酶（ALP）和乳酸脱氢酶（LDH）等肝功能系列生化指标。

本发明中马齿苋多糖可以采用文献报道的方法制得，优选为本发明的方法制备，该方法不需要添加有害成分，具体为：称取马齿苋，加水煎煮，离心收集上清液，然后将上清液用大孔吸附树脂D101纯化，将纯化后的上清液浓缩后用体积分数为65-80%的乙醇沉淀，再将沉淀加入相当于沉淀重量3-5倍水煮沸10-20分钟，冷却至10-30℃，过滤，收集过滤液，滤液用体积分数为65-85%的乙醇沉淀，收集沉淀，重复加水煮沸和乙醇沉淀步骤，最后沉淀经干燥得马齿苋多糖。

优选的，所述加水煎煮为加入相当于药材重量10倍的水煎煮两次，每次2小时。

优选的，所述离心为在转速为3000～4000转/分条件下离心20分钟。

优选的，所述大孔吸附树脂D101纯化为将上清液加入活化的大孔吸附树脂D101柱中，然后用相当于树脂重量5倍的蒸馏水洗脱。

优选的，所述乙醇沉淀的条件为在温度为0-8℃条件下静置12-48小时。

本发明的有益效果在于：本发明公开了马齿苋多糖在制备抗肝纤维化的药物中的应用，其治疗效果好，能够有效降低肝功能系列生化指标，降低肝细胞脂肪变性、肝细胞坏死或/和肝纤维组织增生的发生，本发明不仅拓宽了马齿苋多糖的应用范围，同时还提高了马齿苋多糖的市场价值，同时安全性好，在高剂量用药范围内未见急性毒性反应，因此本发明为抗肝纤维化治疗提供了一种安全、高效的备选药物，利于满足临床治疗的多方面需求。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对马齿苋多糖的抗肝纤维化作用及其抗肝纤维化效果进行详细的描述。

实施例1

马齿苋多糖的制备，具体步骤如下：

方法1：称取2kg马齿苋药材，加入相当于药材重量10倍的水煎煮两次，每次2小时，过滤，合并滤液，将滤液在转速为3000转/分条件下离心20分钟，收集上清液，将上清液活化的大孔吸附树脂D101柱，然后用相当于树脂重量5倍的蒸馏水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至相当于药材重量的1倍，然后加入乙醇至乙醇的体积分数为65%，0℃冷藏静置12小时，除去上清液，收集沉淀；向沉淀中加入相当于沉淀重量3倍的水，煮沸10分钟，放置至室温（10～30℃），过滤，收集滤液，向滤液中加入乙醇使乙醇体积分数为65%，0℃冷藏静置12小时，除去上清液，收集沉淀，重复加水煮沸、乙醇沉淀步骤2次，得马齿苋多糖沉淀，干燥得马齿苋多糖。

方法2：称取2kg马齿苋药材，加入相当于药材重量10倍的水煎煮两次，每次2小时，过滤，合并滤液，将滤液在转速为4000转/分条件下离心20分钟，收集上清液，将上清液活化的大孔吸附树脂D101柱，然后用相当于树脂重量5倍的蒸馏水进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至相当于药材重量的2倍，然后加入乙醇至乙醇的体积分数为80%，8℃冷藏静置48小时，除去上清液，收集沉淀；向沉淀中加入相当于沉淀重量5倍的水，煮沸20分钟，放置至室温（10～30℃），过滤，收集滤液，向滤液中加入乙醇使乙醇体积分数为85%，8℃冷藏静置48小时，除去上清液，收集沉淀，重复加水煮沸和乙醇沉淀3次，得马齿苋多糖沉淀，干燥得马齿苋多糖。

本实施例制得的马齿苋多糖纯度为85.74%。

实施例2

一、马齿苋多糖的抗肝纤维化作用

1、实验动物

选取体重为160～180g的Wistar大鼠，雌雄各半。Wistar大鼠由解放军第三军医大学动物中心提供。

2、病理学分级方法

肝细胞脂肪变性病理学分级标准：（-）肝细胞内未见空泡变性；（+）部分肝细胞（<25%）内出现空泡；（++）较多的肝细胞（25%～50%）内出现空泡；（+++）大量肝细胞（>50%）内出现空泡。

肝细胞坏死病理学分级标准：(-)肝细胞未见坏死；(+)肝细胞呈点、灶状坏死，散在分布；(++)肝细胞呈点、灶状坏死，分布范围较广；(+++)肝细胞呈大片状或桥接坏死、弥散分布。

肝纤维组织增生病理学分级标准：(-)肝组织正常；(+)胶原纤维含量增加，很少形成条索分隔肝小叶，可见汇管区扩大，纤维化；（++）胶原纤维呈细条索状分隔肝小叶、散在分布，表现为不完全分隔假小叶；(+++)胶原纤维呈较宽的条索状分隔肝小叶，表现为完全分隔成假小叶。

