CN107261053A - 银杏叶复方免疫增强剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种银杏叶复方免疫增强剂，由银杏叶、黄芪、党参、白术、茯苓、砂仁和陈皮，按质量比为10:15:15:12:15:6:9的比例，配制而成。本发明对正常小鼠的血液学指标无不良影响，对健康小鼠的肝脏指数无不良影响，对免疫抑制小鼠部分血液学指标有恢复作用，对环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠体重增重率及脏器指数变化优于四君子汤，组织形态学的变化进一步佐证了本发明对肝脾的损伤具有较好的保护作用，是确实有效地利用中药增强免疫。

Description

银杏叶复方免疫增强剂

技术领域

本发明涉及一种银杏叶复方免疫增强剂。

背景技术

近年来，免疫抑制性疾病、病毒感染性疾病的发病率正逐年上升，工业环境污染、生态失衡引发的多因子、多属性、多层次代谢性疾病、慢性疾病也日渐增多。某些西药作用单一，常顾此失彼，毒副作用明显，易残留，且对于免疫抑制性疾病、病毒感染性疾病及多因子多层次的慢性病没有特异疗法。而中药是天然药，对机体可宏观调整平衡；中药配伍讲究君臣佐使，统筹兼顾，多种成分协调配合，标本兼治，毒副作用小。研究表明，许多中药及复方能明显促进机体的非特异性免疫和特异性免疫，提高机体抵抗力，而且能改善畜禽食欲，提高增重，对许多疾病有较好的防治效果。在大力提倡绿色食品的今天，中草药以其天然性、毒副作用小、不易产生耐药性等优势是抗生素和化学合成药物无法比拟的。它来源广泛，原料价格低廉，安全环保，有些甚至可人工培育，所以开发天然植物免疫增强剂以逐步代替抗生素，可达到保护环境和增进健康的目的，故天然植物性的免疫增强剂以其独特的优势而备受关注。

国内外都纷纷研究开发各种植物性免疫增强剂。目前对植物药研究较多的国家除了中国，主要有美国、日本、德国、俄罗斯、法国等国。各国开发利用的资源主要有猫爪草、锯叶棕、银杏、银杏叶、狭叶紫锥菊、人参、大蒜、月见草油和侧柏叶靛蓝等。中国使用中草药历史悠久，而且我国草药资源丰富，与国外单一制剂不同，我国主要是复方中草药制剂。在这样的环境下，中国传统的中药免疫增强剂以其高效性、安全性、稳定性以及成本的低廉而成为国内外科研工作者注意的焦点。

银杏(Ginkgo biloba，J．)是世界上最古老的孑遗植物，为我国特有树种，资源丰富，拥有量占世界总量的70％以上。中国银杏叶产品开发创新还十分滞后，银杏叶提取物的开发仍然上不了规模。目前，我国银杏叶提取物在保健品、饮料、化妆品、饲料等领域的开发刚刚起步，可以算是一片空白。如果在这些领域充分开发，显然会进一步带动银杏叶提取物的发展，提高银杏叶提取物的总体经济效益。银杏叶的食用安全性较高，目前临床上银杏叶制剂和复方银杏叶制剂多用于治疗心血管疾病，有关银杏叶及其复方制剂对畜禽疾病防治的报道，不仅十分少见，并且只停留在单方制剂（银杏叶提取物）这个小范围内探讨，还很缺乏在银杏叶复方制剂这方面的深入研究。复方中药是单味药物治病的进一步发展，既能发挥单味药的特长，又能弥补单味药的不足，更能增强效力。

机体的免疫系统，不仅能抵御外来细菌、病毒和其他有害物质的侵袭，还能清除体内衰老、突变、恶化或死亡的细胞，保卫机体的健康。古方四君子汤临床上运用相当广泛，是补气健脾的重要方剂之一。临床研究表明，四君子汤对正常小鼠有促进细胞免疫、抑制体液免疫作用，表现在升高淋巴细胞转化率，降低血清凝集素和溶血素，能对抗D一半乳糖诱导小鼠淋巴细胞转化及红细胞免疫吸附能力低下，增强淋巴细胞转化及红细胞的免疫吸附能力。 温庆祥等证实，服用四君子汤可以预防脾虚证大鼠T细胞转化率和B细胞分泌的IgG水平降低。四君子汤能拮抗环磷酰胺的免疫抑制作用，提高机体的免疫功能。