3.动物分组及模型制作方法

将Wistar大鼠60只，随机分为预防组和治疗组，预防组又分为预防马齿苋多糖组、预防护肝片组和预防模型组，治疗组又分为治疗马齿苋多糖组、治疗护肝片组和治疗模型。造模采用四氯化碳皮下注射法，皮下注射四氯化碳原液（0.5mL/100g），以后每周皮下注射40%四氯化碳2次（0.3ml/100g），进行反复强化刺激，共持续7周。

预防组：预防马齿苋多糖组在造模的同时给马齿苋多糖，给药途径采用灌胃给药法（2mL/100g，1次/d），剂量为临床成人用药量的10倍；预防护肝片组在造模的同时给用生理盐水制成的护肝片混悬液（0.9mL/100g，1次/d）；预防模型组在造模的同时给等量的水。处理7周，然后在第8周左心室取血离心取血清测生化指标；处死后称体重及肝、脾重量并计算肝、脾指数；剖腹取肝组织，肝组织固定在10%的中性甲醛液中，用于病理学的HE染色和天狼猩红染色，HE染色用于观察肝细胞脂肪变性和肝细胞坏死情况，天狼猩红染色用于观察肝纤维组织增生情况。

治疗组：治疗马齿苋多糖组造模成功后（造模时间为7周），从第8周开始给药马齿苋多糖；治疗护肝片组从第8周开始给药护肝片；治疗模型组在造模成功后给等量的生理盐水，处理7周，给药剂量和方法同预防组，共14周，在第15周左心室取血离心取血清测生化指标；动物处死后的处理同预防组。

处理后采用SPSS10.0统计软件进行检验。

（1）检测预防组各生化指标

采用全自动生化分析仪检测预防组中马齿苋多糖组、护肝片组和预防模型组大鼠血清中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、谷氨酰转移酶（GGP）、血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白/球比（A/G）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）肝功能系列生化指标，结果如表1所示。

表1、预防组模型组大鼠肝功能系列生化指标检测结果（n=10）

注：*表示与模型组比较有显著性差异，P＜0.05；**表示与模型组比较有极显著性差异，P＜0.01。

由表1可知，预防组中马齿苋多糖组、预防护肝片组与预防模型组ALT和GGP活力相比较，差异有统计学意义（P<0.05），而马齿苋多糖组与预防护肝片组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）；马齿苋多糖组、预防护肝片组与预防模型组A/G、TP和ALB相比较，差异有统计学意义（P<0.05），马齿苋多糖组与预防护肝片组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）；马齿苋多糖组、预防护肝片组与预防模型组ALP和LDH活力相比较，差异也有统计学意义（P<0.01、P<0.05）；而马齿苋多糖组与预防护肝片组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。上述结果表明，马齿苋多糖具有护肝的效果。

（2）检测预防组大鼠的肝、脾指数

检测预防组中马齿苋多糖组、护肝片组和预防模型组肝、脾指数，检测结果如表2所示。

表2、预防组大鼠的肝、脾指数(n=10)

组别	肝指数（g/100g）	脾指数（g/100g）
			预防模型组	4.2985±0.5234	0.4137±0.0634
护肝片组	4.9381±0.6473*	0.3237±0.0478*
			马齿苋多糖组	5.6024±0.9001*	0.2793±0.0884*

注：*表示与模型组比较有显著性差异，P＜0.05

由表2可知，马齿苋多糖组和预防护肝片组的肝、脾指数与预防模型组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；而马齿苋多糖组与预防护肝片组的肝、脾指数差异均无统计学意义(P>0.05)。

（3）预防组大鼠肝脏的病理学变化

用于病理学的HE染色和天狼猩红染色观察大鼠肝脏变化，结果如表3所示。

表3、预防组大鼠肝脏的病理学变化（n=10）

注：*表示与模型组比较有显著性差异，P＜0.05

由表3可知，马齿苋多糖组、预防护肝片组与预防模型组相比，肝细胞脂肪变性的大鼠数量较少，并且马齿苋多糖组肝细胞内未见空泡变性的数量大鼠数量更多，表明马齿苋多糖防止肝细胞脂肪变性的效果优于护肝片；并且马齿苋多糖组的肝细胞坏死和肝纤维组织增生的大鼠数量小于护肝片组合预防模型组，表明马齿苋多糖预防肝细胞坏死和肝纤维组织增生的效果优于护肝片。

（4）测定治疗组大鼠各项生化指标

采用全自动生化分析仪检测治疗组中马齿苋多糖组、护肝片组和预防模型组大鼠血清中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、谷氨酰转移酶（GGP）、血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白/球比（A/G）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）肝功能系列生化指标，结果如表4所示。