课题组在前期研究中发现，银杏叶与黄芪、白术、党参、茯苓组成的银杏叶基础方剂对脾虚证小鼠的消化酶活性有保护作用，并能通过降低血清中MDA含量，提高 SOD和GSH-PX含量，达到清除自由基、维持膜功能稳定的作用。因此，本发明在课题组前期研究的基础上，以现代中医药理论为依据，利用银杏叶与中草药（黄芪、白术、党参、茯苓、山药、白扁豆、山楂、薏苡仁、砂仁、陈皮等）配制成三种银杏叶复方制剂，采用免疫抑制剂环磷酰胺（cy）制作免疫抑制动物模型，以四君子汤为对照，对三种银杏叶复方进行了初步的免疫学研究，从中选出一个有效的中药免疫增强剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种银杏叶复方免疫增强剂，以确实有效地利用中药增强免疫。

为了达成上述目的，本发明的银杏叶复方免疫增强剂，由银杏叶、黄芪、党参、白术、茯苓、砂仁和陈皮，按质量比为10:15:15:12:15:6:9的比例，配制而成。

其中，银杏叶粉购自长沙博键生物科技有限公司，产品标准号：Q/ADPG001-2008；其余药物均购自龙岩市第一医院，质量符合中华人民共和国兽药典标准。

上述方剂按比例配比，采用传统水煎法：蒸馏水预行浸泡2小时，加热煎煮2次，第1次保持微沸30min，滤出药液；药渣加温水再煮沸，仍保持微沸30分钟，滤出药液；合并两次滤液，小火浓缩至1g/mL（按照生药量计算）。

本发明采用饮水方式给药，每只小鼠的日饮药量（g）根据体表面积折算动物的等效剂量的2倍计算，即饮药量为1.8mL/只*天。

实验表明，本发明的银杏叶复方免疫增强剂，对正常小鼠的血液学指标无不良影响，对健康小鼠的肝脏指数无不良影响，对免疫抑制小鼠部分血液学指标有恢复作用，对环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠体重增重率及脏器指数变化优于四君子汤，组织形态学的变化进一步佐证了本发明对肝脾的损伤具有较好的保护作用。

附图说明

图1是空白组对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图2是空白组对脾（40×）的组织病理学检查结果图；

图3是空白+cy组对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图4是空白+cy组对脾（40×）的组织病理学检查结果图；

图5是四君子汤对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图6是四君子汤对脾 （40×）的组织病理学检查结果图；

图7是四君子汤+cy对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图8是四君子汤+cy对脾（40×）的组织病理学检查结果图；

图9是本发明（复方Ⅰ）对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图10是本发明对脾（40×）的组织病理学检查结果图；

图11是本发明+cy对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图12是本发明+cy对脾（40×）的组织病理学检查结果图；

图13是复方Ⅱ对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图14是复方Ⅱ对脾（40×） 的组织病理学检查结果图；

图15是复方Ⅱ+cy对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图16是复方Ⅱ+cy对脾（40×）的组织病理学检查结果图；

图17是复方Ⅲ对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图18是复方Ⅲ对脾 （40×）的组织病理学检查结果图；

图19是复方Ⅲ+cy对肝（400×）的组织病理学检查结果图；

图20是复方Ⅲ+cy对脾 （40×）的组织病理学检查结果图。

具体实施方式

1、材料和方法

1.1材料与试剂

1.1.1试验动物

试验选用30克左右的清洁级KM小鼠200只，雌性，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号2007000502350。

1.1.2试验药品

环磷酰胺cy(粉剂，0.2g/支)，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号：10030921。每支Cy用10mL生理盐水溶解，以75mg/kg的剂量进行腹腔注射。

中药的组成：

四君子汤：党参，白术，茯苓，炙甘草，质量比例为3:3:3:1；

本发明（银杏叶复方制剂Ⅰ，后面简称复方Ⅰ）：银杏叶，黄芪，党参，白术，茯苓，砂仁，陈皮，质量比例为10:15:15:12:15:6:9；

银杏叶复方制剂Ⅱ（后面简称复方Ⅱ）：银杏叶，黄芪，党参，白术，茯苓，山药，白扁豆，质量比例为10:15:15:12:12:15:10；

银杏叶复方制剂Ⅲ（后面简称复方Ⅲ）：银杏叶，黄芪，党参，白术，茯苓，山楂，薏苡仁，质量比例为10:10:15:12:12：10:15。

银杏叶粉购自长沙博键生物科技有限公司，产品标准号：Q/ADPG001-2008；其余药物均购自龙岩市第一医院，质量符合中华人民共和国兽药典标准。以上4味方剂按比例配比，采用传统水煎法：蒸馏水预行浸泡2小时，加热煎煮2次，第1次保持微沸30min，滤出药液；药渣加温水再煮沸，仍保持微沸30分钟，滤出药液；合并两次滤液，小火浓缩至1g/mL（按照生药量计算）。

1.1.3试验仪器

光学显微镜TE2000-U。

1.2试验方法

1.2.1给药方法及给药量

采用饮水方式给药，每只小鼠的日饮药量（g）根据体表面积折算动物的等效剂量的2倍计算，即饮药量为1.8mL/只*天。

1.2.2动物分组

将200只小鼠随机分成10组，每组4个重复，每个重复5只。1～5组用于研究3个银杏叶复方制剂对正常小鼠血液学指标、脏器指数等影响，其中组1和组2分别为空白组和四君子汤组，其余3组分别为3种银杏叶复方制剂组；6～10组用于研究中药对cy所致免疫抑制小鼠的血液学指标、脏器指数的影响，其中组6和组7分别为cy组和四君子汤＋cy组，其余3组分别为3种不同的银杏叶复方制剂＋cy组。第2-5组每晚给予相应的中药，1.8mL/只，第1组则给予等量的蒸馏水，连续15天；第7-10组小鼠给药方式及给药量同前，从饮药的第2天开始，以75mg/kg的剂量进行腹腔注射环磷酰胺，隔日1次，共注射7次，期间正常给中药至停止注射cy第2天，第6组饮服蒸馏水，腹腔注射cy。

1.3测定指标与方法

1.3.1体重增重率的测定

开始试验时，先对每1只小鼠进行空腹（禁食禁水12小时）称重；实验结束后（第15天）再对每1只小鼠进行空腹称重。

1.3.2血常规的测定

第15天对小鼠禁食禁水12小时，次日上午从每个重复组随机取5只小鼠，眼眶采血，保存于EDTA抗凝管中，暂时存放于4℃冰箱中，当日送检，检测血常规。

1.3.3肝脾指数的测定

第15天对小鼠禁食禁水12小时，次日上午对每只小鼠进行解剖，取肝脏、脾脏。肝脏、脾脏上的脂肪要完全剥离，称重。对应其体重，用此公式进行计算：脾脏指数=脾脏重量/体重；肝脏指数=肝脏重量/体重。

1.3.4切片的制作和观察

将采血后的小鼠的肝和脾用10%甲醛固定，光镜下进行组织病理学检查。

1.4数据处理

应用统计软件SPSS16.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比较，所有数据用均值±标准差表示。

2、结果与分析

2.1银杏叶复方对正常小鼠血液学指标的影响

银杏叶复方对正常小鼠血液学指标的影响见表1。结果显示，与空白组相比，3种复方对健康小鼠的血液学指标无显著影响（P＞0.05）；除了WBC，四君子汤对正常小鼠其余的血液学指标亦无显著影响（P＞0.05），说明3种复方对正常小鼠的血液学指标无不良影响，优于四君子汤。

表1 银杏叶复方对正常小鼠血液学指标的影响

注：表中同列上标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），上标不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01），上标字母相同或无上标表示差异不显著（P＞0.05）。

2.2银杏叶复方对正常小鼠体重增重率及脏器指数的影响

从表2可以看出，各组小鼠的体重增重率差异均不显著（P＞0.05）；就小鼠的脾脏指数而言，复方Ⅰ、复方Ⅱ与四君子汤组和空白组无显著差异；而对于肝脏指数，四君子汤组显著低于空白组（P＜0.05），极显著或显著低于各复方组（P＜0.01或P＜0.05），复方Ⅰ和复方Ⅲ则与空白组相比无显著差异（P＞0.05）。以上结果表明四君子汤组和3种银杏叶复方制剂对健康小鼠的体重变化和脾脏指数无不良影响，复方Ⅰ和复方Ⅲ对健康小鼠的肝脏指数无不良影响，四君子汤组能引起健康小鼠的肝脏指数发生变化。