表4、治疗组模型组大鼠肝功能系列生化指标检测结果（n=10）

注：*表示与模型组比较有显著性差异，P＜0.05。

由表4可知，治疗马齿苋多糖组、治疗护肝片组AST活力、BUN含量与治疗模型组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）；而治疗马齿苋多糖组与治疗护肝片组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。

（5）检测治疗组大鼠的肝、脾指数

检测治疗组中马齿苋多糖组、护肝片组和预防模型组肝、脾指数，检测结果如表5所示。

表5、治疗组大鼠的肝、脾指数（n=10）

组别	肝指数（g/100g）	脾指数（g/100g）
			治疗模型组	4.9872±0.4833	0.4592±0.07255 -->
护肝片组	4.9545±0.4473	0.3049±0.0256*
			马齿苋多糖组	4.8376±0.5001	0.3127±0.0399*

注：*表示与模型组比较有显著性差异，P＜0.05。

由表5可知，治疗马齿苋多糖组、治疗护肝片组和治疗模型组三组间肝指数差异不显著，而治疗马齿苋多糖组和治疗护肝片组与治疗模型组的脾指数相比，差异有统计学意义（P<0.05）；而治疗马齿苋多糖组与治疗护肝片组脾指数相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

（6）治疗组大鼠肝脏的病理学变化

用于病理学的HE染色和天狼猩红染色观察大鼠肝脏变化，结果如表6所示。

表6、治疗组大鼠肝脏的病理学变化（n=10）

组别

肝细胞脂肪变性

肝细胞坏死

肝纤维组织增生

	-	+	++	+++	-	+	++	+++	-	+	++	+++
													治疗模型组	0	0	1	9	0	0	6	4	0	0	4	6
护肝片组	1	4	4	1*	0	6	3	1*	1	5	2	2*
													马齿苋多糖组	2	3	4	1*	0	6	4	0*	1	6	3	0*

注：*表示与模型组比较有显著性差异，P＜0.05

由表6可知，治疗马齿苋多糖组与护肝片组肝细胞脂肪变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生与模型组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；而治疗马齿苋多糖组和护肝片组肝细胞脂肪变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

二、马齿苋多糖的急性毒性

1、口服给药的急性毒性试验

取体重20±2g的小鼠40只，雌雄各半，每只小鼠按照3.2g/kg（体重）的剂量给予马齿苋多糖（相当于生药160g/kg），每天经口灌胃给药3次，连续给药7天，观察小鼠有无急性毒性反应。观察结果显示，在口服给予小鼠相当于人体用药剂量80倍的马齿苋多糖时，未见小鼠死亡，未测得LD₅₀。表明口服相当于人体用药剂量80倍的马齿苋多糖时未见急性毒性反应。

2、腹腔注射给药的急性毒性试验

取体重20±2g的小鼠40只，雌雄各半，每只小鼠按照3.2g/kg（体重）的剂量给予马齿苋多糖（相当于生药160g/kg），每天给药3次，连续给药7天，观察小鼠有无急性毒性反应。观察结果显示，在腹腔注射给予小鼠相当于人体用药剂量80倍的马齿苋多糖时，未见小鼠死亡，未测得LD₅₀。表明腹腔注射相当于人体用药剂量80倍的马齿苋多糖时未出现急性毒性反应。

因此，马齿苋多糖具有较好的护肝作用，能够预防和治疗肝细胞脂肪变性、肝细胞坏死和肝纤维组织增生，并且安全性好，在高于人体剂量80倍时也未见急性毒性反应。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.马齿苋多糖在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：马齿苋多糖在制备预防或治疗肝细胞脂肪变性的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：马齿苋多糖在制备预防或治疗肝细胞坏死的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：马齿苋多糖在制备预防或治疗肝纤维组织增生的药物中的应用。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述马齿苋多糖采用如下方法制备：称取马齿苋，加水煎煮，离心收集上清液，然后将上清液用大孔吸附树脂D101纯化，将纯化后的上清液浓缩后用体积分数为65-80%的乙醇沉淀，再将沉淀加入相当于沉淀重量3-5倍水煮沸10-20分钟，冷却至10-30℃，然后过滤，收集过滤液，滤液用体积分数为65-85%的乙醇沉淀，收集沉淀，重复加水煮沸和乙醇沉淀步骤，最后沉淀经干燥得马齿苋多糖。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述加水煎煮为加入相当于药材重量10倍的水煎煮两次，每次2小时。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述离心为在转速为3000～4000转/分条件下离心20分钟。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述大孔吸附树脂D101纯化为将上清液加入活化的大孔吸附树脂D101柱中，然后用相当于树脂D101重量5倍的蒸馏水洗脱。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述乙醇沉淀的条件为在温度为0-8℃条件下静置12-48小时。