表2 银杏叶复方对正常小鼠体重及脏器指数的影响

2.3银杏叶复方对环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠血液学指标的影响

表3 银杏叶复方对环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠血液学指标的影响

银杏叶复方对免疫抑制小鼠血液学指标的影响见表3。结果显示，3种银杏叶复方制剂+cy组的WBC极显著低于空白组（P＜0.01）；3种银杏叶复方制剂+cy组的RBC、MCH、MCV三项指标与空白组相比差异不显著（P＞0.05）；复方Ⅲ+cy组的HGB、HCT两项指标显著低于空白组（P＜0.05），复方Ⅰ+cy组、复方Ⅱ+cy组与空白组相比差异不显著（P＞0.05）；四君子汤+cy组的WBC、RBC两项指标极显著低于空白组（P＜0.01），HCT显著低于空白组（P＜0.05），MCV显著高于空白组（P＜0.05），RBC、MCH两项与空白组相比显示差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明，6项血液指标中，除WBC外，复方Ⅰ和复方Ⅱ对免疫抑制小鼠部分血液学指标有恢复作用，四君子汤组对免疫抑制小鼠的血液学指标无明显恢复作用。

2.4银杏叶复方对环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠体重增重率及脏器指数的影响

从表4可以看出，注射cy后，各组小鼠体重增重率较空白组均显著下降（P＜0.01），但 3种复方制剂中以复方Ⅰ的体重增重率最高，与四君子汤效果相当。就肝、脾指数而言，各组的肝脏指数差异不显著（P＞0.05），四君子汤组和3种复方组的脾脏指数极显著低于空白组（P＜0.01），但复方Ⅱ+cy的脾脏指数较四君子汤+cy组显著提高（P＜0.01），复方Ⅰ与四君子汤组之间差异不显著（P＞0.05）。以上结果显示复方Ⅰ和复方Ⅱ在恢复对CY所致的免疫抑制小鼠体重下降率及脏器的指数变化方面优于或与四君子汤相当。

表4银杏叶复方对环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠体重增重率及脏器指数的影响

2.5银杏叶复方对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠肝脾组织病理学的影响

经采血后的小鼠进行处死解剖取肝脏、脾脏，可明显观察到凡注射过cy的小鼠，脾脏均有不同程度的萎缩，肝脏及其他脏器未见明显肉眼可见病变。对肝和脾进行组织病理学检查可见，空白组小鼠肝细胞板完整，排列规则，细胞核大而深染，未见明显病变（见图1），脾组织中的白髓大而明显（见图2）；空白+cy组的肝细胞核浓染（核浓缩），有的细胞核已消失（见图3），红白髓界限不明显，脾小梁密集（见图4）；四君子汤组肝脏细胞个别出现核浓缩甚至核消失（见图5），脾脏白髓小（见图6）；四君子汤+cy组的肝细胞出现细胞肿胀（见图7），脾脏红白髓界限不明显，脾小梁密集（见图8）；复方Ⅰ组与复方Ⅰ+cy组小鼠肝细胞板完整，排列规则，细胞核大而深染，胞质染色均匀，肝组织未见明显病变（分别见图9、图11）；脾组织中的白髓大而明显（分别见图10、图12）。复方Ⅱ组肝细胞板完整，排列规则，细胞核大而深染，胞质染色均匀，肝组织未见明显病变（见图13），脾脏白髓界限不明显且小，脾小梁密集（见图14）；复方Ⅱ+cy组肝脏，细胞核较正常细胞核不同（核内物质附着于核膜上），局部有轻微的细胞肿胀（见图15）；脾脏白髓大但界限不明显（见图16）。复方Ⅲ组肝细胞板完整，排列规则，细胞核大而深染，胞质染色均匀，肝组织未见明显病变（见图17），脾脏白髓大小不一且界限不明显（见图18）；复方Ⅲ+cy组肝脏可见轻微的细胞肿胀（见图19）；白髓界限明显但小（见图20）。

3、讨论

3.1 药理研究的意义在于观察药物对病理过程的干预，因此首先需要造模。cy是一种细胞毒性药物，同时也属于烷化剂类免疫抑制剂，其作用主要是破坏DNA的结构，它能杀死有丝分裂和进入循环周期的细胞，具有较强的免疫抑制作用，故在免疫学研究中，常以cy作为细胞免疫、体液免疫中的免疫抑制模型的制备药物。

本试验采用cy作为免疫抑制剂，对四君子汤及3个银杏叶复方对小鼠肝脾指数、体重增重率、血细胞变化情况进行了研究。研究显示3种银杏叶复方对正常小鼠的血液学指标无不良影响，优于四君子汤；四君子汤和3种银杏叶复方制剂对健康小鼠的体重变化和脾脏指数没有不良影响，复方Ⅰ和复方Ⅲ对健康小鼠的肝脏指数没有不良影响，四君子汤组能引起健康小鼠的肝脏指数发生变化；复方Ⅰ和复方Ⅱ对免疫抑制小鼠部分血液学指标有恢复作用，四君子汤组对免疫抑制小鼠的血液学指标无明显恢复作用；复方Ⅰ和复方Ⅱ在恢复对cy所致的免疫抑制小鼠体重下降率及脏器的指数变化方面优于或与四君子汤相当。体重是一个直观、易考察的指标，且与多种因素密切相关，加之组织病理切片的佐证，我们认为，本试验中复方Ⅰ的免疫增强作用最好，可用于进一步的分析研究。

3.2 对采血后的小鼠进行剖检，凡注射过cy的小鼠脾脏大都有不同程度的萎缩，但肝脏及其他脏器未见明显肉眼可见病变。与空白组相比，空白组+cy的肝脏指数与之差异不显著，脾脏指数差异极显著，数值上显示空白+cy组小鼠脾脏萎缩（切片观察显示脾小梁密集）；就四君子汤+cy组，肝脏指数与空白组差异不显著，脾脏指数极显著低于空白组（切片观察显示肝脏细胞肿胀，脾脏脾小梁密集）；复方Ⅰ+cy组与空白组比较，肝脏指数之间差异显示不显著，脾脏指数之间显示差异极显著（切片观察未见明显异常）；复方Ⅱ+cy与空白组相比较，肝脏指数之间差异显示不显著，脾脏指数之间显示差异极显著（切片观察显示肝细胞出现肿胀）；复方Ⅲ+cy与空白组相比较，肝脏指数显示差异不显著，脾脏指数显示差异极显著（切片观察可见肝细胞出现肿胀，脾脏白髓小）。组织形态学的变化进一步佐证了复方Ⅰ对肝脾的损伤具有较好的保护作用。

3.3 给小鼠喂药传统的方法是灌胃，试验中小鼠会因人为操作不慎受伤，另反复捉拿刺激，造成精神状态不佳，加之药液黏稠更增加了灌胃难度。本试验参考刘翠艳等提出的饮水中加药的方法，即根据小鼠“昼伏夜出”的特点，选择晚上活动时间，在小鼠干渴状态下饮药。这种给药方式需预先摸索小鼠的全天饮水量，然后断水4h后给药，小鼠饮完药液后再及时补充足够的清水。用此方法，饮药组除了第1d需要适应药液的口味外，不会出现意外伤亡。该方法不但能减少人力和操作时间，而且可以避免应激和对消化道造成的机械性损伤。

4、结论

试验结果显示，3种银杏叶复方对正常小鼠的血液学指标无不良影响，优于四君子汤；四君子汤和3种银杏叶复方制剂对健康小鼠的体重变化和脾脏指数无不良影响，复方Ⅰ和复方Ⅲ对健康小鼠的肝脏指数没有不良影响；复方Ⅰ和复方Ⅱ对免疫抑制小鼠部分血液学指标有恢复作用；复方Ⅰ和复方Ⅱ在恢复对cy所致的免疫抑制小鼠体重下降率及脏器的指数变化方面优于或与四君子汤相当。病理组织切片显示，复方Ⅰ组与复方Ⅰ+cy组的肝脾都未见明显病变，而四君子汤组、四君子汤+cy组肝脾都有不同程度的病变，复方Ⅱ组、复方Ⅱ+cy组的脾脏都有不同程度的病变，复方Ⅲ次之。综合血液学指标变化、体重增重率、脏器指数及组织病理学变化等各项指标认为，复方Ⅰ较优，甚至优于四君子汤，可选定为后续试验的研究对象。

Claims (1)

1.银杏叶复方免疫增强剂，其特征在于：由银杏叶、黄芪、党参、白术、茯苓、砂仁和陈皮，按质量比为10:15:15:12:15:6:9的比例，配制而成。